去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型的制備與評價

彭珊 歐陽厚淦 趙志冬 盧文靜 高書亮

江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種以低骨量，破壞骨微結(jié)構(gòu)，增加骨脆性及骨折風(fēng)險性增加的骨代謝疾病，分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，多由雌激素缺乏及骨鈣下降造成[1]。本實驗通過制備去勢大鼠骨質(zhì)疏松模型，在去勢后的連續(xù)5天對其晨間陰道分泌物進行評價，為更好研究此癥提供基本理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，雌性，2-3月齡，64只，體重約：180-200 g。

1.2 動物分組與飼養(yǎng)

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按照隨機分組數(shù)字表將64只雌性大鼠分成兩組，模型組(50只)、正常組(14只)，自然飼養(yǎng)。

1.3 模型制備

模型組行雙側(cè)卵巢結(jié)扎摘除術(shù)：首先10% 水合氯醛(3 mL/)腹腔注射麻醉，剔除長毛，在固定板上俯臥位固定，取大鼠背側(cè)切口，即最末肋下、腋中線與距脊柱外側(cè)約2處，碘伏消毒切口及周緣皮膚，逐層切開皮膚、內(nèi)層肌肉約0.5-1，視野中可見一乳白色脂肪團并分離，可見粉紅色或黃紅色卵巢，絲線結(jié)扎卵巢根部下的輸卵管并摘除卵巢，逐層縫合肌肉和皮膚，碘伏消毒。同法摘除另一卵巢。術(shù)后肌肉注射青霉素(80萬單位，0.1 mL/只)1次/天，連續(xù)6天。去勢大鼠，分籠飼養(yǎng)。定期碘伏消毒雙側(cè)切口且保持干燥。正常組自然飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.4 評價方法

兩組實驗大鼠均于術(shù)后次晨(7:00-8:00)開始檢查陰道上皮角化細(xì)胞的變化，1次/天，連續(xù)5天。左手抓取大鼠，右手利用無菌棉簽進入陰道并輕旋棉簽一圈后順勢輕退，迅速將沾陰道分泌物的棉簽按同一方向置于滴有適量生理鹽水的載玻片上，待其自然風(fēng)干后滴加甲醇(以覆蓋分泌物為適量)，自然風(fēng)干，行瑞氏染色，鏡下觀察陰道上皮角化細(xì)胞變化，以證明去勢成功。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物的一般情況

實驗?zāi)Ｐ椭苽渲杏?只大鼠意外死亡，術(shù)后模型動物運動量減少，在同等外力下，較制備模型前更易乏力，甚至抽筋、骨折。

2.2 瑞氏染色

箭頭示意：紅色：白細(xì)胞；黃色：角化細(xì)胞；白色：有核上皮細(xì)胞。

圖1 ①模型組：動情間期：白細(xì)胞為主，有核上皮細(xì)胞少見; ②正常組：動情前期：膨大的角化上皮細(xì)胞與有核上皮細(xì)胞共存，偶見白細(xì)胞;③正常組：動情期：不規(guī)則角化上皮細(xì)胞聚集，少量有核上皮細(xì)胞或白細(xì)胞;④正常組：動情后期：三種細(xì)胞比例相當(dāng);⑤正常組：動情間期：細(xì)胞總數(shù)少，有核上皮細(xì)胞和白細(xì)胞共存，角化上皮細(xì)胞偶見。Fig.1 ①Model group: Diestrus: leukocytes dominate, nuclear epithelial cells are rare; ②Normal group: Proestrus: Coexistence of dilated cornified epithelial cells with nuclear epithelial cells, with occasional leukocytes;③Normal group: Estrus: Irregular cornified epithelial cells aggregated, small number of nuclear epithelial cells or leukocytes;④Normal group: Metoestrus: The proportion of the three types of cells are comparable;⑤Normal group: Diestrus: The total number of cells is small, coexistence of nuclear epithelial cells and leukocytes, with occasional angular epithelial cells

3 討論

眾所周知，骨質(zhì)疏松是由各種原因?qū)е鹿墙M織結(jié)構(gòu)破壞，常見破骨細(xì)胞活性較成骨細(xì)胞活性更強，最終新骨形成減少而骨吸收增多[2]。隨著我國老年人口劇增，患骨質(zhì)疏松癥的人口日益增加[3]。因此對于骨質(zhì)疏松的防治研究就迫在眉睫了，而通過動物實驗進行研究是極其重要的一條途徑，其中動物模型的建立又是重中之重。

目前關(guān)于骨質(zhì)疏松癥模型的制備方法繁多，首先從動物的選擇而言，目前包括：大小鼠、家兔、羊、狗、微型豬等，各有優(yōu)缺點，但制備此模型以大鼠最適，因為小鼠體型小，可取血樣少，微型豬可取血清多，但其體型過大，價格昂貴，卵巢不易切除；骨代謝隨季節(jié)而變的食草動物，其雙側(cè)卵巢切除后的骨丟失量與人類骨質(zhì)疏松癥的水平不符或短暫持續(xù)，甚至家兔骨密度降低多見軀干骨，而四肢骨未見；去睪丸狗所引起的骨吸收大于骨形成與人類骨質(zhì)疏松癥的水平相似，而去卵巢狗不能誘導(dǎo)此癥。

