葛瑞林對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌組織及血液中TRX和ASK1表達(dá)的影響

徐建博 張茹冰 陳穎 陳哲 劉雋東 陳振棟

葛瑞林對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌組織及血液中TRX和ASK1表達(dá)的影響

徐建博 張茹冰 陳穎 陳哲 劉雋東 陳振棟

目的探討葛瑞林（Ghrelin）對(duì)慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌組織及血液中硫氧還蛋（TRX）和凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）表達(dá)的影響。方法選擇SD雄性大鼠60只，采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立大鼠CHF模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和觀察組，各30只。觀察組給予尾靜脈注射Ghrelin，對(duì)照組給予尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液。在第2、20、45天時(shí)，光鏡和電鏡觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)情況。第45天時(shí)，多道生理儀檢測(cè)左心室功能的變化情況；免疫組化法檢測(cè)TRX及pASK1表達(dá)水平；RT-PCR檢測(cè)TRX及ASK1mRNA表達(dá)水平。結(jié)果HE染色在第2、20、45天時(shí)，對(duì)照組心肌細(xì)胞損傷均比觀察組明顯。第45天時(shí)，對(duì)照組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷比觀察組更明顯；觀察組左心室射血分?jǐn)?shù)（EF）和左心室短軸縮短率（FS）較對(duì)照組高（均P＜0.05）；觀察組ASK1免疫組化面積比和ASK1 mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，TRX免疫組化面積比和TRXmRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（均P＜0.01）。結(jié)論Ghrelin可下調(diào)CHF心肌組織中ASK1的表達(dá)，上調(diào)TRX表達(dá)，從而改善CHF心臟生物學(xué)功能。

心力衰竭心肌病理學(xué)心肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡

慢性心力衰竭（CHF）是臨床中常見(jiàn)的心血管疾病，是心血管病的最終歸宿[1]。數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)CHF的患病率約為0.9%，且女性多于男性，臨床上對(duì)CHF難以逆轉(zhuǎn)治療。隨著CHF被作為醫(yī)學(xué)界重點(diǎn)研究的課題，目前CHF的治療途徑已有本質(zhì)轉(zhuǎn)變[2]。凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）是近來(lái)研究比較熱門(mén)的一種細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，它在機(jī)體功能作用上起到非常重要的作用。心肌組織中硫氧還蛋（TRX）具有抗凋亡、抗氧化、抗炎、保護(hù)再灌注損傷等作用。葛瑞林（Ghrelin）是從胃黏膜分離純化的多肽生長(zhǎng)激素促分泌受體（GHSR）釋放肽，研究證明Ghrelin具有明顯的心血管保護(hù)作用[3]。Ghrelin可上調(diào)TRX及下調(diào)ASK1的表達(dá)，達(dá)到改善心功能作用。本研究通過(guò)對(duì)CHF大鼠進(jìn)行Ghrelin干預(yù)治療，旨在為CHF的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料健康成年SD大鼠（體重250g左右）60只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，每籠飼養(yǎng)5～6只，自由攝食及飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃左右，相對(duì)濕度50%左右，光照明暗時(shí)間比為1∶1。主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：TGL-10K離心機(jī)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）、RM2265切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）、FA2204C電子天平（常州杰博森儀器有限公司）、UV-2000紫外分析儀（上?？茖W(xué)儀器廠生產(chǎn)）、DYCZ-20A電泳槽（北京市六一儀器廠制造）、JEM-1400透射電子顯微鏡（日本電子公司），Ghrelin[吉爾生化（上海）有限公司，批號(hào)：20140307，規(guī)格：5mg]、D-Lys3-GHRP-6（美國(guó)Cell Signaling公司，批號(hào)：150509NOP，規(guī)格：5mg）、ASK1（美國(guó)Cell Signaling公司，批號(hào)：20140907，規(guī)格：96T）、TRX（美國(guó)Cell Signaling公司，批號(hào)：20140313，規(guī)格：96T），引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組采用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支建立大鼠CHF模型，所有大鼠禁食12h，禁水6h后，按照3.0ml/kg標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后通過(guò)手術(shù)將心臟輕擠出，用0號(hào)無(wú)損傷線結(jié)扎大鼠的左前降支，從左向右進(jìn)針（深度0.3cm，寬度0.2cm），快速縫扎小束心肌，觀測(cè)搏動(dòng)減弱、左心室前壁部分顏色變淺，則模型建立成功，術(shù)后給予大鼠青霉素預(yù)防感染及保溫，完全蘇醒后送回鼠籠飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對(duì)照組，各30只，術(shù)后12h，對(duì)照組尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液[25μg/（kg·d）]，觀察組尾靜脈注射Ghrelin[25μg/（kg.d）]，給藥周期：模型制備成功后第2～45天。

