• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    急慢性ITP患兒外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及意義

    2017-08-07 21:54:23高鳳艷郝國平
    臨床醫(yī)藥實(shí)踐 2017年7期
    關(guān)鍵詞:百分率免疫性外周血

    高鳳艷,郝國平

    (1.山西醫(yī)科大學(xué),山西 太原 030001;2.山西省兒童醫(yī)院,山西 太原 030013)

    ?

    急慢性ITP患兒外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及意義

    高鳳艷1,郝國平2*

    (1.山西醫(yī)科大學(xué),山西 太原 030001;2.山西省兒童醫(yī)院,山西 太原 030013)

    目的:檢測急性原發(fā)性免疫性血小板減少癥(AITP)、慢性原發(fā)性免疫性血小板減少癥(CITP)患兒外周血CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)、白介素-10(IL-10)的變化,探討三者在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用。方法:流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分別檢測35 例AITP、31 例CITP患兒及20 例健康對照兒童外周血Treg細(xì)胞百分率及血清IL-10含量,酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測血清中TGF-β1含量,進(jìn)行比較及相關(guān)性分析。結(jié)果:急性組Treg細(xì)胞百分率(4.23±0.82)%顯著低于對照組的(5.05±0.90)%(P<0.01);慢性組Treg細(xì)胞百分率(3.47±0.63)%顯著低于急性組的(4.23±0.82)%(P<0.01)。急性組TGF-β1水平(189.36±66.71) pg/mL低于對照組的(231.45±113.89) pg/mL(P<0.05),急性組IL-10含量(34.07±11.57) pg/mL低于對照組的(43.83±10.96) pg/mL(P<0.05)。TGF-β1水平及IL-10含量慢性組低于急性組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。ITP患兒外周血Treg細(xì)胞百分率與TGF-β1含量呈正相關(guān)(r=0.75,P<0.01)。ITP患兒外周血IL-10含量與Treg細(xì)胞百分率、TGFβ1含量則無相關(guān)性。結(jié)論:ITP患兒Treg細(xì)胞減少及相關(guān)細(xì)胞因子含量降低可能與ITP的細(xì)胞免疫紊亂有關(guān),免疫紊亂在慢性組尤其明顯,這可能也是慢性患兒治療效果不佳,呈現(xiàn)長病程的原因之一。

    血小板減少癥;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;轉(zhuǎn)化生長因子β1;白介素10;流式細(xì)胞術(shù)

    原發(fā)性免疫性血小板減少癥(ITP)是一種兒童中常見的良性出血性疾病,以免疫紊亂介導(dǎo)的血小板減少為特征。近年越來越多學(xué)者關(guān)注細(xì)胞免疫異常在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用。該研究檢測ITP患兒外周血中CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)百分率及其相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)與白介素-10(IL-10)含量,進(jìn)一步驗(yàn)證并分析Treg細(xì)胞、TGF-β1及IL-10與ITP發(fā)病的關(guān)系及可能機(jī)制。同時對ITP患兒急性者與慢性者外周血中Treg細(xì)胞百分率、TGF-β1及IL-10變化進(jìn)行比較,綜合分析三者在疾病不同狀態(tài)的數(shù)量變化及其意義。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選取2015年1月—2016年6月山西省兒童醫(yī)院血液科住院和門診治療的ITP患兒66 例,均符合ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。將初診的未使用人免疫球蛋白及糖皮質(zhì)激素治療的ITP患兒納入急性原發(fā)性免疫性血小板減少癥(AITP)組,共35 例,男20 例,女15 例,年齡0.5~10 歲,中位年齡5.5 歲;將病程大于12 個月的ITP患兒納入慢性原發(fā)性免疫性血小板減少癥(CITP)組,共31 例,男17 例,女14 例,年齡3~12 歲,中位年齡7.5 歲,均符合CITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[1];正常對照組來自山西省兒童醫(yī)院2016年1月—3月體檢中心健康體檢者20 例,男7 例,女13 例,年齡3~10 歲,中位年齡6.5 歲。所有受試者均取得患兒家長的知情同意,并簽署知情同意書。

