孟魯司特鈉對支氣管哮喘患兒Th17/Treg細胞平衡及肺功能的影響

郝 珉，宋 文，路 苓

（棗莊市立醫(yī)院兒科，山東棗莊277100）

孟魯司特鈉對支氣管哮喘患兒Th17/Treg細胞平衡及肺功能的影響

郝 珉，宋 文，路 苓

（棗莊市立醫(yī)院兒科，山東棗莊277100）

目的觀察孟魯司特鈉對支氣管哮喘患兒Th17/Treg細胞平衡及肺功能的影響。方法選取120例支氣管哮喘患兒，隨機分為實驗組和對照組，每組60例。所有患兒給予丙酸氟替卡松等常規(guī)治療，實驗組加用孟魯司特鈉治療。分別于治療前和治療3個月后檢測和比較患兒的Th17、Treg細胞及其IL-17、IL-10和TGF-β1等細胞因子和肺功能。結果（1）所有患兒治療后Th17細胞及其分泌的IL-17水平和PEF肺功能指標均有顯著下降，Treg細胞及其分泌的IL-10和TGF-β1水平和FEV1、FEV1/FCV肺功能指標均有顯著升高（P＜0.01）。且經(jīng)過孟魯司特鈉治療的實驗組患兒的Th17細胞、IL-17水平和PEF的下降及Treg細胞、IL-10和TGF-β1水平、FEV1和FEV1/FCV的升高較對照組患兒更為明顯（P＜0.05或0.01）。（2）Th17細胞與Treg細胞呈負相關（P＜0.05）。Th17細胞與FEV1、FEV1/FCV呈負相關，與PEF呈正相關；而Treg細胞與FEV1、FEV1/FCV呈正相關，與PEF呈負相關（P＜0.05）。結論孟魯司特鈉可有效調節(jié)支氣管哮喘患兒的Th17/Treg細胞平衡，改善其肺功能，且Th17/Treg細胞與肺功能存在相關性。

孟魯司特鈉；支氣管哮喘；Th17；Treg；肺功能

支氣管哮喘是一種常見的變態(tài)反應性疾病，其發(fā)病機制非常復雜，是多種免疫因素參與發(fā)病過程。Th1/Th2失衡是哮喘最經(jīng)典的免疫學說，但近年來的研究表明Th17、調節(jié)性T（Treg）細胞在其發(fā)病中亦發(fā)揮著重要的作用。Th17細胞可通過其分泌的IL-17等效應因子可以刺激哮喘炎癥反應，加重氣道高反應性；而Treg細胞通過其分泌的IL-10、TGF-β1等效應因子則發(fā)揮著免疫抑制作用。Th17和Treg細胞的作用相互拮抗，兩者失衡將加重氣道炎癥，導致哮喘發(fā)作[1-2]。孟魯司特鈉作為白三烯受體拮抗劑，可以通過抑制炎癥反應及氣道重塑，達到控制哮喘的目的。本研究通過觀察孟魯司特鈉與支氣管哮喘患兒Th17/Treg細胞平衡的關系，探討其可能的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2013年1月～2015年1月在3所醫(yī)院兒科哮喘門診初診的120例支氣管哮喘患兒，均符合2008年中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組修訂的“兒童支氣管哮喘診斷標準”。所有患兒來診前均無糖皮質激素吸入治療史，不伴有急性感染，1個月內無口服或靜脈使用糖皮質激素等調節(jié)免疫藥物，不伴有其他免疫性疾病。120例患兒隨機分為實驗組和對照組，每組60例。兩組患兒的性別構成、年齡及疾病嚴重程度比較差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

1.2 治療方法所有患兒給予丙酸氟替卡松吸入氣霧劑（輔舒酮，葛蘭素史克制藥，國藥準字：H20010387）吸入治療，初始劑量為50μg或100μg bid，然后根據(jù)治療效果調整劑量至哮喘控制或降低至最小有效劑量。哮喘急性發(fā)作期可給予沙丁胺醇（萬托林，葛蘭素史克制藥，國藥準字：H10940001）、異丙托溴銨（愛全樂，德國Boehringer Ingelheim Pharma GmbH&Co.KG，國藥準字：J20130135）等吸入治療。實驗組患兒每天加用4 mg孟魯司特鈉咀嚼片（順爾寧，Merck Sharp&Dohme Limited，國藥準字：J20070058），睡前口服。分別于治療前和治療3個月后檢測和比較患兒的Th17/Treg細胞及其細胞因子和肺功能。

1.3 檢測方法

1.3.1 Th17、Treg細胞的檢測[3]

（1）制備單個核細胞（PBMC）。抽取5 mL患兒靜脈血，置肝素抗凝管中。離心后取血漿置-80℃冷凍保存待測IL-17、IL-10和TGF-β1；采用Ficoll密度梯度離心法分離出PBMC，重懸細胞于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，細胞密度為2×106/mL。將PBMC懸液置于24孔培養(yǎng)板中，每孔依次加入20 ng/mL的佛波酯、1μg/mL的離子霉素和2 nmol/ mL的莫能星后，置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。離心、PBS洗滌細胞后，分別取1×106PBMC置兩組實驗管和對照管中待測Th l7和CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞。

