百里香多酚的提取工藝優(yōu)化及抑李斯特菌活性研究

王娣，許暉，柯春林，李妍，曹珂珂，謝海偉

(蚌埠學院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

百里香多酚的提取工藝優(yōu)化及抑李斯特菌活性研究

王娣，許暉，柯春林，李妍，曹珂珂，謝海偉

(蚌埠學院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

對百里香中多酚物質進行超聲波輔助提取優(yōu)化，并對其抑李斯特菌活性進行研究。選取超聲溫度、超聲功率、超聲時間、料液比4個影響因素，正交確定超聲波輔助提取百里香多酚的最佳工藝條件，即超聲溫度50 ℃、超聲功率400 W、超聲時間25 min、料液比1∶15，多酚提取率8.36%。百里香多酚提取物對單增李斯特菌有抑菌作用。

百里香；超聲輔助提??；李斯特菌；抑菌活性

百里香(Thyme)屬于唇形科，為多年生草本植物或小灌木，原產于地中海沿岸，后逐漸被許多國家引種栽培[1]。百里香屬植物種類繁多，化學成分主要有揮發(fā)油類(或芳香油類)、多酚類以及其他成分[2-5]。其中，百里香多酚具備顯著的生理及藥理活性，有抗菌、抗氧化、抗癌、抗腫瘤以及預防心血管疾病等功效，一直備受關注[6,7]。超聲波提取技術能有效破碎細胞，加速細胞內溶質的溶出和擴散，有縮短提取時間、保護活性成分的作用，因而被廣泛運用于天然產物提取[8-11]。本實驗以百里香莖葉為實驗材料，采用超聲波輔助提取百里香中的多酚類物質，并對其抑李斯特菌活性進行初探，以期為我國百里香屬植物的活性成分的開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與儀器

百里香(市售)；單增李斯特菌(中科院微生物所，編號：1.10753)；沒食子酸(標準品)；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)；胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)；其他試劑為分析純。

DY881-8 干燥箱；FW100 粉碎機；GB-303 電子天平；SB25-12DTD 超聲波機；UV1102紫外-可見分光光度計；HH-5 恒溫水浴鍋；RE-2000B 旋轉蒸發(fā)器；LDZX-50KB 蒸汽滅菌器；GNP-9080 微生物培養(yǎng)箱等。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理

取百里香莖葉若干，低溫下烘干，粉碎機粉碎過60目篩避光備用。

1.2.2 百里香多酚提取方法

稱取5.0 g百里香粉于燒瓶中(3組平行)，加入80%乙醇溶液，在不同溫度、不同功率下超聲波浸提一段時間，接著以4000 r/min離心15 min，分離上清液備用。同樣方法重復2 次提取殘渣，合并提取液，在45 ℃下真空旋轉蒸發(fā)，定容，測定多酚含量，計算百里香多酚的提取率。

式中：C為提取液多酚濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為百里香質量，g。

1.2.3 標準工作曲線

采用福林酚法進行測定。準確稱取沒食子酸0.001 g，加蒸餾水溶解于500 mL的容量瓶中，定容，搖勻。分別吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL沒食子酸標準溶液于50 mL容量瓶中，加入FC試劑6.0 mL，搖勻，再加入24.0 mL 10% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容，于30 ℃下避光放置2 h，在760 nm波長下測吸光度，得標準曲線，見圖1，回歸方程為：Y=0.1042X+0.006(R2=0.9940)[12]。

圖1 沒食子酸標準工作曲線

1.2.4 單因素實驗

分別以不同超聲溫度(30，40，50，60，70 ℃)、不同超聲功率(200，250，300，350，400 W)、不同超聲時間(5，10，15，20，25 min)、不同料液比(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25)為影響因素，研究其對百里香多酚提取的影響。

1.2.5 正交實驗優(yōu)化

正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.2.6 抑菌活性研究

將單增李斯特菌接種于TSB中，37 ℃下160 r/min 培養(yǎng)過夜后，5 ℃下3500 r/min離心15 min，取菌體用0.85%生理鹽水稀釋，使菌懸液濃度達到106cfu/mL ，備用。在無菌條件下，用微量移液器吸取適量的菌懸液于TSA中涂布均勻。采用孔徑為6 mm 的牛津杯，用倍比稀釋法將百里香多酚粗品加0.5%吐溫80，加無菌水稀釋至100～3.125 mg/mL 6個濃度梯度，每孔加入100 μL提取物，做3次重復，以0.5%吐溫80作空白對照，37 ℃下培養(yǎng)20 h，測量抑菌圈直徑，3次平行實驗取平均值。

