“桂枝與白芍”藥對化學(xué)成分UPLC—Q/TOF—MS分析

陳永財(cái)++錢江輝++王彬輝++沙先誼

[摘要] 目的 采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q/TOF-MS）對“桂枝與白芍”藥對中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。方法 采用Agilent 1290 UPLC和YMC-Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱進(jìn)行快速物質(zhì)分離；流動相為乙腈-0.1%冰醋酸梯度洗脫；溫度：30℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測波長：254 nm；流速：0.3 mL/min；AB 5600質(zhì)譜使用ESI離子源分別在正離子與負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)。 結(jié)果 結(jié)合對照品確認(rèn)了8個化合物，通過質(zhì)譜信息與相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推測13個化學(xué)成分，對其進(jìn)行成分歸屬。其中主要含有沒食子酸、原兒茶酸等6種有機(jī)酸，芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等10種芍藥總苷單萜類化合物及香豆素類成分。 結(jié)論 采用UPLC-Q/TOF-MS確定“桂枝與白芍”藥對中的化學(xué)成分，為闡明“桂枝與白芍”藥對的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供有力的證據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 桂枝；白芍；藥對；UPLC-Q/TOF-MS；成分鑒定；物質(zhì)基礎(chǔ)

[中圖分類號] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（a）-0012-05

Chemical constituents analysis of the drug pair of "Cinnamomum cassia Presl and Paeoniae Radix Alba" by UPLC-Q/TOF-MS

CHEN Yongcai1 QIAN Jianghui2，3 WANG Binhui4 SHA Xianyi2，3

1.Department of Pharmaceutics， Hospital of TCM in Wenzhou City， Zhejiang Province， Wenzhou 325000， China； 2.Department of Pharmaceutics， School of Pharmacy， Fudan University， Shanghai 201203， China； 3.Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Fudan University， Shanghai 201203， China； 4.Department of Pharmaceutics， Affiliated Municipal Hospital of Taizhou Medical College， Zhejiang Province， Taizhou 318002， China

[Abstract] Objective To develop an ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometric （UPLC-Q/TOF-MS） method to analyze the chemical constituents in the drug pair of "Cinnamomum cassia Presl and Paeoniae Radix Alba". Methods Agilent 1290 UPLC machine and YMC-Triart C18 column （100 mm × 2.1 mm， 1.9 μm） were adopted to separate ingredients； the mobile phase was acetonitrile （A）-0.1% acetic acid solution （B） with gradient elution； the column temperature was 30℃； the inject volume was 5 μL； the detection wavelength was set at 254 nm； the flow rate was 0.3 mL/min； the mass spectrometer AB 5600 with an electrospray ionization （ESI） interface was under positive or negative mode for data collection. Results 8 compounds were identified by reference substance， 13 compounds were qualitative identified according to the MS/MS information， and the belonging of the main constituents had been confirmed. These compounds included six kinds of organic acid such as gallic acid and protocatechuic acid， tentotal paeoniflorin monoterpenes like paeoniflorin and albiflorin， and coumarins. Conclusion Determination of chemical composition of "Cinnamomum cassia Presl and Paeoniae Radix Alba" by UPLC-Q/TOF-MS in order to clarify the "Cinnamomum cassia Presl and Paeoniae Radix Alba" drug on the basis of the material to provide strong evidence.

[Key words] Cinnamomum cassia Presl； Paeoniae Radix Alba； Drug pair； UPLC-Q/TOF-MS； Compounds identification； Material basis

“桂枝與白芍”為典型的相制配伍，源于《傷寒論》之桂枝湯，為臨床常用的調(diào)和營衛(wèi)、溫通止痛藥對[1-2]?，F(xiàn)代研究證明，桂枝中桂皮醛、肉桂酸等成分，白芍中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等成分具有明顯藥理活性[3-4]，藥對功效物質(zhì)基礎(chǔ)不是二味藥疊加，而是二味藥不同成分相互作用形成的共同體[5]，可見全面分析核心“桂枝與白芍”藥對化學(xué)成分尤為關(guān)鍵。