（2）流式細胞檢測。Th 17組的實驗管和對照管中分別加入FITC抗人CD 4 mAb，Treg組加入FITC抗人CD4 mAb和APC抗人CD25 mAb予細胞表面抗原染色，室溫避光孵育半小時。予PBS洗滌、固定、穿膜等處理，350 g離心5 min，棄上清，重懸細胞，每管200μL。Th 17組實驗管中加入10 μLPE抗人IL-17 mAb，Treg組加入PE抗人Foxp3抗體予胞內細胞因子染色，對照管中加入同型對照抗體。Th17組和Treg組分別在室溫下和4℃下避光孵育1小時，洗滌后重懸細胞，24 h內進行流式細胞術（FCM）分析。采用CD4直方圖設門區(qū)分出CD4+細胞，CD4、CD25設門區(qū)分出CD4+CD25+細胞，以IL-17、FOXP3+染色陽性判定Thl7細胞，CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞。采用Cellsquest軟件散點圖分析數(shù)據(jù)，結果用百分數(shù)來表示。細胞流式檢測抗體及試劑購自美國BioLegend公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司。1.3.2血漿IL-17、IL-10、TGF-β1水平的檢測將-80℃冷凍保存的血漿置室溫半小時后，應用ELISA法檢測血漿中的IL-17、IL-10、TGF-β1水平，所需試劑盒購自美國Bio-Source公司，操作步驟嚴格按說明書實施。

1.3.3 肺功能的檢測應用德國小兒耶格肺功能儀檢測患兒的FEV1（第1秒用力呼氣量）、FEV1/FCV（第1秒用力呼量占用力肺活量比值）和PEF（呼氣峰流速）等肺功能指標。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以百分數(shù)和例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用“s”表示，組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 治療前后Th17/Treg細胞及其細胞因子的比較本研究中，實驗組和對照組患兒的Th17和Treg細胞及IL-17、IL-10和TGF-β1水平均無明顯差異。經(jīng)過常規(guī)治療及孟魯司特鈉治療后，兩組患兒的Th17細胞及其分泌的IL-17水平均有顯著下降，Treg細胞及其分泌的IL-10和TGF-β1水平均有顯著升高（P＜0.01）。且經(jīng)過孟魯司特鈉治療的實驗組患兒的Th17細胞、IL-17水平的下降及Treg細胞、IL-10和TGF-β1水平的升高較對照組患兒更為明顯（P＜0.05或0.01）。見表1。

表1 兩組患兒治療前后Th17/Treg細胞及其細胞因子的比較（x±s）Table1 Comparison of Th17/Treg cells and theircytokines in both groups before and after treatment（x±s）

2.2 治療前后患兒肺功能的比較本研究中，實驗組和對照組患兒的FEV1、FEV1/FCV和PEF均無明顯差異。經(jīng)過常規(guī)治療及孟魯司特鈉治療后，兩組患兒的FEV1和FEV1/FCV均有顯著升高，PEF均有顯著下降（P＜0.01）。且經(jīng)過孟魯司特鈉治療的實驗組患兒的FEV1、FEV1/FCV的升高和PEF的下降較對照組患兒更為明顯（P＜0.05或0.01）。見表2。

2.3 Th17/reg細胞與肺功能的相關性研究Th17細胞與Treg細胞呈負相關（r=-0.694，P＜0.05）。Th17細胞與FEV1、FEV1/FCV呈負相關，與PEF呈正相關；而Treg細胞與FEV1、FEV1/FCV呈正相關，與PEF呈負相關（P＜0.05）。見表3。

表2 兩組治療前后肺功能的比較（s）Table2 Comparison oflung function before and aftertreatmentin both groups（±s）

表2 兩組治療前后肺功能的比較（s）Table2 Comparison oflung function before and aftertreatmentin both groups（±s）

注：t1為實驗組和對照組治療前的比較，t2為實驗組治療前、后的比較，t3為對照組治療前、后的比較，t4為實驗組和對照組治療后的比較，bP＜0.05，aP＜0.01

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表3 Th17/Treg細胞與肺功能的相關性Table3 Th17/Treg cells and lung function

3 討論

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，發(fā)病機制十分復雜，多種氣道炎性細胞和炎癥因子參與其發(fā)病過程中。Th1/Th2平衡在支氣管哮喘的過程中作用關鍵，當Th2占主導地位時，可趨化嗜酸性粒細胞，造成其在氣道內浸潤而引起炎癥。近年來研究表明，中性粒細胞亦是支氣管哮喘的重要炎性細胞，Th17和Treg細胞及其標志性因子IL-17、IL-10和TGF-β1在中性粒細胞型哮喘的發(fā)病過程中扮演重要角色[4]。

