窄冠白楊優(yōu)良無性系“HN-1”快繁技術(shù)體系建立

王宇攀，張靜，韓佩堯，王進茂

(河北農(nóng)業(yè)大學 林學院，河北 保定 071000)

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窄冠白楊優(yōu)良無性系“HN-1”快繁技術(shù)體系建立

王宇攀，張靜，韓佩堯，王進茂

(河北農(nóng)業(yè)大學 林學院，河北 保定 071000)

以窄冠白楊優(yōu)良無性系“HN-1”的幼嫩莖段為外植體，探索了叢生芽增殖、生根及移栽適宜條件，建立起組織快繁技術(shù)體系，研究結(jié)果表明： MS培養(yǎng)基可作為HN-1叢生芽增殖的基本培養(yǎng)基，細胞分裂素6-BA濃度為 0.3 mg/L時對叢生芽增殖的作用顯著；適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L+IAA 0.15 mg/L；適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 1.0 mg/L；培養(yǎng)條件采用正常光照生根效果最好，生根率達71.1%；適宜的移栽基質(zhì)為草炭、黃土、細沙容積比1∶1∶1，移栽苗成活率達93.8%。

窄冠白楊“HN-1”；組培快繁；增殖；生根；移栽

窄冠白楊是適合農(nóng)林間作的優(yōu)良品種。該優(yōu)良品種與農(nóng)作物間作，不但不會影響農(nóng)作物產(chǎn)量反而還會增加農(nóng)民的收入[1-3]，深受廣大農(nóng)民群眾的歡迎與信賴，具有廣闊的發(fā)展空間。但目前窄冠白楊苗木的繁殖方法主要是“一條鞭”芽接和“炮捻接”等[4]，費工費時，難以滿足當前大面積栽培的需要，嚴重限制了該優(yōu)良無性系的推廣應(yīng)用。而利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行快速育苗可在短時間內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)苗木[5-8]。目前，關(guān)于窄冠白楊的組織培養(yǎng)已有部分報道[9-10]，但主要是針對生產(chǎn)上推廣的主要品種進行的。為此，擬以河北農(nóng)業(yè)大學培育的優(yōu)良白楊雜交無性系“HN-1”為研究對象(其母本為窄冠毛白楊，父本不詳，具有樹冠窄、樹干通直、生長速度快、雄性不飛絮等優(yōu)良特性)，通過植物組織培養(yǎng)的方法對窄冠白楊 “HN-1”進行快繁技術(shù)研究，探索叢生芽增殖、生根及移栽的適宜條件，促進“HN-1”的規(guī)?；旆?，以便為工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料的采集與處理

2015年11月下旬，從河北農(nóng)業(yè)大學西校區(qū)標本園采集窄冠白楊“HN-1”1 a生枝條。將采集的材料用自來水清洗干凈后插入清水中，在人工氣候室進行室內(nèi)水培催芽，每2～3 d更換1次清水。當枝條上新抽生出的嫩芽長至5～10 cm 時，選取健壯無蟲害的單芽莖段，去葉，保留0.5 cm 長的葉柄，用自來水反復沖洗干凈。在超凈工作臺上，先用75%酒精浸泡30 s，然后用無菌水沖洗 3～4次，轉(zhuǎn)入 20%的84消毒液消毒20 min。在消毒過程中保持不斷搖晃，以使消毒充分。再用無菌水沖洗 4～5次，最后用無菌濾紙吸干殘留水分。在超凈工作臺上將單芽莖段切為0.3～0.5 cm，接種在不同誘導固體培養(yǎng)基上進行初代培養(yǎng)。

1.2試驗方法

1.2.1 基本培養(yǎng)基的篩選試驗 以MS和WPM為基本培養(yǎng)基，添加細胞分裂素6-BA 0.3 mg/L,植物生長素NAA 0.1 mg/L，蔗 糖30 g/L，瓊脂5 g/L，pH為5.8～6.2。每個處理接種20瓶，每瓶1個外植體，設(shè)置3次重復。研究不同培養(yǎng)基對窄冠白楊“HN-1”腋芽誘導的影響。