本文采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-Q/TOF-MS），對“桂枝與白芍”藥對中的主要化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步闡明“桂枝與白芍”藥對的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供有力證據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent 1290超高液相色譜儀（安捷倫，美國）、AB 5600+Q-TOF高分辨質(zhì)譜儀（Applied Biosystems 美國）、Analyst？誖TF1.6采集數(shù)據(jù)、Peak View 2.0數(shù)據(jù)分析、色譜柱YMC-Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、分析天平（BT 25S，北京賽多利斯）、天平（BT 210S，北京賽多利斯）。

乙腈（色譜純AS1122-801 Tedia）、甲醇（色譜純MS1922-801 Tedia），其余試劑分析純。芍藥苷、桂皮醛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110736-201438、110710-201418），兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、芍藥苷內(nèi)酯、沒食子酸乙酯、丁香醛、香豆素、肉桂酸、丹皮酚對照品（上海同田制藥，批號：15082731、15033122、15090235、15051322、15010332、15072821、15012321、15072141、15051935、15072836）。 桂枝、白芍中藥飲片（浙江華宇中藥飲片有限公司，批號：1503190、1505100），經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張水利教授鑒定桂枝為樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥嫩枝，白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall）的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

色譜條件：Agilent 1290 UPLC，YMC-Triart C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），流動相乙腈-0.1%冰醋酸水梯度洗脫見表1[6-7]；溫度：30℃；檢測波長：254 nm；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧（ESI）源，正負(fù)離子模式；霧化氣（Gas1）：50 psi；輔助加熱氣（Gas2）：50 psi；氣簾氣（Curtain Gas）：30 psi；離子源溫度：550℃；正負(fù)電壓：5500V/-4500V；去簇電壓（DP）：±80V；碰撞電壓（CE）：±40V；一級MS掃描范圍：50～1000；二級MS/MS掃描范圍：50～1000。

2.2 混合對照品溶液制備

分別精密稱芍藥苷、桂皮醛、兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、芍藥苷內(nèi)酯、沒食子酸乙酯、丁香醛、香豆素、肉桂酸、丹皮酚12種對照品10 mg，用甲醇配成1 mg/mL母液。取上述各對照品母液200 μL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，配制成混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 “桂枝與白芍”藥對水煎液提取物制備

按“桂枝與白芍”藥對（1∶1）取桂枝90 g、白芍90 g，按正交優(yōu)選條件[8]加水量10倍、浸泡60 min、煮沸后微火煎煮60 min，合并2次提取液，過濾，減壓濃縮并調(diào)整濃度至（1∶6）浸膏備用，精密稱100 mg浸膏，加50%乙腈水溶液10 mL，渦旋1 min，超聲5 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。

2.3.2 桂枝和白芍單味水煎液提取物制備

稱桂枝90 g和白芍90 g分別單獨(dú)煎煮，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備單味桂枝和單味白芍供試品。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS化學(xué)成分鑒定

“桂枝與白芍”藥對（1∶1）水煎液中成分進(jìn)行快速分離鑒定，得到質(zhì)譜總離子流圖（TIC）如圖1。有機(jī)酸類和芍藥苷類物質(zhì)在ESI-MS負(fù)離子條件下響應(yīng)更高，質(zhì)譜結(jié)構(gòu)分析以ESI-解析為主。

2.4.1 對照品化學(xué)成分鑒定

通過對照品出峰時間、一級質(zhì)譜分子量和二級質(zhì)譜MS/MS碎片峰離子分析鑒定，從12個對照品中鑒定出“桂枝與白芍”藥對（1∶1）水煎液有8個化合物（表2），桂枝和白芍單味水煎液分別按同樣質(zhì)譜條件分析，其中沒食子酸、原兒茶酸為兩味中藥共有成分。

