香煙煙霧水溶液誘導(dǎo)大蒜根尖細(xì)胞產(chǎn)生微核

肖星輝，李予霞，徐 亮，王小奎，李文超，李佳馨，劉紅玲,2

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.成都師范學(xué)院，四川 成都 611130）

香煙煙霧水溶液誘導(dǎo)大蒜根尖細(xì)胞產(chǎn)生微核

肖星輝1，李予霞1，徐 亮1，王小奎1，李文超1，李佳馨1，劉紅玲1,2

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.成都師范學(xué)院，四川 成都 611130）

為了探究香煙煙霧水溶液對大蒜根尖細(xì)胞遺傳物質(zhì)的影響，通過常規(guī)的微核技術(shù)觀察了香煙煙霧水溶液不同濃度和不同時間處理下根尖細(xì)胞中微核的形態(tài)和數(shù)量。結(jié)果表明：在0.5～8支/mL的濃度范圍內(nèi)，大蒜根尖細(xì)胞的微核率隨著濃度的增加而不斷上升，差異極顯著（P＜0.01）；在12～36 h處理時間范圍內(nèi)，微核率隨著處理時間的增長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；當(dāng)處理時間為12和24 h時，微核率隨著濃度的增加而明顯上升，而當(dāng)處理時間為36 h時，微核率隨著濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢；香煙煙霧水溶液的濃度和處理時間與微核的產(chǎn)生顯著正相關(guān)，煙霧濃度對大蒜根尖細(xì)胞微核產(chǎn)生的貢獻(xiàn)更大；試驗組的細(xì)胞微核率均極顯著高于空白對照組（P＜0.01），微核指數(shù)均大于3.5，屬于重度損傷。上述結(jié)果表明，香煙煙霧水溶液在較低的濃度（0.5支/mL）和較少的處理時間（12 h）就對植物遺傳物質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。

香煙煙霧水溶液； 大蒜根尖；微核；濃度；處理時間

香煙燃燒產(chǎn)生的煙霧中含有5 000余種化學(xué)物質(zhì)，這些化學(xué)物質(zhì)既有植物煙草本身含有的，也有煙草燃燒后產(chǎn)生的[1]。由于燃燒不完全，香煙發(fā)生熱裂解和熱化合反應(yīng)會產(chǎn)生大量的致突變物、致癌物和促癌物等有害物質(zhì)。這些有害化學(xué)成分，進(jìn)入機(jī)體后可嚴(yán)重干擾其正常生理功能，繼而對生物體產(chǎn)生多方面的損害[2]。例如卷煙煙氣水溶液對斑馬魚有毒性致死影響[3]；香煙煙氣浸出物能夠使糖尿病惡化[4]；而女性長期接觸香煙煙霧，會使卵巢卵泡儲存量下降、卵巢功能減弱，致使女性生育力下降，并提早進(jìn)入更年期[5]。香煙煙霧也是引起肺癌的主要原因，目前吸煙已成為我國乃至全世界引起生物早亡和疾病的重要原因[6]。香煙煙霧危害人體健康已經(jīng)成為公認(rèn)的事實。因此，采取一定手段研究香煙煙霧水溶液對生物細(xì)胞微核遺傳物質(zhì)的影響，以更好地揭示其致病機(jī)理，是非常必要的。

微核（micronucleus，簡稱 MN）是指位于細(xì)胞漿中獨立于主核之外的小核，形狀為圓形或橢圓形，可以是整條染色體，也可以是染色體斷片，染色略淺，直徑小于主核的1/3[7-8]。細(xì)胞質(zhì)中微核主要有兩種來源：一種為誘變劑使DNA分子斷裂成DNA片段，DNA片段不能隨染色體分離被拉向兩極，形成獨立于細(xì)胞核之外的具有核形狀的微核；另一種為紡錘絲造成的整條染色體落后于核分裂周期形成微核[9]。微核產(chǎn)生的數(shù)量與誘變因子濃度呈正比，外界誘變因子越強(qiáng)，細(xì)胞的損傷程度越嚴(yán)重，因此可以用微核出現(xiàn)的頻率來評價環(huán)境誘變因子對生物遺傳物質(zhì)損傷的程度[10-12]。試驗采用常規(guī)的微核技術(shù)[13]來觀測香煙煙霧水溶液不同濃度和不同時間處理下大蒜根尖細(xì)胞中微核的形態(tài)和數(shù)量變化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大蒜（購自新疆石河子市金馬市場）、香煙（焦油量0.6 mg，煙氣一氧化碳量11 mg，甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司）。供試藥品有鹽酸、無水乙醇、冰醋酸、堿性品紅、苯酚、山梨醇、甲醛等，均為分析純。主要儀器有烘箱、光學(xué)顯微鏡等常規(guī)儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 大蒜生根 選取顆粒飽滿、無損傷、大小一致的大蒜放入培養(yǎng)皿中，倒入蒸餾水使大蒜根部沒入水中，置于25℃下培養(yǎng)48 h，待初生根長出1～2 cm，即可用來進(jìn)行下一步處理。