2 結果和分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 超聲溫度對百里香多酚提取的影響

圖2 超聲溫度對百里香多酚提取率的影響

由圖2可知，隨著超聲溫度的提高，多酚提取率在逐漸增加，在60 ℃時達到最大值，可能因為溫度的上升導致分子運動加劇，擴散變快；但溫度超過60 ℃，多酚提取率反而略下降，因此選擇超聲溫度60 ℃為宜。

2.1.2 超聲功率對百里香多酚提取的影響

圖3 超聲功率對百里香多酚提取的影響

由圖3可知，隨著超聲功率的增加，百里香多酚提取率在逐漸增加，在350 W時達到最大值并趨于平衡，超聲功率的增加可能導致細胞壁被破碎，百里香多酚從細胞擴散到溶液中量在也逐漸增加，因此選擇超聲功率350 W為宜。

2.1.3 超聲時間對百里香多酚提取的影響

圖4 超聲時間對百里香多酚提取的影響

由圖4可知，隨著超聲時間的增加，百里香多酚提取率逐漸增加，在20 min達到最大值，再繼續(xù)延長超聲時間，百里香多酚提取率基本不變，因此選擇超聲時間20 min為宜。

2.1.4 料液比對百里香多酚提取的影響

圖5 料液比對百里香多酚提取的影響

由圖5可知，百里香多酚提取率隨著料液比的增加在逐漸增加，在料液比為1∶15時達到最大值，再繼續(xù)增加料液比，百里香多酚提取率基本趨于平緩不再上升，因此選擇料液比1∶15為宜。

2.2 正交實驗

以料液比、超聲時間、超聲功率、超聲溫度為四因素，做三水平的正交實驗，選擇L9(34)正交表，實驗結果見表2。

表2 正交實驗分析Table 2 Analysis of the orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表2和表3可知，極差C>B>A>D，因此各因素對百里香多酚提取的影響為，提取時間>超聲功率>提取溫度>料液比，得出百里香多酚提取的最優(yōu)化條件：A1B3C3D2，即提取溫度為50 ℃，提取功率為400 W，提取時間為25 min，料液比為1∶15，在此條件下提取3次求平均值，得到多酚的提取率為8.36%。方差結果表明超聲溫度對百里香多酚的提取具有顯著性。

2.3 百里香多酚的抑菌活性研究

百里香多酚提取物抑制李斯特菌活性見表4。

表4 百里香多酚抑制李斯特菌活性Table 4 Antibacterial activity to Listeria monocytogenesof polyphenols from thyme

注：“-”表示無抑菌圈出現(xiàn)。

抑菌實驗結果表明：100 mg/mL百里香多酚提取物對李斯特菌抑菌作用較強，抑菌圈直徑為15.23 mm。但是倍比稀釋后，其抑菌活性也逐漸減弱，3.125 mg/mL多酚提取液則沒有抑菌活性。國內外學者研究表明：百里香中的酚類物質，尤其是百里香酚(Thymol)和香芹酚(Carvacrol)，是具有抑菌活性的物質，其抑菌機理可能是降解細胞壁、損傷細胞膜、對微生物DNA的作用、菌體呼吸能量代謝的影響等[13-16]。

3 結論

超聲波輔助提取百里香多酚的最佳提取工藝為：超聲溫度50 ℃、超聲功率400 W、超聲時間25 min、料液比1∶15、多酚提取率8.36%。百里香多酚的抑菌活性研究表明其對單增李斯特菌有明顯抑制作用。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志(二分冊)[M].北京:科學出版社,1994.

[2]王靜,李榮,譚津,等.天然調味香料百里香精油的研究進展[J].中國調味品,2012,37(7):10-13.

[3]苗延青,湯穎,吳亞,等.百里香揮發(fā)油化學成分的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(2):305-306.