2.4.2 化學(xué)成分鑒定

采用質(zhì)譜分析軟件Peak View的Fomular Finder和Master View兩種功能對主要出峰化合物進(jìn)行鑒別，通過化合物質(zhì)譜裂解特征、一二級質(zhì)譜圖、同位素豐度等比對分析，并參考文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫資料后推測[9]。

2.4.2.1 ESI-模式成分鑒定 “桂枝與白芍”藥對（1∶1）水煎液ESI-成分鑒定具體見表3。

tR為2.920 min在ESI-下準(zhǔn)分子離子峰m/z為495.1508[M-H]-，特征離子峰m/z 137為對羥基苯甲酸，m/z 165為蒎烷基本骨架；分子離子脫去糖苷為m/z 333[M-C6H10O5-H]-；分子離子脫去甲醛為m/z 465[M-CH2O-H]-等離子峰與文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此推斷該化合物為氧化芍藥苷[10]。

tR為3.568 min在ESI-下準(zhǔn)分子離子峰m/z為525.1603[M-H]-，脫去一分子甲醛為m/z 495[M-CH2O-H]-，再脫去水為m/z 479[M-CH2O-H2O-H]-；其中特征離子峰m/z 167為C8H7O4；分子離子脫去糖苷為m/z 345[M-C6H12O6-H]-；m/z 363[M-C6H12O6-H]-等離子峰與文獻(xiàn)報(bào)道一致，因此推斷該化合物為牡丹皮苷E[11]。

tR為3.872 min在ESI-下準(zhǔn)分子離子峰m/z為687.2131[M+COOH]-，特征離子峰為苯甲酰m/z 121，脫去苯甲?；鶠閙/z 519[M-C7H5O2-H]-，再脫去CO2為m/z 475[M-C7H5O2-CO2-H]-；分子脫去糖苷和苯甲酰基為m/z 195[M-2Glu-C7H5O2-H]-，因此推斷該化合物為6'-O-β-glucopyranosyl-albiflorin[12]。

tR為5.174 min在ESI-下準(zhǔn)分子離子峰m/z為687.2131[M+COOH]-，特征離子峰為苯甲酰m/z 121，脫去苯甲?；鶠閙/z 519[M-C7H5O2-H]-，再脫去甲醛為m/z 489[M-C7H5O2-CH2O-H]-；脫去甲醛為m/z 611[M-CH2O-H]-；脫去糖苷和苯甲?；鶠閙/z 195[M-2Glu-C7H5O2-H]-，因此推斷該化合物為β-gentiobiosylpaeoniflorin[13]。

tR為7.295 min和10.588 min在ESI-下準(zhǔn)分子離子峰m/z為525.1602[M+COOH]-，其中7.295 min通過對照品確認(rèn)為芍藥苷。特征離子峰為苯甲酰m/z 121，蒎烷基本骨架m/z 165，苯環(huán)基本骨架m/z 77；脫去甲醛為m/z 449[M-CH2O-H]-，再脫去水為m/z 431[M-CH2O-H2O-H]-；脫去一份子苯甲?；鶠閙/z 357[M-C7H5O2-H]-；脫去糖苷為m/z 327[M-C6H12O5-H]-[10]。而14.810 min斷裂方式與芍藥苷相同，因此推斷為芍藥苷同分異構(gòu)體。

tR為12.167 min在ESI-下準(zhǔn)分子離子峰m/z為631.1689[M-H]-，特征離子峰為沒食子酰m/z 169，沒食子酰脫去一個CO2特征峰m/z 125和沒食子酰與糖苷結(jié)合物碎片峰m/z 313；脫去苯甲?；鶠閙/z 509[M-C7H5O2-H]-，再脫去水為m/z 491[M-C7H5O2-H2O-H]-。根據(jù)元素組成分子式為C30H32O15，因此推斷該化合物為沒食子酰芍藥苷[10]。

tR為14.810 min在ESI-下準(zhǔn)分子離子峰m/z為525.1621[M+COOH]-，特征離子峰m/z 283為[M-CO2-C7H5O2-H]-，其中CO2為內(nèi)酯環(huán)斷裂失去酯基與芍藥苷內(nèi)酯相同，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道推斷該化合物為同分異構(gòu)體芍藥內(nèi)酯苷R1[14]。

