聯(lián)合使用固力康和特立帕肽對(duì)去卵巢大鼠股骨干骺端骨量、骨強(qiáng)度的影響

謝輝

湖北省荊門市第一人民醫(yī)院創(chuàng)傷手足外科，湖北 荊門 448000

骨量嚴(yán)格受骨形成和骨吸收的平衡調(diào)控，當(dāng)兩者之間的平衡被打破時(shí)就會(huì)出現(xiàn)一系列的疾病包括骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松表現(xiàn)為骨吸收相對(duì)增強(qiáng)，漸漸出現(xiàn)骨量減少、骨脆性增加，容易在低能量創(chuàng)傷下出現(xiàn)骨折，這也是這類疾病的主要危害[1]。目前抗骨質(zhì)疏松藥物主要通過(guò)促進(jìn)骨吸收和/或抑制骨吸收來(lái)防治骨質(zhì)疏松，如甲狀旁腺激素(1-34,PTH)，雙膦酸鹽類，然而對(duì)于嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松， PTH和雙膦酸鹽類聯(lián)合使用對(duì)患者的骨密度提高并沒(méi)有疊加作用，可能是雙膦酸鹽類降低骨轉(zhuǎn)換和限制了骨重建的進(jìn)程[2]。組織蛋白酶K是在破骨細(xì)胞中高表達(dá)的半胱氨酸蛋白酶，對(duì)I型膠原的降解起著重要的作用[3]。早期的研究表明組織蛋白酶K抑制劑(KKI)，它選擇性抑制骨吸收，對(duì)骨形成影響很小[4,5]。綜上所述，我們假設(shè)，組織蛋白酶K抑制劑和PTH聯(lián)合使用可能有助于增加骨量，骨強(qiáng)度。

本研究通過(guò)聯(lián)合使用KKI和PTH來(lái)治療去卵巢大鼠，觀察其對(duì)大鼠股骨干骺端的療效，為臨床上兩者藥物聯(lián)合的使用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12 周齡SPF級(jí)SD 雌性大鼠50只，體重225～250 g，由上海斯萊克動(dòng)物公司提供許可證號(hào):(SCXK(滬)2007-0005，合格證號(hào):2007- 000548429)。所有動(dòng)物在溫度為(24.0±0.5) ℃，濕度為45%～50%， 通風(fēng)良好的環(huán)境下飼養(yǎng)，每周稱體重 1 次。每次手術(shù)后前3天所以大鼠給予青霉素肌肉注射(2.5萬(wàn)U/kg)預(yù)防感染。

1.2材料

固力康(日本衛(wèi)材株式會(huì)社)；PTH(GIBCO 公司)；Micro-CT (SkyScan1176，荷蘭),顯微鏡(ZEISS Axio Imager M1，德國(guó))，Image-Pro Plus全自動(dòng)圖像分析儀(Media Cybernetics，美國(guó))，生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)(MTS-858，美國(guó))。

1.3 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建立及治療

50只大鼠隨機(jī)分成2組即OVX組(n=45)切除雙側(cè)卵巢以建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型和Sham組不切除雙側(cè)卵巢建立假手術(shù)模型。手術(shù)開(kāi)始前，所有大鼠稱重，根據(jù)體重，適量腹腔注射10% 水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行麻醉，麻醉成功后，于大鼠背部正中線中下 1/3處作一長(zhǎng)約 2 cm 縱行切口，向兩側(cè)鈍性分離皮下軟組織，于脊柱旁開(kāi)0.5 cm處鈍性分開(kāi)肌肉組織，顯露卵巢脂肪包被組織，輕輕提起卵巢，于輸卵管卵巢交界處絲線結(jié)扎，完整摘除雙側(cè)卵巢，逐層縫合，關(guān)閉創(chuàng)口。正常環(huán)境下飼養(yǎng)12 w后各組取5只大鼠處死股骨行骨密度測(cè)量?jī)x檢測(cè)來(lái)檢驗(yàn)骨質(zhì)疏松建立模型建立情況。隨后所有的去卵巢(OVX)大鼠隨機(jī)的分成4組：OVX組、KKI組、PTH組、PTH+KKI組。KKI組、PTH組、PTH+KKI組大鼠術(shù)后給予固力康6 mg/(kg·d)灌胃，特立帕肽60 μg/kg皮下注射，每周3次、固力康6 mg/(kg·d)灌胃加特立帕肽60 μg/kg皮下注射，每周3次直至去卵巢術(shù)后12 w。隨后所有大鼠處死取股骨行Micro-CT、骨生物力學(xué)、HE組織切片檢測(cè)。