其次是誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的方法，主要有離體和在體兩種，以在體中的藥物誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥而言，此法有如下劣勢：周期長，造模影響因素繁多，低成功率，低再現(xiàn)性，適用范圍窄，停藥后實驗對象骨質(zhì)疏松癥可自行修復(fù)，與人類雌激素下降的臨床癥狀不符，結(jié)果可信度低；而在體中的去甲狀旁腺和下丘腦-垂體切除術(shù)均不易操作，周期不確定，易損傷周圍組織，主要以影響腸道對鈣的吸收和神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥，目前此法應(yīng)用較少。

鑒于此，選擇一種既利于操作又具有可信度的模型顯得尤為重要。目前，“去勢大鼠”是美國食品與藥品管理局和世界衛(wèi)生組織推薦研究雌激素水平下降形成骨質(zhì)疏松癥的模型，這種模型在研究絕經(jīng)后婦女發(fā)生骨質(zhì)疏松的病理過程已經(jīng)得到公認(rèn)[4, 5]。此類模型優(yōu)勢在于：大鼠飼養(yǎng)方便，價廉，去勢術(shù)簡便，高存活率，高成功率，易重復(fù)，易再現(xiàn)，周期短(15天)，適用廣泛，術(shù)后表現(xiàn)與人類骨質(zhì)疏松癥后的骨代謝、骨微結(jié)構(gòu)變化相似，因而最常選擇該法[6]。因此，終上所述，并根據(jù)實驗需要，我們也選用該種方法。因3月齡雌性大鼠性腺、內(nèi)分泌系統(tǒng)均發(fā)育成熟以及骨骼系統(tǒng)已形成基本構(gòu)架，從而本實驗選取此時期的大鼠[7]。

再次，在指標(biāo)選擇上也存在不同。有研究報道[8]，判斷去勢是否成功時，一般多以實驗動物骨密度(bone mineral density,BMD)、骨強度及生化指標(biāo)，但是由于年輕的大鼠缺少板層骨，皮質(zhì)骨缺少哈弗氏系統(tǒng)，并且在卵巢去除后實驗動物生命周期縮短、血量少、不可進行大量的采血取樣以及骨組織的活檢[7, 8]。因此本實驗采用觀察陰道上皮角化細(xì)胞非動情周期變化證明去勢成功，此法具有傷害小，簡便，周期短，結(jié)果客觀等優(yōu)勢。研究報道的雌性大鼠動情周期變化[9]與本實驗結(jié)果基本相同。動情前期膨大的角化細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞共存；動情期角化細(xì)胞聚集成片，而有核上皮細(xì)胞或白細(xì)胞卻極少；三種細(xì)胞均衡時進入動情后期；隨著角化細(xì)胞減少，白細(xì)胞逐漸增多且為主，即進入動情間期。本實驗連續(xù)5天晨間陰道分泌物涂片顯示：模型組均多見白細(xì)胞及有核上皮細(xì)胞少見，正常組首日以有核上皮細(xì)胞為主，白細(xì)胞和角化細(xì)胞均偶見進入動情前期；隨著有核上皮細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化成無核角化細(xì)胞及有核上皮細(xì)胞和白細(xì)胞極少見進入動情期；而隨著角化細(xì)胞的減少，另兩種細(xì)胞的增多，此時三種細(xì)胞單位面積比例相當(dāng)，證明此期為動情后期；最終無核角化細(xì)胞極少，白細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞共存后進入動情間期。此四期為連續(xù)性周期變化，即：動情前期→動情期→動情后期→動情間期，因而陰道分泌物的上皮角化細(xì)胞是漸變的，隨雌激素水平變化而變化。因此根據(jù)陰道分泌物涂片中的上皮角化細(xì)胞可準(zhǔn)確區(qū)分動情周期各階段，從而判定去勢是否成功。

因此，通過動物實驗進行骨質(zhì)疏松研究時，合理選擇實驗動物也極其重要。通過在動物身上模擬人類骨代謝性的變化，才能為人類研究骨質(zhì)疏松提供可靠的實驗依據(jù)，動物模型的研究只是人類研究OP的一種方法或手段，尚不能完全代表人類自身發(fā)生該病時的生理病理變化，在實驗前必須根據(jù)實驗?zāi)康幕蛘邔嶒瀮?nèi)容，查閱大量的文獻，合理選擇制備模型的方法?，F(xiàn)骨質(zhì)疏松模型建立的方法很多，以傳統(tǒng)的誘導(dǎo)性去勢動物模型為優(yōu)勢，如今通過基因敲除術(shù)制備的轉(zhuǎn)基因動物模型也日益受到關(guān)注。盡管如此，骨質(zhì)疏松動物模型的研究仍然需要更多的研究。