    排除標(biāo)準(zhǔn):長期口服抗癲癇藥所致血小板減少患兒;系統(tǒng)性紅斑狼瘡及其他自身免疫性疾病患兒;嚴(yán)重心肺腹及神經(jīng)系統(tǒng)疾病患兒。

    1.2 試劑和儀器

    鼠抗人CD4-FITC單克隆抗體、CD25-PE單抗、CD127-APC單抗及同型對照IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC及人血清白介素10(IL-10)均為貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品;酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑TGF-β1購自博士德生物公司。流式細(xì)胞儀為貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品(型號:FC 500)。

    1.3 試驗(yàn)步驟

    1.3.1 外周血CD4+CD25+CD127-Treg百分率檢測

    取患兒治療前EDTA抗凝血100 μL,依次加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE的單抗各20 μL及CD127-APC單抗5 μL,對照組加入IgG1-FITC,IgG1-PE各20 μL及IgG1-APC 5 μL,分別混勻后避光孵育25~30 min,加入紅細(xì)胞裂解液2 mL,室溫避光孵育10 min,液體澄清透明后,1 500 r/min離心5 min,棄去上清液,再加入2 mLPBS洗滌液混勻,同法離心棄上清,細(xì)胞則懸浮于0.5 mL PBS中,混勻后上機(jī)檢測。

    1.3.2 外周血TGF-β1含量檢測

    收集外周全血2 mL(采血管為黃色,即含有分離膠和促凝劑),3 000 r/min離心5 min,取上清凍存于-70 ℃,用ELISA方法測TGF-β1含量(具體實(shí)驗(yàn)過程詳見說明書)。

    1.3.3 外周血IL-10含量檢測

    收集外周全血2 mL,3 000 r/min離心5 min,取上清凍存于-70 ℃,用流式細(xì)胞術(shù)測IL-10含量。(IL-10的檢測是偏向于ELISA的流式細(xì)胞術(shù))。

    1.3.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

    流式高通量多因子檢測技術(shù)(AimPlex)是依據(jù)一系列熒光強(qiáng)度不同的微球包被有特異性捕獲抗體,與待測樣本孵育后,加入檢測抗體。流式細(xì)胞儀檢測熒光,從而實(shí)現(xiàn)對蛋白抗原的檢測;結(jié)合抗原標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線,可實(shí)現(xiàn)對蛋白抗原的定量檢測。

    1.3.3.2 標(biāo)本的采集

    取患兒治療前外周全血1 mL,室溫凝固30 min后,離心1 000×9 15 min,收集血清凍存于-70 ℃。

    1.3.3.3 準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品:

    取一8聯(lián)管,標(biāo)記1~8號,把標(biāo)準(zhǔn)品用2 000×9離心10 s,再加樣品稀釋液250 μL,充分混勻并冰浴5 min,8號管中加入標(biāo)準(zhǔn)品原液60 μL,1~8號管中加入樣品稀釋液120 μL,充分混勻,1號管中加入樣品稀釋液60 μL,從8號管開始依次取管液60 μL到上一管,直到2號管,則完成梯度稀釋。

    1.3.3.4 操作步驟

    第一,取混合微球加入各孔45 μL,把孔內(nèi)液體用抽濾器抽掉。第二,取標(biāo)準(zhǔn)品加入各孔45 μL,蓋上封板膜,室溫避光振蕩60 min,把孔內(nèi)液體用抽濾器抽掉。第三,取洗滌緩沖液加入各孔100 μL,浸泡約1 min后棄液,拍干,共重復(fù)3 次。第四,取生物素標(biāo)記的檢測抗體工作液加入各孔25 μL,蓋上封板膜,室溫避光振蕩30 min。第五,同第三。第六,取用鏈霉親和素標(biāo)記的PE工作液加入各孔25 μL,蓋上封板膜,室溫避光振蕩20 min。第七,同第三。第八,取讀數(shù)緩沖液加入各孔150 μL,備用。第九,取洗滌緩沖液400 μL加入剩余微球中,充分混勻后倒入流式管,上流式細(xì)胞儀調(diào)整射門。第十,各孔內(nèi)液體需充分吹吸,懸浮微球后轉(zhuǎn)入流式管,上流式細(xì)胞儀測定。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    2 結(jié) 果