Thl7細胞所分泌主要細胞因子是IL-17，肺內IL-17水平的升高可引起氣道高反應性。IL-17作為促炎癥因子，結合受體后，可誘導細胞釋放IL-6、IL-8、TGF-β、TNF-ɑ等炎性因子，經(jīng)過NF-κB和MAPK途徑趨化中性粒細胞，最終引起氣道重塑。IL-17還可以刺激黏液素基因的表達，增加氣道黏液分泌。此外，IL-17還能活化Th2細胞，趨化嗜酸性粒細胞，產(chǎn)生IgE，影響Th1/Th2平衡。調節(jié)性淋巴細胞（Treg細胞）在免疫過程中發(fā)揮反向調節(jié)作用，維持著免疫平衡。CD4+CD25+Treg細胞是其主要分型，叉頭狀轉錄因子P3（FOXP3）是它的特征性標志。它的主要功能特征是免疫無能性和免疫抑制性，可以通過表面因子與靶細胞受體結合而直接抑制免疫，還能通過分泌IL-10、TGF-β1等細胞因子的介導發(fā)揮免疫作用[5-7]。Th17細胞可促進炎癥反應，而Treg細胞可以抑制免疫強度，降低免疫損傷。TGF-β可誘導CD4+細胞分化為Treg細胞，當機體出現(xiàn)炎癥時，IL-6和TGF-β又可誘導CD4+細胞分化為Th17細胞。Th17/Treg細胞的平衡對于哮喘患兒氣道炎癥的進展非常重要。

孟魯司特鈉是一種白三烯受體拮抗劑，可切斷白三烯與受體的結合，阻斷炎癥反應，減少黏液分泌，抑制氣道內細胞增生，避免氣道重塑。研究表明，孟魯司特鈉可以降低IL-4的濃度，抑制TGF-β的產(chǎn)生，減少CD4+細胞分化為Th17細胞。此外，孟魯司特鈉能刺激IFN-γ的產(chǎn)生，減少Th17細胞的分化。孟魯司特鈉還能促進IL-10、TGF-β1的表達，促進CD4+細胞分化為Th17細胞[8-12]。本研究中，經(jīng)過孟魯司特鈉治療，實驗組患兒的Th17細胞、IL-17水平較對照組患兒明顯下降，而Treg細胞、IL-10和TGF-β1水平明顯升高，與國內外研究結果一致。經(jīng)過常規(guī)治療及孟魯司特鈉治療后，實驗組患兒的FEV1和FEV1/FCV較對照組顯著升高，而PEF顯著下降。且Th17細胞與Treg細胞呈負相關；Th17細胞與FEV1、FEV1/FCV呈負相關，與PEF呈正相關；而Treg細胞與FEV1、FEV1/FCV呈正相關，與PEF呈負相關。表明孟魯司特鈉可以通過調節(jié)Th17/Treg細胞起到改善肺功能的作用。

綜上所述，孟魯司特鈉可以切斷白三烯與受體的結合，抑制氣道炎癥反應，調節(jié)Th17/Treg細胞的免疫平衡，起到控制哮喘的作用。

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The influence ofmontelukaston the balance of Th17/ Treg and lung function ofchildren with bronchialasthma

Hao Min,Song Wen,Lu Ling
（Departmentof Pediatrics,Zaozhuang MunicipalHospital,Zaozhuang，Shandong，277100,China）

Objective To observe the influence of montelukaston the balance of Th17/Treg and lung function of children with bronchialasthma. Methods 120 children with bronchialasthma were selected and randomLy divided into the experimentalgroup and the controlgroup and 60 cases in each group.Allpatients were given fluticasone propionate and otherconventionaltreatments.The patients in the experimentalgroup were given montelukastadditionally.Determine and compare the quantity of Th17 and Treg cells,the levelof IL-17,IL-10,TGF-β1and the lung function before treatmentand 3 months later.Results（1）There are significantdecline in the quantity of Th17 cells,the levelof IL-17 and PEF,increase in the quantity of Treg cells,the levelof IL-10,TGF-β1and FEV1,FEV1/FCV of allpatients after treatment(P＜0.01).Itis significanthigher in the quantity of Th17 cells,the levelof IL-17 and PEF,lower in the quantity of Treg cells,the levelof IL-10,TGF-β1and FEV1,FEV1/FCV of patients in the experimental group than in the control group after treatment of montelukast(P＜0.05 or 0.01).（2）Th17 cells are negatively related to Treg cells(P＜0.05).Th17 cells are negatively related to FEV1,FEV1/FCV and positively related to PEF(P＜0.05).Treg cells are positively related to FEV1,FEV1/FCV and negatively related to PEF(P＜0.05).Conclusion Montelukast can modulate the balance of Th17/Treg of children with bronchial asthma,and improve their lung function.There are correlation between Th17/Treg cells and lung function.

Montelukast;Bronchialasthma;Th17;Treg;Lung function

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.21.004

郝珉,E-mail：walkonsnow@sina.com