1.2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察分別在第2、20、45天時(shí)，每組取大鼠10只，麻醉（10%水合氯醛）后開(kāi)胸，在左心房注射5ml 10%氯化鉀，取出心臟并固定（4%多聚甲醛）24～ 48h，切片（厚度：2～3mm）后制作成石蠟，4℃?zhèn)浯妗⒑穸?μm的切片經(jīng)HE染色后光鏡觀察。取大鼠心肌組織作為標(biāo)本，切成長(zhǎng)條（1mm×1mm×2mm），2.5%戊二醛和1 %的四氧化鋨進(jìn)行固定，梯度丙酮脫水進(jìn)行樹(shù)脂包埋，將超薄切片（60nm）采用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重電子染色15min，采用透射電鏡（加速電壓：60～80kV，放大倍數(shù)：6 000～20 000倍），觀察其心肌組織的超微結(jié)構(gòu)。1.2.3心肌組織中TRX和ASK1表達(dá)檢測(cè)

1.2.3.1采用免疫組織化學(xué)方法觀測(cè)心肌中TRX和ASK1的表達(dá)將石蠟包埋組織切片（厚度3μm），常規(guī)脫蠟后，加入3%過(guò)氧化氫溶液50μl，在恒溫箱（20℃）孵育10min，對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性進(jìn)阻斷，PBS沖洗3次，加入50μl的一抗，4℃下過(guò)夜后，加入二抗，20℃下孵育15min，取DBA試劑盒中的A、B、C試劑加至切片顯色，放入顯微鏡下觀察，顯色后用純凈水洗掉，終止顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。以免疫組化陽(yáng)性染色面積比來(lái)表示TRX及ASK1的表達(dá)水平。

1.2.3.2采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)心肌組織中TRX和ASK1 mRNA的表達(dá)（1）取各組大鼠心肌組織100mg，放置在-70℃冰箱備存；（2）嚴(yán)格按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取心肌組織總RNA；（3）采用Access RT-PCR系統(tǒng)將組織總RNA擴(kuò)增成DNA目的片段；（4）PCR產(chǎn)物經(jīng)EB染色和2%瓊脂糖凝膠電泳后，采用紫外分析儀進(jìn)行觀察，并采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，用TRX和ASK1 mRNA與GAPDH的灰度比值表示TRX和ASK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 多道生理儀檢測(cè)左心室功能的變化情況第45天時(shí)測(cè)兩組左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）與左心室短軸縮短率（LVFS）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，測(cè)得計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組組織形態(tài)學(xué)比較光鏡觀察顯示，第2、20、45天時(shí)，對(duì)照組心肌結(jié)構(gòu)破壞比觀察組嚴(yán)重，梗死部位心肌組織比觀察組變的更薄，毛細(xì)血管比觀察組減少明顯；電鏡觀察結(jié)果顯示，第45天時(shí)對(duì)照組心肌纖維斷裂比觀察組重，心肌纖維化比觀察組更明顯（圖1）。

2.2 兩組LVEF和LVFS比較第45天時(shí)，觀察組LVEF和LVFS分別為（48.93±1.15）%、（26.54±1.04）%，對(duì)照組LVEF和LVFS分別為（36.72±1.27）%、（18.64± 1.12）%，觀察組均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖1 兩組組織形態(tài)學(xué)比較（a、c、e分別為第2、20、45天時(shí)光鏡下對(duì)照組心肌組織形態(tài)學(xué)，b、d、f分別為第2、20、45天時(shí)光鏡下觀察組組心肌組織形態(tài)學(xué)；g為電鏡下第45天時(shí)對(duì)照組心肌組織超微結(jié)構(gòu)情況，h為觀察組心肌組織超微結(jié)構(gòu)情況）