    2.1 AITP組、CITP組、對照組Treg細(xì)胞百分率、TGF-β1、IL-10檢測結(jié)果比較

    AITP組Treg細(xì)胞百分率明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),TGF-β1含量低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),IL-10含量低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),CITP組Treg細(xì)胞百分率明顯低于AITP組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),TGF-β1含量低于AITP組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),IL-10含量低于AITP組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

    表1 三組Treg細(xì)胞百分率、TGF-β1、 IL-10檢測結(jié)果比較

    2.2 Treg細(xì)胞百分率、TGF-β1、IL-10三者相關(guān)性分析

    ITP患兒外周血Treg細(xì)胞百分率與TGF-β1含量呈正相關(guān)(r=0.75,P<0.01);ITP患兒外周血IL-10含量與Treg細(xì)胞百分率、TGF-β1含量則無相關(guān)性。

    3 討 論

    ITP是一種以血小板抗體產(chǎn)生為特征的自身免疫性出血性疾病,抗體也許通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)導(dǎo)致血小板的破壞[2]。Seddiki等[3]研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞活化后高表達(dá)CD127,而真正的Treg則低表達(dá)CD127(CD4+CD25+CD127dim),所以CD127可以幫助區(qū)別Treg與活化的T細(xì)胞。王會平等[4]也認(rèn)為CD4+CD25+CD127low標(biāo)記可以識別理想的Treg細(xì)胞,且并不影響T細(xì)胞活性。本研究采用CD4+CD25+CD127-三標(biāo)記法進(jìn)行檢測Treg細(xì)胞百分率,可以提高真正Treg細(xì)胞的檢出率。

    CD4+CD25+Treg來源于胸腺,在調(diào)節(jié)多種疾病的免疫反應(yīng)中起到重要作用,如過敏性疾病、惡性腫瘤、感染、自身免疫紊亂等方面[5]。Treg的數(shù)量和功能的異常在ITP發(fā)病中起到了一定的作用[6-7]。更有學(xué)者認(rèn)為Treg數(shù)量減低打破了自身耐受,Treg將成為未來ITP治療的依據(jù),并且可能在兒童慢性ITP的自然病程和長期結(jié)局的鑒別中成為診斷性指標(biāo)[8]。研究Treg細(xì)胞在ITP患者免疫調(diào)節(jié)功能紊亂發(fā)病機(jī)制中的作用有重要意義。本研究顯示急性組CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞百分率較對照組明顯減低,慢性組較急性組明顯減低,表明Treg細(xì)胞數(shù)量減少可能與ITP的發(fā)生及疾病呈現(xiàn)慢性發(fā)展有關(guān),可能與ITP患者體內(nèi)存在的免疫調(diào)節(jié)功能紊亂有關(guān),慢性ITP患兒則存在更嚴(yán)重的免疫紊亂。TGF-β是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì),在組織損傷修復(fù)、組織細(xì)胞增殖分化、間質(zhì)形成等方面起重要作用[9]。TGF-β作為機(jī)體重要的顆粒蛋白,其在免疫調(diào)節(jié)中的重要性也逐步被認(rèn)識。IL-10是公認(rèn)的執(zhí)行免疫抑制功能的細(xì)胞因子,可被多種細(xì)胞分泌[10]。本研究顯示ITP患兒外周血中Treg數(shù)量減少,TGF-β1、IL-10含量明顯降低,且Treg百分率與TGF-β1含量呈正相關(guān),Treg百分率與IL-10含量無相關(guān)性。Treg被激活后通過細(xì)胞相互接觸和(或)分泌IL-10、TGF-β、IL-4等細(xì)胞因子發(fā)揮作用[11-12]。用相應(yīng)抗體中和此類細(xì)胞因子則其體內(nèi)免疫抑制作用降低,說明這些抑制性細(xì)胞因子可以輔助Treg細(xì)胞功能的實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Meloy等[13]的結(jié)論一致。IL-10、TGF-β在Treg細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖及介導(dǎo)免疫耐受中發(fā)揮重要作用,主要通過其可抑制抗原遞呈細(xì)胞及拮抗效應(yīng)T細(xì)胞的功能來實(shí)現(xiàn)[14-15]。Treg百分率與IL-10含量無相關(guān)性,可能與多種細(xì)胞均可分泌IL-10有關(guān)。

    本研究表明Treg細(xì)胞數(shù)量減少或功能障礙及其相關(guān)細(xì)胞因子含量降低可能與ITP患者體內(nèi)存在的免疫調(diào)節(jié)功能紊亂有關(guān),而慢性組中免疫功能的改變表現(xiàn)更為明顯,這可能也是慢性患兒治療效果不佳呈現(xiàn)長病程的原因之一。

    [1]中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會血液學(xué)組《中華兒科雜志》編輯委員會.兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥診療建議[J].中華兒科雜志,2013,51(5):382-384.