1.2.2 香煙煙霧水溶液的配制 （1）香煙煙霧簡易吸取器制作：挑選一個槍頭，把槍頭的細(xì)端緊密的結(jié)合到已經(jīng)去除針頭的50 mL注射器的注射口，用注射器針頭在瓶蓋上打一個小孔，恰好允許針頭穿過瓶蓋，再把與針頭相配套的針皮管與針頭相接，而皮管另一頭浸入蒸餾水中。裝置圖和實物圖如圖1所示。（2）香煙煙霧水溶液的配制：把煙頭插入槍頭的大端，點燃香煙，迅速吸取煙霧，并快速注入到密封的瓶中，每根香煙固定用50 mL注射器吸取10次（經(jīng)過預(yù)實驗，一根煙大約10次可以完全吸盡），配成0.5支/100 mL、1支/100 mL、2支/100 mL、4支/100 mL、8支/ 100 mL 5個濃度梯度。

圖1 香煙煙霧簡易吸取器示意圖和實物圖

1.2.3 染毒處理 選取等量、長勢一致的大蒜粒分別放入蒸餾水、0.5支/100 mL、1支/100 mL、2支/100 mL、4支/100 mL、8支/100 mL的煙霧水溶液中，分別于12、24、36 h取出大蒜粒，清洗表面的煙霧水溶液，放入清水中，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 染色制片 大蒜粒在恢復(fù)培養(yǎng)后從根尖頂端部位切下1 cm 左右的幼根；用卡諾氏液在Eppendorf 管中固定，24 h后進(jìn)行酸解；用蒸餾水漂洗3～5 次，吸去多余水分，將根尖置于載玻片上，加適量改良石炭酸品紅進(jìn)行染色，染色10～15 min；在染色過程中，用鑷子適當(dāng)?shù)膴A碎根尖，蓋上蓋玻片，包裹吸水紙，然后用鑷子敲打蓋片，使細(xì)胞分散開，鋪成薄薄一層。

1.2.5 鏡 檢 選取視野清晰、細(xì)胞分散均勻的裝片進(jìn)行顯微觀察，每張裝片統(tǒng)計大約1 000個細(xì)胞，記錄每張裝片產(chǎn)生微核的細(xì)胞數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel和IBM SPSS 23對鏡檢的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 香煙煙霧水溶液處理下大蒜根尖細(xì)胞產(chǎn)生微核的形態(tài)

顯微觀察發(fā)現(xiàn)，不同濃度的香煙煙霧水溶液處理會刺激大蒜根尖細(xì)胞產(chǎn)生各種形態(tài)的微核，如圖2所示，有單微核、雙微核和鉤形微核；其中，以單微核出現(xiàn)的頻率最高，且微核的大小不一。

2.2 香煙煙霧水溶液處理下大蒜根尖細(xì)胞產(chǎn)生微核的數(shù)量變化

由圖3可知，隨著香煙煙霧水溶液濃度的增加，大蒜根尖細(xì)胞產(chǎn)生的微核越多，微核率越高；而隨著處理時間的延長，大蒜根尖細(xì)胞出現(xiàn)微核的幾率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，以處理24 h時，微核率最高。

