Foxp3蛋白泛素化在急性期川崎病中的改變及意義

曹亞船

【摘要】目的：探討急性期川崎病Foxp 3的改變及意義。方法：選取我院接診急性期川崎病住院患兒18例，另選取健康兒童15例，抽取入組兒童靜脈血，采用流式細胞術(shù)行FOXP 3蛋白及泛素化相關(guān)因子測定。結(jié)果：川崎病組Foxp 3、USP7表達低于對照組，STUB1、HSP70、pSTAT3表達高于對照組（P<0.05）；治療后，F(xiàn)oxp 3、USP7表達高于治療前，STUB1、HSP70、pSTAT 3表達低于治療前（P<0.05）。結(jié)論：急性期川崎病患兒FOXP 3蛋白泛素化會出現(xiàn)明顯改變，治療后FOXP 3蛋白泛素化表達有所改善，即在川崎病發(fā)病中，F(xiàn)OXP 3蛋白泛素化與其存在明顯關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】急性期川崎病；FOXP3；泛素化

調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）主要是指具備免疫調(diào)節(jié)功能的CD4+T細胞亞群，其在對免疫耐受的誘導(dǎo)以及免疫自穩(wěn)的維持中發(fā)揮著非常重要的作用。插頭狀蛋白（FOXP3）主要表達于Treg亞群，其可直接影響Treg的發(fā)育、分化以及免疫功能，為此，F(xiàn)OXP3的穩(wěn)定性及表達直接影響著Treg的功能和數(shù)量。泛素化是非常多見的翻譯后多肽修飾，其能夠在靶蛋白特定區(qū)域內(nèi)實現(xiàn)泛素標(biāo)記，使靶蛋白能夠輸送到蛋白酶體內(nèi)，并因此發(fā)生降解處理。近幾年來，關(guān)于川崎病發(fā)病機制中，Treg作用是其中熱點話題，但引起Treg功能異常與數(shù)量改變的分子機制卻尚不明確。為此，本研究擬對急性期川崎病FOXP3蛋白泛素化的變化進行研究，以此實現(xiàn)對川崎病免疫發(fā)病機制的揭示，有關(guān)情況報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

我院2010年1月-2015年12月共接診18例急性期川崎病住院患兒，所有患兒均符合日本川崎病研究會所擬定的診斷標(biāo)準。其中女孩7例，男孩11例，年齡為（2.95±1.24）歲，病程為（5.27±1.35）d。另從同期健康體檢兒童中選取15例健康兒童作為對照組。兩組兒童性別、年齡均無顯著差異（P>O.05），具有可比性。

1.2方法

1.2.1檢測方法

（1）標(biāo)本收集：對兩組兒童行外周靜脈血采集，各取5mL，均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取，置于乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA.Na2）行抗凝處理，30min后，行血漿分離、流式抗體孵育、RNA提取以及eDNA制備等。（2）流式細胞術(shù)（FCM）檢測：根據(jù)流式細胞儀說明書與人全血調(diào)節(jié)性T細胞檢測試劑盒要求進行嚴格操作，即對T細胞表面抗原CD4、CD25以及細胞核內(nèi)抗原Foxp3進行標(biāo)記處理，并完成CD4+CD25+FOXP3（Tregs）細胞數(shù)的計算。另取通過流式軟件Diva V6.1.3對細胞內(nèi)STUB1、USP7、HSP70、pSTAT3蛋白表達進行計數(shù)。

1.2.2臨床治療

為患兒提供靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）沖擊治療，每日1次，連續(xù)2d，總量2g/kg；同時口服大劑量阿司匹林，每日30-50mg/kg。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

以統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS17.0分析處理，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差（x+s）表示，t值檢驗，若P<0.05即表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組FOXP3蛋白及泛素化相關(guān)因子表達

川崎病組Foxp3及泛素化相關(guān)因子STUB1、USP7、HSP70、pSTAT3表達與對照組比較均有顯著差異（P<0.05），見表1。

2.2川崎病患兒治療前后FOXP3蛋白及泛素化相關(guān)因子表達

川崎病患兒治療前后Foxp3及泛素化相關(guān)因子STUB1、USP7、HSP70、pSTAT3表達比較均有顯著差異（P<0.05），見表2。

3討論

川崎病是一種免疫相關(guān)性疾病，當(dāng)其處于急性階段時，其免疫功能處于全面活化的狀態(tài)下，表現(xiàn)為T細胞數(shù)量異常增多、急性期外周MC增多以及B細胞異常活化等，患兒血漿中存在著大量的黏附因子、炎性因子以及趨化因子等均會表現(xiàn)為非常明顯的升高。

Foxp3主要用于對Treg亞群進行表達，可作用于Treg發(fā)育、分化和免疫功能的維持，為此，F(xiàn)oxp3蛋白表達水平及其穩(wěn)定性可直接影響Treg功能，而在Foxp3蛋白泛素化中，又直接受到STUB1、HSP70、USP7等的影響。本研究通過對急性期川崎病患兒細胞Foxp3蛋白進行測定，結(jié)果顯示，其表達水平明顯低于對照組，但其大多數(shù)泛素化相關(guān)因子水平卻出現(xiàn)了明顯升高。這一結(jié)果表明，急性期川崎病患兒Foxp3蛋白呈現(xiàn)為低表達，而泛素化卻呈現(xiàn)為高表達，出現(xiàn)這種情況可能與泛素化修飾介導(dǎo)蛋白異常降解有關(guān)。而針對調(diào)節(jié)Foxp3蛋白泛素化修飾分子機制目前尚無定論，且本研究也未得出結(jié)論，故有待進一步研究。

為進一步證實在川崎病發(fā)生、發(fā)展中，F(xiàn)oxp3蛋白泛素化相關(guān)因子在其中的作用，本研究為18例患兒提供WIG治療，結(jié)果顯示，F(xiàn)oxp3、USP7出現(xiàn)了明顯的升高，STUB1、HSP70、pSTAT3則出現(xiàn)了明顯下降（P<0.05）。這表明通過治療，可有效改善Foxp3蛋白泛素化相關(guān)因子表達，這可能是由于通過IVIG治療可實現(xiàn)Fe段與細胞表面受體的有機結(jié)合，從而實現(xiàn)對相關(guān)炎癥細胞因子產(chǎn)生以及DC成熟的抑制，并且還可促使TLRs表達因此下調(diào)等，從而促使免疫系統(tǒng)維持動態(tài)平衡。

綜上所述，在急性期川崎病發(fā)生、發(fā)展中，F(xiàn)oxp3蛋白泛素化起著重要作用，故可能是導(dǎo)致川崎病患兒Treg功能和數(shù)量異常的主要因素，而通過MG治療，則可對炎癥細胞因子進行有效抑制，從而有效緩解泛素化，從而達到恢復(fù)Treg功能和數(shù)量的作用。