tR為17.782 min在ESI-下準(zhǔn)分子離子峰m/z為263.1362[M-H]-，特征離子峰為m/z 119和m/z 136；脫去CO2為m/z 219[M-CO2-H]-，再脫去甲基為m/z 204[M-CO2-CH3-H]-，再脫去甲基為m/z 189[M-CO2-2CH3-H]-。根據(jù)元素組成分子式為C15H20O4，因此推斷該化合物為sydowic acid。

tR為22.896 min在ESI-下準(zhǔn)分子離子峰m/z為629.1865[M+COOH]-，特征離子峰為苯甲酰m/z 121，苯環(huán)特征峰m/z 77和蒎烷骨架峰m/z 165；分子脫去氫為m/z 583[M-H]-，再脫去甲醛為m/z 553[M-CH2O-H]-，再脫去水為m/z 535[M-CH2O-H2O-H]-[10]。根據(jù)元素組成分子式為C30H32O12，因此推斷該化合物為苯甲酰芍藥苷。

tR為28.098 min在ESI-下準(zhǔn)分子離子峰m/z為296.1049[M-H]-，苯環(huán)特征峰m/z 77；分子脫去水為m/z 277[M-H2O-H]-，再脫去CO2為m/z 233[M-CO2-H2O-H]-。根據(jù)元素組成分子式為C18H16O4，因此推斷該化合物為吐昔酸。

2.4.2.2 ESI+模式成分鑒定 “桂枝與白芍”藥對（1∶1）水煎液ESI+成分鑒定具體見表4。

tR為14.469 min在ESI+下準(zhǔn)分子離子峰m/z為147.0441[M+H]+，特征離子峰為苯環(huán)m/z 77；分子脫去CO2為m/z 103[M-CO2+H]+，炔基斷裂失去碳原子為m/z 91。根據(jù)元素組成分子式為C9H6O2，因此推斷該化合物為苯基丙酸。

tR為17.747 min在ESI+下準(zhǔn)分子離子峰m/z為161.0698[M+H]+，特征離子峰為苯環(huán)m/z 77；分子脫去一個甲基為m/z 146[M-CH3+H]+，再脫去一氧化碳為m/z 118[M-CH3-CO+H]+[15]。根據(jù)元素組成分子式為C10H8O2，因此推斷該化合物為甲基香豆素。提取22.211 min分子離子峰m/z為161[M+H]+，MS/MS結(jié)構(gòu)相似，推測為甲基香豆素同分異構(gòu)體。根據(jù)出峰時間推斷17.747 min為6-甲基香豆素，22.211 min為7-甲基香豆素。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用傷寒論中“桂枝湯”煎煮方法[2]，按正交試驗(yàn)優(yōu)選條件提取水煎液中僅含極少量桂皮醛[8]等揮發(fā)油，可減壓濃縮過程中揮發(fā)油被耗散殆盡，因此“桂枝與白芍”藥對供試樣品中未發(fā)現(xiàn)桂皮醛色譜峰。

本實(shí)驗(yàn)建立“桂枝與白芍”藥對水煎液UPLC-Q-TOF/MS快速分析的方法，基于化合物譜裂解特征、相關(guān)數(shù)據(jù)庫和參考文獻(xiàn)，鑒定了“桂枝與白芍”藥對水煎液中21個化合物，其中主要含有沒食子酸、肉桂酸等6種有機(jī)酸和芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷及其同分異構(gòu)體等10種芍藥總苷單萜類化合物及香豆素類成分?，F(xiàn)代研究證明，沒食子酸、肉桂酸、芍藥總苷、香豆素等成分具有明顯藥理活性[16-20]，可見“桂枝與白芍”藥對水煎液中有機(jī)酸、芍藥總苷單萜類、香豆素類等化學(xué)成分為“桂枝與白芍”藥對的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2017-02-11 本文編輯：李亞聰）