1.2.2 誘導不定芽試驗 在1.2.1篩選出來的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將無菌外植體接種到添加不同濃度細胞分裂素6-BA的MS培養(yǎng)基中，6-BA設(shè)0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L等4個梯度，各培養(yǎng)基中均附加NAA 0.1 mg/L。每梯度接種10個外植體，3次重復，30 d后統(tǒng)計腋芽的增殖率。

1.2.3 誘導叢生芽增殖的正交試驗 以MS為基本培養(yǎng)基，選取NAA、IBA和IAA 3個因素，每因素選取3個水平，因子、水平安排詳見表1。每處理均附加6-BA 0.3 mg/L，30 d后統(tǒng)計各處理的增殖系數(shù)和平均苗高。

表1 正交試驗因子與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

1.2.4 誘導生根試驗 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)定NAA 0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L;IBA 0.3 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L等3個梯度的雙因素試驗[11]。每個處理接種10瓶，設(shè)置3次重復，30 d后統(tǒng)計生根率和平均苗高。

1.2.5 黑暗預處理對組培苗生根的影響 選取健壯的莖段接種于1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 1.0 mg/L的生根培養(yǎng)基上，分別進行正常光照和暗培養(yǎng)7 d、10 d、14 d的4種處理，30 d后觀察并統(tǒng)計組培苗的生根情況。

1.2.6 煉苗移栽試驗 待上述組培苗生根根長至1.0～2.0 cm、大約3～5條根時，進行煉苗移栽。移栽基質(zhì)為草炭、蛭石、黃土、細沙,共設(shè)4個煉苗基質(zhì)處理，分別為草炭+蛭石+細沙(容積比1∶1∶1)、草炭+蛭石+黃土(容積比1∶1∶1)、草炭+黃土+細沙(容積比1∶1∶1)、蛭石+黃土+細沙(容積比1∶1∶1)。設(shè)置3次重復，每重復隨機抽取30株苗木進行觀測，連續(xù)觀察30 d并統(tǒng)計苗高及移栽成活情況，篩選出最佳移栽基質(zhì)處理。

1.3 培養(yǎng)條件

組織培養(yǎng)正常光照培養(yǎng)條件：溫度(23±2)℃,光照時間為12 h/d,光照強度為2 000～3 000 lx 。

暗培養(yǎng)條件：溫度(23±2)℃，用紙箱將培養(yǎng)物罩住。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計的主要指標有：成活率為未污染且成活外植體數(shù)占接種外植體總數(shù)的百分比；增殖系數(shù)為增殖周期結(jié)束時的芽苗數(shù)與增殖周期起始時的芽苗數(shù)之比；生根率為生根苗數(shù)占培養(yǎng)總苗數(shù)的百分比；移栽成活率為成活苗數(shù)占移栽苗數(shù)的百分比。

應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)分析軟件，對試驗中的數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基的篩選

采用植物組織培養(yǎng)常用的MS和WPM為基本培養(yǎng)基，添加細胞分裂素6-BA 0.3 mg/L、植物生長素NAA 0.1 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂5 g/L，pH 為5.8～6.2，觀察窄冠白楊“HN-1”在2種培養(yǎng)基中的生長狀況。試驗結(jié)果見表2。

表2 不同培養(yǎng)基腋芽的生長狀況Table 2 The growth condition of axillary buds in different meida

由表2可知，“HN-1”在MS培養(yǎng)基中的腋芽誘導增殖率達81.7%，且腋芽萌發(fā)快，芽長1～5 cm不等；在WPM培養(yǎng)基中的腋芽誘導增殖率為70.0%，且腋芽萌發(fā)慢，芽長1～3 cm不等。可見，窄冠白楊在MS培養(yǎng)基中的腋芽誘導率最大，并且其生長狀況明顯優(yōu)于WPM培養(yǎng)基，所以窄冠白楊“HN-1”更適合在MS培養(yǎng)基中生長。

2.2 細胞分裂素對誘導不定芽增殖的影響

將無菌外植體接種至添加不同濃度梯度的細胞分裂素6-BA的MS培養(yǎng)基中，各培養(yǎng)基均附加NAA 0.1 mg/L，30 d后進行統(tǒng)計，結(jié)果見表3。