圖2 第45天時(shí)兩組大鼠LVEF和LVFS比較

2.3 第45天時(shí)兩組大鼠TRX和ASK1表達(dá)情況比較見(jiàn)表1、圖3。

表1 第45天時(shí)兩組大鼠的TRX和ASK1表達(dá)比較

由表1、圖3可見(jiàn)，觀察組ASK1免疫組化面積比和ASK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，TRX免疫組化面積比和TRX mRNA明顯高于對(duì)照組（均P＜0.01）。

圖3 第45天時(shí)兩組大鼠TRX和ASK1表達(dá)情況（a為觀察組ASK1免疫組化情況，b為對(duì)照組ASK1免疫組化情況，c為觀察組TRX免疫組化情況，d為對(duì)照組TRX免疫組化情況）

3 討論

隨著我國(guó)社會(huì)老齡化程度不斷加劇，CHF的發(fā)病率也隨之不斷增長(zhǎng)。CHF是臨床上一種常見(jiàn)的復(fù)雜性綜合征，具有很高的病死率，患者5年生存率與癌癥相接近[4]。CHF誘發(fā)原因較多，可包括感染、體力勞動(dòng)過(guò)重、心律失常、情緒激動(dòng)、輸血或輸液過(guò)快過(guò)量、嚴(yán)重貧血、大出血等原因從而使心臟負(fù)荷加重，心臟舒縮功能發(fā)生異常，出現(xiàn)血管舒縮功能異常和循環(huán)血量障礙[5]。CHF的主要病理機(jī)制為內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致心室重構(gòu)。很多研究顯示，心內(nèi)的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)通過(guò)嚴(yán)密精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制，使各種細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素及神經(jīng)肽等信息分子相互刺激和制約，從而達(dá)到系統(tǒng)內(nèi)部相對(duì)穩(wěn)定及自我調(diào)節(jié)[6]。在CHF發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，諸多誘因會(huì)使心肌受損，并使三大系統(tǒng)之間穩(wěn)定性遭到繼發(fā)性破壞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及心室重構(gòu)，形成不可逆的惡性循環(huán)。目前CHF的生物學(xué)治療已成為熱門(mén)的研究課題。

ASK1是有絲分裂原激活蛋白激酶的上游激酶，是細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK）家族成員之一[7]。ASK1在正常的細(xì)胞中會(huì)受多種蛋白調(diào)控，通常為無(wú)活性狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生病理變化時(shí)，ASK1結(jié)合蛋白發(fā)生系列改變，從而ASK1被激活，并對(duì)炎性細(xì)胞因子及應(yīng)激刺激作出應(yīng)答，進(jìn)而激活SEKI-JNK及MKK3/MKK6-p38，發(fā)生信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，成為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[8]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ASK1會(huì)參與心肌細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)、增殖、分化、炎癥反應(yīng)及凋亡，通過(guò)激活JNK（ASK1-MKK4/MKK7-JNK）和p38（ASK1-MKK3/ MKK6-P38MAPK），并通過(guò)凋亡途徑進(jìn)而誘導(dǎo)CHF的發(fā)生與發(fā)展。

TRX系統(tǒng)主要包括TRX、TRX還原酶（TRXR）及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），是一種對(duì)抗氧化應(yīng)激的二硫還原酶系統(tǒng)[9]。TRX系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞存活及功能而言不可或缺，并在細(xì)胞死亡、病毒感染及免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。TRX是細(xì)胞內(nèi)一種具有多種生物學(xué)功能的主要抗氧化劑，且分布廣泛[10]。TRX可通過(guò)參與機(jī)體氧化還原反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞的生存和增殖產(chǎn)生影響，并對(duì)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，參與心肌組織的應(yīng)激反應(yīng)，在CHF的病理生理過(guò)程中起到重要作用。TRX與ASK1關(guān)系密切，是調(diào)控ASK1的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是ASK1的內(nèi)源性抑制劑，機(jī)體正常時(shí)，兩者會(huì)緊密結(jié)合，當(dāng)受到炎性細(xì)胞因子及應(yīng)激刺激時(shí)，兩者的結(jié)合發(fā)生松動(dòng)，從而使ASK1被分離激活。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TRX可降解ASK1，并對(duì)ASK1的活性化產(chǎn)生抑制[11]。