    [2]ARANDI N,MIRSHAFIEY A,JEDDI-TEHRANI M,et al.Alteration in frequency and function of CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells in patients with immune thrombocytopenic purpura[J].Iran J Allergy Asthma Immunol,2014,13(2):85-92.

    [3]SEDDIKI N,SANTNER-NANAN B,MARTINSON J,et al.Expression of interleukin(IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and αctivated T cell[J].EXP Med,2006,203(7):1693-1700.

    [4]王會平,翟志敏,張愛梅,等.CD4+CD25+CD127low識別人外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的優(yōu)勢[J].中國免疫學(xué)雜志,2008,24(12):1059-1062.

    [5]ZHANG P,LIU H Y,LIU X Y,et al.Role of treg cells in pathogensis of mouse ITP[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2016,24(3):784-787.

    [6]DASGUPTA A,SAXENA R.Regulatory T cells:a review[J].Natl Med J India,2012,25(6):341-351.

    [7]ZAHRAN A M,ELSAYH K I.CD4+CD25+High FoxP3+ regulatory T cells,B lymphocytes,and T lymphocytes in patients with acute ITP in assiut children Hospital[J].Clin Appl Thromb Hemost,2014,20(1):61-67.

    [8]SON B R,KIM J Y.Association of CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells with natural course of childhood chronic immune thrombocytopenic purpura[J].Korean J Pediatr,2015,58(5):178-182.

    [9]CHAIKUAD A,BULLOCK A N.Structural Basis of Intracellular TGF-β Signaling:receptors and Smads[J].Cold Spring Harb Perspect Bio,2016,8(11):a022 111.

    [10]CASALS-PASCUAL C,KAIO,NEWTON C R,et al.Thrombocytopenia in falciparum malaria is associated with high concentrations of IL-10[J].Am J Trop Med Hyg,2006,75(3):434-436.

    [11]MA L,LIANG Y,F(xiàn)ANG M,et al.The cytokines (IFN-gamma,IL-2,IL-4,IL-10,IL-17) and Treg cytokine (TGF-beta1) levels in adults with immune thrombocytopenia[J].Pharmazie,2014,69(9):694-697.

    [13]MALOY K J,SALAUN L,CAHILL R,et al.CD4+CD25+T(R) cells suppress innate immune pathology through cytokine-dependent mechanisms[J].J Exp Med,2003,197(1):111-119.

    [14]HUA F,JI L,ZHAN Y,et al.Aberrant frequency of IL-10-producing B cells and its association with Treg/Th17 in adult primary immune thrombocytopenia patients[J].Biomed Res Int,2014,2014:571302.

    [15]ZHANG A,F(xiàn)U J,NING B,et al.Tolerogenic dendritic cells generated with IL-10/TGFβ1relieve immune thrombocytopenia in mice[J].Thromb Res,2013,132(1):63-68.

    ExpressionandsignificanceofregulatoryTcellsandtheirrelatedcytokinesinperipheralbloodofchildrenwithacuteandchronicprimaryimmunethrombocytopenia

    GAO Fenyan1,HAO Guoping2

    (1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.The Children′s Hospital of Shanxi,Taiyuan 030012,China)