由表1可知，不同濃度和不同時間的香煙煙霧水溶液處理，大蒜根尖細(xì)胞的微核率差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。從表2中可以看出，大蒜根尖細(xì)胞微核率隨著濃度的增加而不斷升高，不過，當(dāng)濃度增大到4支/mL時，雖然微核率仍然隨著濃度的增加而增加，但是其增長的幅度明顯降低。

由表3可知，大蒜根尖細(xì)胞微核率隨著染毒時間的不斷延長而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。從圖3中可以看出，當(dāng)處理時間為12 和24 h時，微核率均以香煙煙霧水溶液濃度為8支/mL處理的最高，分別為96.2%和136.5%；而當(dāng)處理時間為36 h時，微核率以2支/mL處理的最高，為93.8%；不同香煙煙霧處理的微核率均大于空白對照組，且微核指數(shù)均大于3.5，屬于重度損傷。

另外，從表1中還可以看出，染毒時間和煙霧水溶液的濃度對微核率的影響是具有交互作用的，且交互效應(yīng)極顯著（P＜0.01），表明處理時間和煙霧水溶液濃度共同作用引發(fā)植物細(xì)胞微核的產(chǎn)生。

圖2 香煙煙霧水溶液處理大蒜根尖細(xì)胞產(chǎn)生的微核形態(tài)

圖3 香煙煙霧不同濃度和不同時間處理大蒜根尖細(xì)胞微核率的比較

表1 不同濃度和處理時間的主體間效應(yīng)檢驗

表2 不同濃度對微核率的影響

表3 不同處理時間對微核率的影響

2.3 處理濃度和處理時間與大蒜根尖細(xì)胞微核率的相關(guān)性分析

采用IBM SPSS23軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，由表4可知，控制濃度對微核率和處理時間進(jìn)行偏相關(guān)分析得出，相關(guān)系數(shù)r=0.084，P=0.432，因此可以得出處理時間與微核率相關(guān)性不顯著。由表5可知，在控制處理時間對微核率和濃度進(jìn)行偏相關(guān)分析時，相關(guān)系數(shù)r=0.816，P＜0.01，因此可以得出煙霧水溶液的濃度與微核率顯著正相關(guān)。

表4 處理時間與微核率的相關(guān)性分析

對處理12和24 h的試驗組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知（表6），控制濃度對微核率和處理時間進(jìn)行偏相關(guān)分析得出，相關(guān)系數(shù)r=0.775，P＜0.01，因此可以得出處理時間與微核率呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系；由表7可知，在控制處理時間對微核率和濃度進(jìn)行偏相關(guān)分析時，相關(guān)系數(shù)r=0.972，P＜0.01，因此可以得出香煙煙霧水溶液濃度與微核率呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系。由兩者的相關(guān)性系數(shù)對比可知，煙霧水溶液濃度與微核率的相關(guān)性更高。