[4]朱曉磊,陳宏.百里香精油的抗微生物作用及抗氧化特性研究進展[J].中國畜牧雜志,2012,48(23):88-92.

[5]任玉鋒,蘇振峰,劉雅琴.殼聚糖、海藻酸鈉、百里香酚及其復合物對靈武長棗采后主要病原真菌的抑制作用[J].湖北農業(yè)科學,2013,52(1):84-87.

[6]胡瑛,杜予民,劉慧.殼聚糖-百里香酚復合物的抑菌活性研究[J].武漢大學學報(理學版),2003,49(2):261-265.

[7]張有林,張潤光,鐘玉.百里香精油的化學成分、抑菌作用、抗氧化活性及毒理學特性[J].中國農業(yè)科學,2011,44(9):1888-1897.

[8]Zheng Yi,Li Yong,Wang Weidong.Optimization of ultrasonic assisted extraction and in vitro antioxidant activities of polysaccharides fromTrametesorientalis[J].Carbohydrate Polymers,2014,111:315-323.

[9]Teh S S,Birch E J.Effect of ultrasonic treatment on the polyphenol content and antioxidant capacity of extract from defatted hemp,flax and canola seed cakes[J].Ultrasonics Sonochemistry,2014,21(1):346-353.

[10]Pan Guangyan,Yu Guoyong,Zhu Chuanhe,et al.Optimization of ultrasound-assisted extraction (UAE) of flavonoids compounds (FC) from hawthorn seed (HS)[J].Ultrasonics Sonochemistry,2012,19(3):486-490.

[11]朱文學,焦昆鵬,羅磊,等.綠豆皮黃酮的超聲波輔助水提工藝優(yōu)化及抗氧化活性[J].食品科學,2015,36(16):12-17.

[12]張瑞妮.紅棗多酚的提取分離及體外抗氧化活性研究[D].西安:陜西師范大學,2013.

[13]Chang Y，Mclandsborough L，Mcclements D J.Fabrication,stability and efficacy of dual-component antimicrobial nanoemulsions:essential oil (thyme oil) and cationic surfactant (lauric arginate) [J].Food Chemistry,2015,172:298-304.

[14]Govaris A,Botsoglou E,Sergelidis D,et al.Antibacterial activity of oregano and thyme oils againstListeriamonocytogenesandEscherichiacoliO157:H7 in feta cheese packaged under modified atmosphere[J].LWT-Food Science and Technology,2011,44(4):1240-1244.

[15]Gill A O，Holley R A.Disruption ofEscherichiacoli,ListeriamonocytogenesandLactobacillussakeicellular membranes by plant oil aromatics[J].International Journal of Food Microbiology,2006,108(1):1-9.

[16]Rasooli I，Abyaneh M R.Inhibitory effects of thyme oils on growth and aflatoxin production byAspergillusparasiticus[J].Food Control,2004,15(6):479-483.

Extraction Process Optimization of Polyphenols from Thyme and Their Antibacterial Activity toListeriamonocytogenes

WANG Di, XU Hui, KE Chun-lin, LI Yan, CAO Ke-ke, XIE Hai-wei

(Department of Biology and Food Engineering, Bengbu College, Bengbu 233030, China)

The ultrasonic-assisted extraction process of polyphenols from thyme is optimized, and the antibacterial activity toListeriamonocytogenesof polyphenols is studied. Using thyme as experimental materal, ultrasonic temperature, ultrasonic power, ultrasonic time and solid-liquid ratio are optimized to obtain the optimal process conditions.The results show that the optimal extraction parameters are as follows: ultrasonic temperature is 50 ℃,ultrasonic power is 400 W, ultrasonic time is 25 min and solid-liquid ratio is 1∶15, the extraction rate of polyphenols reaches up to 8.36%. The polyphenols from thyme show antibacterial activity toListeriamonocytogenes.

thyme;ultrasonic-assisted extraction;Listeriamonocytogenes;antibacterial activity

2017-01-08

安徽省教育廳重點科研項目(KJ2015A204)；安徽省級質量工程項目(2014jyxm392)

王娣(1976-)，女，副教授，碩士，研究方向：食品生物技術。

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.014

1000-9973(2017)07-0063-04