    Objective:To detect the proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell,transforming growth factor β1(TGF-β1),interleukin 10(IL-10) in children peripheral blood in acute primary immune thrombocytopenia(AITP) and chronic primary immune thrombocytopenia(CITP),and to explore their role in the pathogenesis in primary immune thrombocytopenia (ITP).Methods:The proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and the content of IL-10 were detected by flow cytometry(FCM) in peripheral blood in AITP children of 35 cases,CITP children of 31cases and healthy children of 20 cases in control group.The content of TGF-β1was analyzed by ELISA.To compare the proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and their related cytokines in the three groups and to analyze the relationships between them.Results:The proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell in acute group(4.23±0.82)% was significantly lower than that in control group(5.05±0.90)%(P<0.01),the proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell in chronic group (3.47±0.63)% was significantly lower than that in acute group(4.23±0.82)%(P<0.01).The amount of TGF-β1in acute group(189.36±66.71) pg/mL was significantly lower than that in control group(231.45±113.89)pg/mL(P<0.05).The amount of IL-10 in acute group (34.07±11.57) pg/mL was significantly lower than that in control group(43.83±10.96) pg/mL(P<0.05),the amount of TGF-β1and IL-10 in chronic group were significantly lower than that in acute group(P<0.01).There were psitive correlations between proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and TGF-β1in peripheral blood in ITP children(r=0.75,P<0.01).The content of IL-10 had no correlation with proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and TGF-β1in peripheral blood in ITP children.Conclution:The decrease of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and related cytokines in peripheral blood in ITP may be connected with cellular immumune disorder of ITP,the immumune disorder in chronic group was obvious,and it may be one reason of why the children of CITP with poor therapeutic effects and long course.

    Thrombopenia;regulation T cell;transforming growth factor β1;interleukin 10;flow cytometry

    1671-8631(2017)07-0493-05

    *本文通訊作者:郝國平

    R725.5

    :A

    2016-11-11

    (本文編輯:張榮梅)