表6 處理時間與微核率的相關(guān)性分析（12和24 h試驗組）

表7 濃度與微核率的相關(guān)性分析（12和24 h試驗組）

3 結(jié)論與討論

該研究顯示，煙霧水溶液濃度越高，對大蒜根尖細(xì)胞遺傳物質(zhì)的損傷越嚴(yán)重，在一定處理時間范圍內(nèi)（24 h以內(nèi)），處理時間越長，大蒜根尖細(xì)胞的產(chǎn)生的微核越多，遺傳物質(zhì)損傷也就越嚴(yán)重。但如果處理時間超過24 h，且香煙煙霧濃度≥2 支/100 mL時，微核率反而會隨著濃度的增大而呈現(xiàn)下降的趨勢。這可能是因為當(dāng)處理時間過長，處理劑量達(dá)到一定濃度時，植物根尖細(xì)胞被殺死，導(dǎo)致統(tǒng)計到的細(xì)胞數(shù)目和微核變少，微核率隨之降低。另外一種可能是處理時間過長，在高濃度的香煙煙霧水溶液處理下植物細(xì)胞通過一系列的生理調(diào)節(jié)對高濃度產(chǎn)生一定的適應(yīng)性，從而使得煙霧水溶液對根尖細(xì)胞中染色體的表觀損傷減小，微核率降低。儀慧蘭等[14]在研究SO2對蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘導(dǎo)作用時也認(rèn)為蠶豆可以在短時間內(nèi)適應(yīng)環(huán)境中低濃度的SO2，并通過較長時間適應(yīng)較高濃度的SO2，從而使得SO2對根尖細(xì)胞中染色體的表觀損傷減小。另外，任子蓓等[15]認(rèn)為高濃度處理將強(qiáng)烈抑制植物細(xì)胞有絲分裂，使分裂細(xì)胞顯著減少，使處于間期的細(xì)胞容易發(fā)生畸變而不形成微核，從而間接導(dǎo)致細(xì)胞微核率降低。王五香等[16]的研究也表明，污染物的濃度較高，影響蠶豆根尖細(xì)胞分裂時其微核率反而降低。而王蘭君等[17]通過研究4 種典型PPCPs對蠶豆和大蒜根尖細(xì)胞微核率的影響時指出，低濃度范圍內(nèi)隨著處理劑濃度的增加，對根尖細(xì)胞染色體DNA的毒性隨之增強(qiáng)，微核率呈增加趨勢；隨著濃度的進(jìn)一步增大，微核率反而呈下降趨勢；有可能是因為高濃度處理劑的毒性增強(qiáng)，使細(xì)胞的正常分裂活動受到減緩、抑制、甚至終止，導(dǎo)致高濃度脅迫下微核出現(xiàn)的頻率降低。但這些都只是人們的猜測，確切的機(jī)理有待于進(jìn)一步的研究。

另外，通過12、24 h試驗組可以得出，煙霧水溶液濃度、處理時間都與微核率呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，但煙霧水溶液濃度與微核率的相關(guān)性更高。這顯示煙霧水溶液的濃度與微核的產(chǎn)生關(guān)系更加密切，煙霧水溶液濃度對微核產(chǎn)生的貢獻(xiàn)更大。這可能是隨著煙霧水溶液濃度的增加，溶液中損害植物遺傳物質(zhì)的顆粒也就越多，進(jìn)入細(xì)胞的毒性物質(zhì)隨之增加，故對細(xì)胞染色體DNA的損傷也就越嚴(yán)重。

煙霧水溶液的濃度和處理時間對微核的產(chǎn)生有較強(qiáng)的交互效應(yīng)（P＜0.01）。這可能與煙霧水溶液中有毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞的速度有關(guān)，在單位時間內(nèi)，只有一定數(shù)量的有毒顆粒能夠進(jìn)入細(xì)胞，損害植物細(xì)胞遺傳物質(zhì)。在煙霧水溶液濃度一定的情況下，也只有經(jīng)過一定的時間才能對植物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)造成影響。

研究結(jié)果還顯示，微核指數(shù)均大于3.5，屬于重度損傷[18]。這表明香煙的煙霧水溶液確實能嚴(yán)重?fù)p害植物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)。

[1] 孫詠梅，戴樹桂，襲著革. 香煙煙霧成分分析及其對DNA生物氧化能力研究[J]. 環(huán)境與健康雜志，2001，18（4）：203-207.

[2] 薛佳楨，李偉忠. 維生素C對小麥芽抗水溶性香煙煙霧的影響[J].濰坊學(xué)院學(xué)報，2012，12（6）：22-24.

[3] 張 偉，陳 坤. 香煙煙霧水溶物對人外周血淋巴細(xì)胞SCE的影響[J]. 中國醫(yī)學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用，2004，（2）：52-54.

[4] 趙愛景. 卷煙煙氣對小鼠體內(nèi)外菌群和糖尿病大鼠的影響[D]. 新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)，2013.

[5] 吳春麗，王雪梅，喻 意，等. 香煙煙霧誘導(dǎo)下的自噬對卵泡發(fā)育的影響[J]. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2016，38（7）：879-885.

[6] 孫學(xué)敏. 香煙煙霧提取物誘導(dǎo)人紅細(xì)胞膜損傷及茶多酚的保護(hù)作用[D]. 陜西，陜西師范大學(xué)，2007.

[7] 杜峰濤，李 林. 細(xì)胞微核形成機(jī)理探討[J]. 現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（4）：19-22.

[8] 趙 祥，王金花，朱魯生，等. 抗生素和銅聯(lián)合作用對蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)研究，2015，28（7）：1085-1090.