表3 不同濃度梯度6-BA對不定芽增殖的影響Table 3 Effects of different concentrations of gradient 6-BA on adventitious bud proliferation

注:顯著水平α= 0.05。

表3試驗結(jié)果表明：“HN-1”在6-BA和NAA不同濃度組合中，不定芽的增殖誘導率具有顯著性差異。窄冠白楊“HN-1”在A2即6-BA 0.3 mg/L、NAA 0.1 mg/L 中，增殖誘導率最高，達83.3%，且腋芽萌發(fā)快；當6-BA濃度增大至0.5 mg/L時，不定芽的增殖系數(shù)隨之降低并伴有玻璃化現(xiàn)象，且隨6-BA濃度的逐漸增大，不定芽的增殖系數(shù)隨之大幅度下降；在A4中，增殖誘導率最低，僅為51.4%，且腋芽萌發(fā)較慢，長勢脆弱。因此，適宜窄冠白楊“HN-1”增殖誘導的細胞分裂素6-BA的濃度為0.3 mg/L。

2.3 不同濃度水平植物生長素對不定芽增殖的影響

將無菌外植體接種至添加6-BA 0.3 mg/L的MS培養(yǎng)基中，采用正交試驗考查NAA、IBA和IAA等3個因素對窄冠白楊“HN-1”不定芽增殖誘導的影響，統(tǒng)計結(jié)果詳見圖1—圖3。

圖1 不同濃度梯度IBA對增殖系數(shù)和平均苗高的影響
Fig.1 Effects of different concentrations of IBA on the proliferation coefficient and average seedling height

由圖1可知，不同濃度梯度IBA對增殖系數(shù)和平均苗高的影響差異顯著。當IBA濃度為0.1 mg/L時，苗木的增殖系數(shù)最大，達7.28，顯著高于其他2個處理，并且隨IBA濃度的增大，苗木的增殖系數(shù)逐漸降低；當IBA濃度為0.5 mg/L時，苗木的增殖系數(shù)最低，僅為4.72。就平均苗高這一指標而言，IBA濃度為0.1 mg/L時，苗木平均高的值最大，達2.34 cm，并且隨IBA濃度的增大，苗木平均高的值逐漸縮??；當IBA濃度為0.5 mg/L時，苗木平均高的值最小，僅為0.98 cm；3個處理間差異顯著。所以，綜合考慮2個指標，對于單個因素IBA來說，當IBA濃度為0.1 mg/L時，苗木的增殖系數(shù)和平均苗高這2個指標都達到最佳水平。

圖2 不同濃度梯度NAA對增殖系數(shù)和平均苗高的影響
Fig.2 Effects of different concentrations of NAA on the proliferation coefficient and average seedling height

由圖2可知，不同濃度梯度NAA對“HN-1”苗木平均高的影響具有顯著性差異。當NAA濃度為0.1 mg/L時，苗木平均高的值顯著高于其他水平的值，達2.3 cm；當NAA濃度為0.3 mg/L時，苗木平均高的值最小，僅為1.17 cm；3個處理間差異顯著。就增殖系數(shù)這一指標而言，當NAA濃度為0.1 mg/L時，苗木的增殖系數(shù)最大，達6.52；當NAA濃度為0 mg/L時，苗木的增殖系數(shù)最小，僅為5.17；但3個處理間差異不顯著。由此可見，綜合考慮這2個指標，對于單個因素NAA來說，當NAA濃度為0.1 mg/L時，苗木的增殖系數(shù)和平均苗高這2個指標均達到最佳水平。

圖3 不同濃度梯度IAA對增殖系數(shù)和平均苗高的影響
Fig.3 Effects of different concentrations of IAA on the proliferation coefficient and average seedling height