    高鳳艷(1991— ),女,山西省呂梁市人,在讀碩士,主要從事小兒血液科工作。

    猜你喜歡
    百分率免疫性外周血
    簡圖法理解標(biāo)記有絲分裂百分率法測定細(xì)胞周期時間
    從扶正祛邪法探討免疫性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的防治
    胸腺瘤與自身免疫性疾病的研究進(jìn)展
    Atg5和Atg7在自身免疫性疾病中的研究進(jìn)展
    白血病外周血體外診斷技術(shù)及產(chǎn)品
    基于距平百分率的萬源市氣象干旱灰色預(yù)測
    結(jié)腸炎小鼠外周血和結(jié)腸上皮組織中Gal-9的表達(dá)
    慢性蕁麻疹患者外周血IL-17和IL-23的表達(dá)及臨床意義
    2型糖尿病患者外周血中hsa-miR-29b的表達(dá)及臨床意義
    Fas FasL 在免疫性血小板減少癥發(fā)病機(jī)制中的作用
    日本一本二区三区精品| 久久久久久久久大av| 91狼人影院| 天堂网av新在线| 高清欧美精品videossex| 日韩制服骚丝袜av| 欧美区成人在线视频| 国产淫语在线视频| 又爽又黄无遮挡网站| 搡老妇女老女人老熟妇| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 成人亚洲精品一区在线观看 | 亚洲美女搞黄在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 777米奇影视久久| 日韩精品青青久久久久久| 最近中文字幕2019免费版| 少妇的逼水好多| 日日啪夜夜爽| 国产精品一二三区在线看| 精品久久久久久久末码| 国产综合精华液| 美女主播在线视频| 大陆偷拍与自拍| 中文字幕久久专区| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久久九九精品影院| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品福利在线免费观看| 大香蕉久久网| 乱码一卡2卡4卡精品| 天堂俺去俺来也www色官网 | 日本一二三区视频观看| 成人特级av手机在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 免费av观看视频| 亚洲图色成人| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产亚洲91精品色在线| www.色视频.com| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 一级爰片在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 国产综合精华液| 一级毛片 在线播放| 久久热精品热| 午夜视频国产福利| 久久久久久久久久久丰满| 51国产日韩欧美| 欧美激情在线99| 偷拍熟女少妇极品色| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 黄色配什么色好看| 三级经典国产精品| 高清毛片免费看| 婷婷色综合www| 内地一区二区视频在线| 简卡轻食公司| 在线观看免费高清a一片| 亚洲内射少妇av| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产永久视频网站| 免费av不卡在线播放| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美成人午夜免费资源| 精品人妻熟女av久视频| 禁无遮挡网站| 国产精品精品国产色婷婷| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产三级在线视频| 我的老师免费观看完整版| 久久久久久久久久久免费av| 搞女人的毛片| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 老女人水多毛片| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 又黄又爽又刺激的免费视频.| av线在线观看网站| 久久久久精品性色| 两个人视频免费观看高清| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 精品午夜福利在线看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 男的添女的下面高潮视频| 一个人看的www免费观看视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 99久久人妻综合| 国产单亲对白刺激| 99热全是精品| 亚洲四区av| 一二三四中文在线观看免费高清| 九色成人免费人妻av| 少妇丰满av| 99视频精品全部免费 在线| 搞女人的毛片| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲欧美成人精品一区二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产v大片淫在线免费观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 好男人视频免费观看在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 激情 狠狠 欧美| 精品午夜福利在线看| 99热网站在线观看| 美女主播在线视频| 国产精品av视频在线免费观看| 老司机影院毛片| 亚洲欧美日韩东京热| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 精品久久久噜噜| 午夜免费观看性视频| 免费少妇av软件| 高清毛片免费看| 极品教师在线视频| 久久久久性生活片| 水蜜桃什么品种好| 国产人妻一区二区三区在| 最近手机中文字幕大全| 91久久精品国产一区二区成人| 舔av片在线| 亚洲国产欧美人成| av在线亚洲专区| 国产成人精品一,二区| 免费黄网站久久成人精品| 色视频www国产| 九九爱精品视频在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品久久久久久久久免| 超碰97精品在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 又爽又黄无遮挡网站| 如何舔出高潮| av黄色大香蕉| 日韩视频在线欧美| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 内射极品少妇av片p| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 天天一区二区日本电影三级| 真实男女啪啪啪动态图| 18+在线观看网站| 高清午夜精品一区二区三区| 又大又黄又爽视频免费| av在线播放精品| 国产乱来视频区| 久久亚洲国产成人精品v| 国产爱豆传媒在线观看| 热99在线观看视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲精品第二区| 亚洲国产精品国产精品| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久久久久久久久成人| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 91狼人影院| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产午夜福利久久久久久| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 麻豆av噜噜一区二区三区| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩一区二区三区影片| 91aial.com中文字幕在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 嫩草影院精品99| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲精品一二三| 麻豆久久精品国产亚洲av| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲欧洲日产国产| 大片免费播放器 马上看| 色播亚洲综合网| 亚洲人与动物交配视频| 国产单亲对白刺激| 亚洲在线自拍视频| 午夜视频国产福利| 精品国产露脸久久av麻豆 | 全区人妻精品视频| ponron亚洲| 亚洲精品,欧美精品| 只有这里有精品99| 日本午夜av视频| 日本午夜av视频| 亚洲国产精品专区欧美| 色吧在线观看| 久久久国产一区二区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲怡红院男人天堂| 久久99热这里只有精品18| 欧美xxⅹ黑人| 中文天堂在线官网| 亚洲av国产av综合av卡| av在线观看视频网站免费| 久久99蜜桃精品久久| 国产一区二区三区av在线| 91av网一区二区| 精品国产三级普通话版| av免费在线看不卡| 国产黄a三级三级三级人| 国产高清国产精品国产三级 | 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲精品国产av蜜桃| 中文在线观看免费www的网站| 国产激情偷乱视频一区二区| 十八禁网站网址无遮挡 | 精品久久久噜噜| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲最大成人中文| 最近中文字幕2019免费版| 两个人的视频大全免费| 亚洲精品亚洲一区二区| 看非洲黑人一级黄片| 久久久久久久久大av| 久久久久久久午夜电影| 卡戴珊不雅视频在线播放| 好男人在线观看高清免费视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 91精品国产九色| 十八禁国产超污无遮挡网站| 日韩欧美一区视频在线观看 | 精品久久久噜噜| 内射极品少妇av片p| 两个人的视频大全免费| 久久久久久伊人网av| 两个人视频免费观看高清| 国产片特级美女逼逼视频| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲最大成人中文| 少妇人妻一区二区三区视频| 欧美精品国产亚洲| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国内精品美女久久久久久| 两个人的视频大全免费| av国产免费在线观看| 国产精品一及| 夫妻午夜视频| 免费看美女性在线毛片视频| 毛片一级片免费看久久久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲成人一二三区av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 美女大奶头视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲av一区综合| 国产在视频线精品| 欧美 日韩 精品 国产| 国产成人精品一,二区| 亚洲,欧美,日韩| 天堂中文最新版在线下载 | www.av在线官网国产| 亚洲精品aⅴ在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 综合色av麻豆| 日韩av在线大香蕉| 秋霞在线观看毛片| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲av成人精品一二三区| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲四区av| 欧美成人午夜免费资源| 人妻一区二区av| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 男女视频在线观看网站免费| 久久人人爽人人片av| 中文字幕av在线有码专区| 1000部很黄的大片| 五月玫瑰六月丁香| 好男人视频免费观看在线| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产在线男女| h日本视频在线播放| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久成人免费电影| 国产精品女同一区二区软件| 在线 av 中文字幕| 国产91av在线免费观看| 国产伦理片在线播放av一区| 大话2 男鬼变身卡| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 我的老师免费观看完整版| 久久久成人免费电影| 在线观看美女被高潮喷水网站| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 成年女人在线观看亚洲视频 | av福利片在线观看| 亚洲精品色激情综合| 久久久久网色| 99久久人妻综合| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲伊人久久精品综合| 日本免费a在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久欧美国产精品| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲18禁久久av| 日韩亚洲欧美综合| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 99视频精品全部免费 在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 成人特级av手机在线观看| 成人av在线播放网站| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美激情久久久久久爽电影| 日本午夜av视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 一区二区三区乱码不卡18| 我要看日韩黄色一级片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲国产精品国产精品| 女人久久www免费人成看片| 久久国产乱子免费精品| 青春草亚洲视频在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产日韩欧美在线精品| 国内精品一区二区在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美zozozo另类| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久久a久久爽久久v久久| 国产黄片美女视频| 精品久久久久久久久亚洲| 国产黄色小视频在线观看| 99热6这里只有精品| 成人一区二区视频在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚州av有码| 欧美激情在线99| 亚洲精品国产av蜜桃| 边亲边吃奶的免费视频| 一级二级三级毛片免费看| 日日啪夜夜爽| 亚洲成人av在线免费| 我的女老师完整版在线观看| 国产av国产精品国产| 干丝袜人妻中文字幕| 免费大片黄手机在线观看| 黄片wwwwww| 日日摸夜夜添夜夜爱| 白带黄色成豆腐渣| 国产极品天堂在线| 听说在线观看完整版免费高清| 成人二区视频| 黄色日韩在线| 在线观看一区二区三区| 春色校园在线视频观看| 99久久人妻综合| 大话2 男鬼变身卡| 我要看日韩黄色一级片| 又爽又黄a免费视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 免费观看的影片在线观看| 中文资源天堂在线| 看非洲黑人一级黄片| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲最大成人中文| 亚洲av.av天堂| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 精品少妇黑人巨大在线播放| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品国产三级国产专区5o| 色综合色国产| 亚洲伊人久久精品综合| 97精品久久久久久久久久精品| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 2021少妇久久久久久久久久久| 搞女人的毛片| 精品国产三级普通话版| 国产淫片久久久久久久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 日日撸夜夜添| 人妻系列 视频| 国产av码专区亚洲av| 久久综合国产亚洲精品| 国产一区有黄有色的免费视频 | 日韩欧美三级三区| 免费看av在线观看网站| 日本黄大片高清| 69av精品久久久久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| av在线观看视频网站免费| 91精品伊人久久大香线蕉| 中文字幕av在线有码专区| 欧美日韩精品成人综合77777| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 国产成人freesex在线| 国产精品人妻久久久影院| 国产69精品久久久久777片| 成年版毛片免费区| 激情 狠狠 欧美| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 国产成人aa在线观看| 岛国毛片在线播放| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲av中文av极速乱| 美女内射精品一级片tv| 久久久久久久久中文| 日韩三级伦理在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 看十八女毛片水多多多| 少妇的逼好多水| 秋霞在线观看毛片| 伊人久久精品亚洲午夜| 色吧在线观看| 免费黄色在线免费观看| 看免费成人av毛片| 美女黄网站色视频| 99热全是精品| 免费无遮挡裸体视频| 五月玫瑰六月丁香| 三级国产精品片| 国产精品1区2区在线观看.| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩国内少妇激情av| 国产精品久久久久久精品电影| 乱系列少妇在线播放| 波野结衣二区三区在线| 精品午夜福利在线看| 国产亚洲一区二区精品| 欧美最新免费一区二区三区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 欧美xxⅹ黑人| 综合色丁香网| 天堂影院成人在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 久久韩国三级中文字幕| 秋霞伦理黄片| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日韩国内少妇激情av| 国产精品一及| 国产亚洲一区二区精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 激情 狠狠 欧美| 国产乱人偷精品视频| 亚洲精品视频女| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产午夜精品一二区理论片| 久久这里只有精品中国| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产毛片a区久久久久| 777米奇影视久久| 国产v大片淫在线免费观看| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品久久久久久久电影| 中国国产av一级| 天堂影院成人在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 成人无遮挡网站| 免费看不卡的av| 日韩大片免费观看网站| 亚洲成人一二三区av| 国产永久视频网站| 精品一区二区三区视频在线| 九九在线视频观看精品| 国产免费视频播放在线视频 | 国产 一区精品| 亚洲精品日本国产第一区| 九草在线视频观看| 床上黄色一级片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产黄色免费在线视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产伦一二天堂av在线观看| 精品午夜福利在线看| 久久久久久久国产电影| 日韩av在线免费看完整版不卡| 一级毛片我不卡| av天堂中文字幕网| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 特级一级黄色大片| 亚洲最大成人av| 久久久欧美国产精品| 一级片'在线观看视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲精品自拍成人| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲最大成人中文| 国产精品三级大全| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲真实伦在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 在线a可以看的网站| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久精品免费免费高清| 国产 亚洲一区二区三区 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 免费观看在线日韩| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 精品久久久久久电影网| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲av二区三区四区| 最近视频中文字幕2019在线8| 中文字幕久久专区| 我的女老师完整版在线观看| 99热这里只有精品一区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 免费黄色在线免费观看| 身体一侧抽搐| 久久久久九九精品影院| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日本av手机在线免费观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 中文天堂在线官网| 大片免费播放器 马上看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久久精品欧美日韩精品| 成年女人在线观看亚洲视频 | 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 午夜日本视频在线| 好男人在线观看高清免费视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美一区二区亚洲| 国产精品人妻久久久久久| 麻豆国产97在线/欧美| 黄色欧美视频在线观看| 久久久成人免费电影| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲精品成人久久久久久| 日韩一区二区三区影片| 国产精品综合久久久久久久免费| 毛片女人毛片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 能在线免费看毛片的网站| 成年版毛片免费区| 日韩av在线大香蕉| 黄色一级大片看看| 青青草视频在线视频观看| 日韩一区二区视频免费看| 国产男人的电影天堂91| 99热这里只有是精品50| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 免费看日本二区| 国产三级在线视频| 免费在线观看成人毛片| 亚洲av国产av综合av卡| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产永久视频网站| 成人性生交大片免费视频hd| 永久网站在线| 在线 av 中文字幕| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久国内精品自在自线图片| av.在线天堂| 国产精品熟女久久久久浪| 国产午夜福利久久久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲第一区二区三区不卡| 美女cb高潮喷水在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 婷婷色综合www| 亚洲电影在线观看av| 天天躁日日操中文字幕| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品久久久久久av不卡| 成年版毛片免费区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 男人狂女人下面高潮的视频| 深夜a级毛片| 中文字幕制服av| 亚洲欧洲国产日韩| 国产乱人偷精品视频| av免费在线看不卡| 国产一区有黄有色的免费视频 | 青春草国产在线视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品无大码| 国产单亲对白刺激| 亚洲av男天堂| 国产一区有黄有色的免费视频 | 性插视频无遮挡在线免费观看| 精品熟女少妇av免费看| 久久久久精品性色| 美女大奶头视频| 久久久a久久爽久久v久久| 丰满乱子伦码专区| 免费大片黄手机在线观看| 春色校园在线视频观看| 久久久久久九九精品二区国产|