上世紀(jì)90年代在胃組織中成功提取出Ghrelin，它可刺激機(jī)體的食欲，增加攝食量，進(jìn)而影響脂肪和能量代謝，并會(huì)劑量依賴性調(diào)節(jié)胃酸分泌和胃腸蠕動(dòng)；Ghrelin可增強(qiáng)機(jī)體的免疫及抗炎能力[12]。本研究結(jié)果顯示，第45天時(shí)，觀察組LVEF和LVFS明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），這是因?yàn)镚hrelin會(huì)對(duì)血管產(chǎn)生擴(kuò)張作用，從而減輕后負(fù)荷，改善心臟泵血功能，增加LVEF和LVFS，并對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用，從而改善心臟功能。本研究結(jié)果顯示，在第2、20、45天時(shí)，通過(guò)光鏡可觀察到對(duì)照組心肌細(xì)胞損傷均比觀察組更明顯；且電鏡發(fā)現(xiàn)對(duì)照組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷要比觀察組更明顯，這可能是因?yàn)樽⑸銰hrelin后會(huì)維持機(jī)體代謝平衡，CHF大鼠的平均動(dòng)脈壓可受到Ghrelin調(diào)節(jié)，并能使平均動(dòng)脈壓降低；Ghrelin可有效抗細(xì)胞增殖，可代償性地抑制平滑肌細(xì)胞的增生及遷移，減輕心肌損傷并改善心肌萎縮，從而減緩CHF的進(jìn)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第45天時(shí)，兩組大鼠TRX和ASK1表達(dá)情況，觀察組ASK1免疫組化面積比和ASK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，TRX免疫組化面積比和TRX mRNA明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），這可能因?yàn)镚hrelin具有抗炎作用，與抑制IL-8、氧化應(yīng)激及細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)；有研究發(fā)現(xiàn)，血清活性Ghrelin的水平與氧化應(yīng)激呈負(fù)相關(guān)，Ghrelin可間接加固TRX與ASK1的結(jié)合，同時(shí)促進(jìn)TRX的釋放效應(yīng)，從而降低ASK1的活化。

綜上所述，Ghrelin對(duì)CHF大鼠心臟功能不全或損傷均具有改善作用，可上調(diào)肌組織中TRX并降低ASK1表達(dá)，為臨床CHF的治療提供理論依據(jù)。

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Effect of Ghrelin on expression of TRX and ASK1 in myocardium and blood of chronic heart failure rats

XU Jianbo,ZHANG Rubing, CHENYing,et al.Department of Critical Care Medicine,First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154002,China

ObjectiveTo investigate the effect of Ghrelin on the expression of thioredoxin(TRX)and apoptotic signal kinase 1(ASK1)in myocardium and blood of chronic heart failure(CHF)rats.MethodsCHF was induced by ligating the left anterior descending coronary artery in 60 male SD rats,then the CHF rats were randomly divided into two groups with 30 animals in each.CHF rats in study group were treated with intravenous injection of Ghrelin;those in control group were treated with intravenous injection of normal saline.The myocardium morphology andultrastructure were observed by light and electron microscopy on d2,d20 and d45 after CHF induced;left ventricular function was evaluated by polygraphy;expression of TRXand ASK1 proteins in myocardial tissue were detected by immunohistochemistry;the expression of TRX and ASK1 mRNA was detected by RT-PCR.ResultsThe myocardial injury of rats on d2,d20 and d45 after modeling in control group was more severe than that in study group.Electron microscopy also showed that the myocardial damage on d45 in control group was more severe than that in study group.(P＜0.05);the left ventricular ejection fraction(LVEF)and left ventricular fraction shortening(LVFS) in study group were higher than those in the control group(P＜0.05).The immunohistochemical ASK1 positive area and the expression ASK1 mRNA in myocardia tissue on d45 in the study group were lower than those in the control group,wile the immunohistochemical TRXpositve area and the expression of TRXmRNA in myocardial tissue were significantly higher than those in the control group(P＜0.05).ConclusionGhrelin can downregulate ASK1 expression and upregulate TRX expression in CHF myocardium,and decrease the content of ASK1 and increase the content of TRX in the blood,so as to improve the biological function of CHF.

Heart failureMyocardiumPathologyCardiac muscle cellsApoptosis

2017-02-27）

（本文編輯：沈昱平）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.13.2017-394

黑龍江省教育廳基礎(chǔ)研究類（自然類）面上項(xiàng)目（JMSUJCM2016-048）

154002佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

陳振棟，E-mail：chenzhendong0507@163.com