由圖3可知：不同濃度梯度IAA對“HN-1”苗木平均高的影響具有顯著性差異。當IAA濃度為0.15 mg/L時，苗木平均高的值高于其他水平的值，達2.37 cm，且與0.30 mg/L處理差異顯著；當IAA濃度為0.30 mg/L時，苗木平均高的值最小，僅為0.88 cm；顯著低于其他2個處理。就增殖系數(shù)這一指標而言，當IAA濃度為0 mg/L時，苗木的增殖系數(shù)最大，達6.19，但苗木平均高的值略低于IAA濃度為0.15時苗木平均高的值；當IAA濃度為0.30 mg/L時，苗木的增殖系數(shù)最小，僅為4.88；但3個處理間差異不顯著。所以，綜合考慮這2個指標，建立高效快速繁殖體系，既需要苗木快速擴繁，又要注重苗木的高生長量，所以IAA濃度為0.15 mg/L時，更利于組培苗的增殖擴繁。

綜上所述，3因素的最優(yōu)水平為：IBA濃度(0.1 mg/L)，IAA濃度(0.15 mg/L),NAA濃度(0.1 mg/L)。最佳植物生長素配比為以上3個最優(yōu)水平的組合，而最佳組合恰好出現(xiàn)在9個試驗處理中。所以，適宜窄冠白楊“HN-1”增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IAA 0.15 mg/L。

2.4 不同濃度NAA、IBA對生根誘導的影響

選取生長健壯的組培苗接種至添加不同濃度梯度的NAA和IBA的1/2MS培養(yǎng)基中，進行生根誘導。統(tǒng)計結(jié)果見表4。

注:顯著水平α= 0.05。

由表4可見，不同濃度配比的NAA、IBA對窄冠白楊的生根效果影響差異顯著?！癏N-1”在C3組合中，生根率最高，達72.00%，顯著高于除C2以外的各處理；平均生根條數(shù)最多，達8.73條，顯著高于其他處理；平均苗高達5.93 cm。在C5組合中，生根率最低，僅為31.67%，平均生根數(shù)為6.10條，苗高達5.63 cm。一般而言,生根數(shù)量越多的植株其苗的質(zhì)量越好,移栽成活率也越高。因此，C3更適宜窄冠白楊“HN-1”組培苗的生根，其生根率達72.00%，每棵組培苗的平均根數(shù)為8.73條。

2.5 黑暗預處理對組培苗生根的影響

選取健壯的莖段接種于1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 1.0 mg/L生根培養(yǎng)基中，分別進行正常光照與暗培養(yǎng)7 d、10 d、14 d后轉(zhuǎn)入正常光照下的培養(yǎng)基處理，30 d后進行統(tǒng)計，結(jié)果詳見圖4。

圖4 暗培養(yǎng)對組培苗生根的影響Fig.4 Effects of dark treatments on rooting

從圖4中可以明顯看出，在正常光照下，組培苗的生根率高達71.1%，顯著高于黑暗處理的組培苗；且根的生長狀態(tài)分布均勻，幼苗葉片大，長勢健壯。但進行了黑暗處理的組培苗反而生根率降低，且隨暗處理時間的延長，生根率逐漸降低；幼苗的長勢也較弱，經(jīng)過較長時間才偶有生根現(xiàn)象。因此，窄冠白楊“HN-1”組培苗生根的適宜培養(yǎng)條件為正常光照條件下培養(yǎng)。

2.6 溫室煉苗移栽

組培苗移栽前要經(jīng)過一定時期的煉苗:將生根組培苗進行強光鍛煉，即在自然光下鍛煉, 強光每天不少于4 h[12], 鍛煉2 d左右, 溫度不超過35℃。然后，打開組培容器的封口材料，適應(yīng)1～2 d。

移栽時，先將基質(zhì)用自來水噴濕混勻，對于窄冠白楊“HN-1”溫室煉苗移栽基質(zhì)篩選的具體指示見表5。用鑷子將組培苗從培養(yǎng)基中取出，洗凈根系粘附的培養(yǎng)基, 使根系盡可能舒展地埋入基質(zhì), 然后噴水, 保證基質(zhì)濕潤，并噴灑多菌靈抑菌，隨即覆蓋塑料薄膜。待移栽的小苗長出新根后，逐漸移去塑料薄膜置于人工氣候室培養(yǎng)，觀察并統(tǒng)計移栽苗的生長狀況。

表5 不同移栽基質(zhì)對組培苗生長狀況的影響Table 5 Effects of different transplanting substrates on the growth status of tissue culture