1.4 Micro-CT檢測(cè)

所有存活的大鼠在術(shù)后12 w時(shí)處死，完整取下大鼠雙側(cè)股骨，剔除周圍軟組織， 生理鹽水沖洗后，采用10%多聚甲醛固定用于Micro-CT 檢測(cè)。掃描條件為：圖像矩陣為2048 ×2048， 整合時(shí)間為 200 ms，能量/強(qiáng)度為70 kVp、 114 μA、 8 W。以 0°旋轉(zhuǎn)， 進(jìn)行掃描。掃描完成后， 選取生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端1.0 mm、 層厚2.0 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)進(jìn)行三維重組， 最低閾值為 160 提取圖像信息。獲得大鼠股骨感興趣區(qū)域骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)骨體積分?jǐn)?shù) (bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabeculae number，Tb.N)、 骨小梁分離度(trabecular spacing，Tb.Sp)、連接密度(connective density，Conn.D.)及骨密度(BMD)。

1.5 HE組織切片

待所有股骨經(jīng)過(guò)Micro-CT檢測(cè)后，所有標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，甲基丙烯酸甲酯包埋。包埋塊修整后置于硬組織切片機(jī)沿脛骨縱軸冠狀面切片，清洗打磨拋光，切片最終厚度約為30～40 μm，切片在熒光顯微鏡及光鏡下觀察。然后將標(biāo)本放置在EDTA 脫鈣液中浸泡，每3～4 d換液1 次，連續(xù)脫鈣4 w，X 線檢測(cè)是否脫鈣完全，然后充分水洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，Olympus BX5l多功能顯微鏡下觀察股骨干骺端骨生長(zhǎng)情況，骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)及分布。

1.6 生物力學(xué)測(cè)定

取右側(cè)股骨，將其置于MTS-858型生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上，支點(diǎn)跨距17 mm，中點(diǎn)為加壓點(diǎn)，加載速度為 2 mm/min，計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線，根據(jù)曲線計(jì)算最大載荷和剛度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)對(duì)大鼠的影響

至實(shí)驗(yàn)截止時(shí)間，有2只大鼠由于手術(shù)不當(dāng)、麻醉不當(dāng)和傷口感染死亡，它們都屬于OVX組，最終共有38只大鼠進(jìn)入最終試驗(yàn)結(jié)果評(píng)估。術(shù)后12 w時(shí)兩組大鼠股骨的骨密度變化由骨密度測(cè)量?jī)x檢測(cè)所得，Sham組大鼠的股骨骨密度為241.21±31.78 (mg/cm2)，而OVX組大鼠股骨骨密度為171.24±28.31 (mg/cm2)。相對(duì)Sham組，OVX組大鼠的骨密度下降40.93%(P<0.05)，結(jié)果表明骨質(zhì)疏松模型建立是成功的。

2.2 股骨骨密度的改變

藥物治療12 w時(shí)，大鼠股骨干骺端通過(guò)Micro-CT掃描后通過(guò)內(nèi)置軟件所得的各組股骨骨密度如表1所示；相對(duì)于OVX組，KKI、PTH、PTH+KKI各組股骨骨密度分別增加了19.09%、28.62%、39.26%，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)相對(duì)于單獨(dú)使用PTH和KKI，聯(lián)合使用兩者對(duì)去卵巢大鼠股骨骨密度提高更明顯。

注：與OVX組比較，*P<0.05;與SIM組比較，#P<0.05;與PTH組比較，&P<0.05

2.3 Micro- CT 三維重建分析及骨微觀參數(shù)

通過(guò)Micro- CT對(duì)感興趣區(qū)域進(jìn)行三維重建，重建的結(jié)果如圖1所示，通過(guò)內(nèi)置軟件計(jì)算的骨微觀參數(shù)如表1所示。通過(guò)觀察圖1可以明顯發(fā)現(xiàn)：相對(duì)OVX組而言，KKI、PTH、PTH+KKI各組的骨小梁數(shù)量明顯增多，而且骨小梁聯(lián)系緊密，骨小梁更粗。骨微觀參數(shù)更加明確的表明PTH+KKI組有最高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D和最低Tb.Sp，而OVX組有最高的Tb.Sp和最低BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D。和OVX組比較，KKI、PTH、PTH+KKI各組骨微觀參數(shù)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)相對(duì)于單獨(dú)使用PTH和KKI，聯(lián)合使用兩者對(duì)去卵巢大鼠股骨骨量提高更明顯。

圖1 藥物治療12 w時(shí)各組大鼠股骨干骺端Micro-CT三維重建結(jié)果Fig.1 3D reconstruction of micro-CT images in the metaphysis of the left femurs of the rats in each group after 12-week treatment

圖2 藥物治療12 w時(shí)各組大鼠股骨干骺端HE組織切片結(jié)果Fig.2 The results of HE staining of the histological slices in the metaphysis of the left femurs of the rats in each group after 12-week treatment

2.4 HE組織切片結(jié)果

大鼠左側(cè)股骨切片經(jīng)過(guò)HE染色結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明KKI、PTH、PTH+KKI各組干骺端的骨量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于OVX組，且骨小梁之間聯(lián)系緊密，排列有規(guī)律；而OVX組骨小梁稀疏，且骨小梁纖細(xì)，部分骨小梁出現(xiàn)斷裂，這表明KKI和PTH明顯增加股骨干骺端骨量，HE切片的觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Micro-CT的結(jié)果。