[9] 翁貴英，王國紅，孫愛群，等. 運用蠶豆根尖微核技術(shù)評價貴州省水城河水污染狀況[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（6）：1334-1336.

[10] 趙 昕，胡英考，蔡民華，等. 三種維生素對亞硝酸鈉致蠶豆根尖細(xì)胞微核效應(yīng)的影響[J]. 食品科學(xué)，2010，31（5）：240-243.

[11] 龔婧婧，黃海濤，米其利，等. 微核技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報，2012，（3）：49-56.

[12] 馮宣軍，彭翠萍，甜葉菊. 甜葉菊水浸液處理蠶豆根尖細(xì)胞的抗畸變效應(yīng)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（18）：9470-9471.

[13] 張 平，汪珍春，姚 焱，等. 蠶豆根尖微核技術(shù)研究水體中鉈的遺傳毒性[J]. 生態(tài)環(huán)境，2008，17（1）：47-49.

[14] 儀慧蘭，孟紫強(qiáng). SO2對蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘導(dǎo)作用[J]. 生態(tài)學(xué)報，2003，23（2）：292-296.

[15] 任子蓓，史寶勝，劉 棟，等. 甲醛脅迫對吊蘭根尖微核形成和有絲分裂的影響[A]. 中國風(fēng)景園林學(xué)會2014年會論文集[C]. 沈陽：中國建筑工業(yè)出版社，2014. 612-614.

[16] 王五香，高 丹，廖 芬，等. 蠶豆根尖微核技術(shù)的方法學(xué)新論[J].生態(tài)毒理學(xué)報，2016，11（3）：86-91.

[17] 王蘭君，王金花，朱魯生. 4種典型PPCPs對蠶豆和大蒜根尖細(xì)胞微核率的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)，2016，37（4）：1568-1575.

[18] 賴金龍，陶宗婭，吳 國，等. 鄰苯二甲酸二丁酯對蠶豆胚根細(xì)胞微核形成的影響及毒理機(jī)制[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2014，9（1）：107-113.

（責(zé)任編輯：成 平）

Influence of Water-soluble Fraction of Cigarette Smoke on the Micronucleus Root-Tip Cells of Garlic

XIAO Xing-hui1，LI Yu-xia1，XU Liang1，WANG Xiao-kui1，LI Wen-chao1，LI Jia-xin1，LIU Hong-ling1,2
（1. College of Biology Science, Shihezi University, Shihezi 832000, PRC; 2. Chengdu Normal University, Chengdou 611130, PRC）

In order to explore the infuence of the water-soluble fraction of cigarette smoke on the micronucleus of plant cells, choosing the garlic rooy tip as the experimental material and extracting water-soluble fraction of different concentrations, this study analyses the infuence of different concentration and treatment time on the genetic material of cells of root tip of Garlic. The results indicated that micronucleus rate increased with the concentration increases when the range of water-soluble fraction of cigarette smoke is 0.5 to 8. The rate of micronucleus increases frst and then decreases at last when treatment continued12-36 h. however, when the treatment continued 12 or 24 hours, the rate of micronucleus increases quickly with the growth of concentration. While the treatment continued 36 hour, the rate of micronucleus increases frst and then decreases at last. the concentration and treatment time have an interaction on producing micronucleus, and the concentration of water-soluble fraction of cigarette smoke contributes more to producing micronucleus than the treatment time. All the rate of micronucleus of experimental group exceeds that of control group (P＜0.05), and the index of micronucleus is bigger than 3.5, belonging to severe damage. In conclusions, under the quite low concentration (0.5/mL) and less treatment time , the water-soluble fraction of cigarette smoke has severe damage to the genetic material of plant.

water-soluble fraction of cigarette smoke; root tip of Garlic; micronucleus; concentration; treatment time

Q355; X171. 5

：A

：1006-060X（2017）06-0007-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.006.003

2017-03-25

石河子大學(xué)高層次人才啟動項目（RCZX201546）；石河子大學(xué)3152人才項目（3152SFXY04027）；石河子大學(xué)教改項目（SJ-2015-13）

肖星輝（1995-），男，湖南新化縣人，本科生，生物技術(shù)專業(yè)。

劉紅玲