栽培基質(zhì)是組培苗移栽能否成功的一個重要因素,特別是基質(zhì)中水氣比例是否協(xié)調(diào),會嚴重影響試管苗移栽的成活率。從試驗結(jié)果可以看出，4種栽培基質(zhì)對窄冠白楊組培苗的移栽成活和生長的影響差異顯著?！癏N-1”在D3中移栽成活率最大，達93.8%，且平均高生長量的值最大，達3.76 cm，顯著高于其他處理;在D2中移栽成活率最低，為81.0%,在D1中苗木平均高生長量的值最小，僅為1.75 cm。所以,D3較適宜窄冠白楊“HN-1”組培苗的生長，移栽成活率高達93.8%，且苗木平均高生長量顯著高于其他組合。該配比的基質(zhì)既具備苗木生長的通風透氣性，又能夠保持苗木生長所需的養(yǎng)分，故組培苗移栽后緩苗快,移栽成活率高。

3 結(jié)論

試驗通過使用不同的基本培養(yǎng)基和不同種類與濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，初步建立了窄冠白楊“HN-1”組織培養(yǎng)快速繁殖體系,為促進窄冠白楊規(guī)?；a(chǎn)提供了理論依據(jù)。

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，更是植物組織培養(yǎng)能否成功的前提與關(guān)鍵[13]。試驗篩選出適宜窄冠白楊“HN-1”叢生芽增殖的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，以MS為基本培養(yǎng)基附加6-BA 0.3 mg/L時對叢生芽增殖的作用顯著。利用叢生芽增殖途徑進行正交試驗設(shè)計,篩選出適宜窄冠白楊“HN-1”增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IAA 0.15 mg/L。

以1/2MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度的IBA和NAA進行生根試驗，篩選出窄冠白楊“HN-1”生根的培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 1.0 mg/L。對窄冠白楊“HN-1”黑暗處理與正常光照的對比試驗表明，正常光照下的窄冠白楊生根率更高,達71.1%。

煉苗是提高苗木成活率和保障苗木質(zhì)量的重要途徑，而基質(zhì)的選用是煉苗移栽過程中一個必須的重要環(huán)節(jié)[13]。試驗結(jié)果表明，草炭、黃土、細沙容積比1∶1∶1為適宜窄冠白楊“HN-1”組培苗煉苗的最佳基質(zhì)。

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(編輯 潘秀華)

Establishment of rapid propagation technique system of narrow crown poplar ‘HN-1’

WANG Yupan, ZHANG Jing, HAN Peiyao，WANG Jinmao

(CollegeofForstry,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding071000,China)

In this paper, the young stem segments of narrow crown poplar ‘HN-1’ were used as explants, and the suitable conditions of proliferation, rooting and transplanting of clump buds were explored for establishing the technology system of tissue rapid propagation. Research results indicated: MS medium could be used as the basic medium for the proliferation of ‘HN-1’. When the concentration of cytokinin 6-BA was 0.3 mg/L, the effect of the cytokinin on the proliferation of the shoots was obvious. The optimum proliferation medium was: MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L+IAA 0.15 mg/L. The suitable rooting medium was 1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 1.0 mg/L. The culture condition was the best with the normal light, and the rooting rate was 71.1%. The suitable transplanting substrates were the combination of peat, loess, and fine sand with a ratio of 1∶1∶1(volume ratio), and the survival rate of transplanted seedlings reached 93.8%.

narrow crown poplar ‘HN-1’; tissue culture and rapid propagation; proliferation; rooting; transplanting

2017-02-20；

2017-03-21

河北省重點研發(fā)計劃項目現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新專項工程“造林樹種楊樹等新品種選育及病蟲害新型防治技術(shù)研究”(17226321D)。

王宇攀(1991-)，女，河北邯鄲人，在讀碩士研究生，從事林木遺傳育種研究。

王進茂(1969-)，男，河北深州人，博士，教授，主要從事林木遺傳育種研究。

1007 - 4961(2017)02 - 0111 - 07

10.13320/j.cnki.hjfor.2017.0021

S 792.117

A