2.5 骨生物力學(xué)結(jié)果

股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)中，KKI、PTH、PTH+KKI組最大載荷、剛度均高于OVX組PTH+KKI組有著最大的載荷、剛度值，且各組之間比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 藥物治療12 w時(shí)各組大鼠股骨(右)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)的結(jié)果Table 2 The 3-point bending test results of the right femurs of the rats in each group after 12-week treatment

注：與OVX組比較，*P<0.05;與SIM組比較，#P<0.05;與PTH組比較，&:P<0.05

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)中使用雌性SD大鼠經(jīng)過(guò)去卵巢12 w來(lái)建立骨質(zhì)疏松模型，經(jīng)過(guò)全身使用PTH及KKI來(lái)改變?nèi)ヂ殉泊笫蟮墓谴x，藥物治療12 w后處死大鼠取下雙側(cè)股骨行Micro-CT、HE切片及骨生物力學(xué)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明相對(duì)于單獨(dú)使用PTH及KKI，聯(lián)合使用兩者可以明顯增加股骨BMD，提高股骨干骺端微觀參數(shù)，保護(hù)骨小梁的質(zhì)和量，增加股骨最大載荷及剛度；這暗示聯(lián)合使用PTH及KKI對(duì)骨質(zhì)疏松的治療有疊加作用。

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量降低，骨組織顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生退變，導(dǎo)致骨脆性增加，骨強(qiáng)度下降，易導(dǎo)致骨折的骨骼疾病[6]。隨著世界老年化進(jìn)展，骨質(zhì)疏松的患病率越來(lái)越高，骨質(zhì)疏松相關(guān)骨折已經(jīng)成為很大的世界性難題，防治骨質(zhì)疏松對(duì)臨床醫(yī)生來(lái)說(shuō)是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)[7]。雖然雙膦酸鹽類、地諾單抗、雌激素在治療骨質(zhì)疏松都有不錯(cuò)的療效，但是常常會(huì)出現(xiàn)一些不利因素影響其臨床應(yīng)用，如雙膦酸鹽類人體吸收率低，不適用于有血栓栓塞性疾病或腎功能不全者[8]；地諾單抗使用時(shí)出現(xiàn)下頜骨壞死率[9]；雌激素會(huì)加大婦科腫瘤的發(fā)病率。其嚴(yán)重后果是發(fā)生骨折及骨折后難以愈合， 嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。為了取得最大療效， 人們尋求聯(lián)合治療或序貫治療的方法防治骨質(zhì)疏松癥。間歇性小劑量使用PTH具有促進(jìn)骨合成代謝作用，并可改善骨微結(jié)構(gòu)，增加骨量。本研究表明間歇性小劑量使用PTH確實(shí)具有提高骨質(zhì)疏松狀態(tài)下骨密度，增加骨量。

本實(shí)驗(yàn)中使用KKI是一種四烯甲萘醌合成物，它可以有效抑制組織蛋白酶K形成，促進(jìn)骨形成作用，同時(shí)抑制破骨形成，可以有效提高血清骨鈣素濃度[10]。我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用PTH和KKI可以明顯的增加股骨骨量及骨強(qiáng)度，這說(shuō)明它們同時(shí)使用有互相促進(jìn)作用。具體的機(jī)制尚不清楚，這可能和兩者的促進(jìn)骨形成的機(jī)制有關(guān)。PTH具有強(qiáng)烈的促進(jìn)成骨作用和破骨細(xì)胞有偶聯(lián)系性，而KKI抑制破骨細(xì)胞的作用并不影響PTH成骨作用，這與PTH和雙膦酸鹽類聯(lián)合使用不同，雙膦酸鹽類抑制破骨細(xì)胞的活性的同時(shí)也會(huì)影響到PTH的成骨效果；而KKI抑制骨吸收且不影響到破骨細(xì)胞的數(shù)目，增加骨形成[11,12]，因此并不會(huì)影響PTH的作用，這種結(jié)果導(dǎo)致兩者聯(lián)合使用有疊加作用。

本次試驗(yàn)也有其局限性，首先實(shí)驗(yàn)大鼠數(shù)量有限，且時(shí)間較短，12w之后動(dòng)物骨質(zhì)疏松的具體情況不知。我們沒(méi)有進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制探索，但是這次試驗(yàn)從體外很好的證實(shí) PTH 聯(lián)合 KKI可以協(xié)同防治骨質(zhì)疏松，為其在臨床藥物方面提供了可能性。但目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中用于治療骨質(zhì)疏松藥物的效果較好，但是在人體這個(gè)復(fù)雜環(huán)境，且聯(lián)合使用PTH 和KKI治療骨質(zhì)疏松會(huì)進(jìn)一步增加治療成本，臨床上具體實(shí)施仍需進(jìn)一步研究。