• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    滯育及不同蟲(chóng)態(tài)下亞洲玉米螟內(nèi)參基因的篩選

    2017-08-02 01:39:31張統(tǒng)書(shū)李忠洲段立佳李帥強(qiáng)
    關(guān)鍵詞:蟲(chóng)態(tài)內(nèi)參玉米螟

    劉 寧,張統(tǒng)書(shū),李忠洲,段立佳,李帥強(qiáng),董 輝*,叢 斌*

    滯育及不同蟲(chóng)態(tài)下亞洲玉米螟內(nèi)參基因的篩選

    劉 寧1,張統(tǒng)書(shū)1,李忠洲2,段立佳1,李帥強(qiáng)1,董 輝1*,叢 斌1*

    (1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,沈陽(yáng) 110161;2.撫順出入境檢驗(yàn)檢疫局,撫順113006)

    篩選出滯育狀態(tài)下以及不同蟲(chóng)態(tài)下亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)最穩(wěn)定內(nèi)參基因,本結(jié)果為研究不同蟲(chóng)態(tài)及滯育1個(gè)月,滯育2個(gè)月,滯育3個(gè)月和滯育4個(gè)月的亞洲玉米螟目的基因表達(dá)水平提供參考依據(jù)。本文以不同蟲(chóng)態(tài)及滯育狀態(tài)下的亞洲玉米螟為試驗(yàn)材料,應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)β-actin,18SrRNA,EF1-α和RPS3共4個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性水平,結(jié)合geNorm,Normfinder,BestKeeper和RefFinder軟件分析各候選內(nèi)參基因在不同處理下的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明,在亞洲玉米螟不同蟲(chóng)態(tài)中,4個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性大小排序?yàn)?8SrRNA>EF1-α>β-actin>RPS3;滯育1個(gè)月,滯育2個(gè)月,滯育3個(gè)月和滯育4個(gè)月的亞洲玉米螟,穩(wěn)定性大小排序?yàn)棣?actin>EF1-α>18SrRNA>RPS3。18SrRNA和β-actin可分別作為不同蟲(chóng)態(tài)和滯育狀態(tài)下的亞洲玉米螟基因表達(dá)水平分析試驗(yàn)中的內(nèi)參基因。

    亞洲玉米螟;內(nèi)參基因;RT-qPCR;18SrRNA;β-actin

    實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative reverse transcription-PCR,RT-qPCR)是一種檢測(cè)mRNA表達(dá)豐度的可靠技術(shù),該技術(shù)憑借其高靈敏度,運(yùn)算精度與適用范圍廣等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用(Iktenetal., 2016;Normannetal., 2016)。然而,RNA的產(chǎn)量,完整性及其質(zhì)量,酶的活性和PCR擴(kuò)增效率等方面的差異性變化均可對(duì)目的基因特異性表達(dá)的真實(shí)CT值造成影響(崔淼等,2014;Yangetal., 2016)。因此,進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)時(shí)選擇較為穩(wěn)定表達(dá)的管家基因作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕虮磉_(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化與校正是至關(guān)重要的(Lordetal., 2010;Silvaetal., 2016)。在很多研究中,參與基本細(xì)胞流過(guò)程的傳統(tǒng)管家基因通常作為內(nèi)參基因,例如肌動(dòng)蛋白(Actin)、微管蛋白(Tubulin)、延伸因子(EF1-a)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)等(王佳等,2014;潘暢等,2016)。一個(gè)理想的內(nèi)參基因在不同試驗(yàn)條件下,不同組織類型和各發(fā)育階段中均穩(wěn)定表達(dá)(Lietal., 2016; Youetal., 2016)。然而,大量研究結(jié)果表明,這些被廣泛使用的管家基因在不同試驗(yàn)條件下,其表達(dá)量具有顯著差異性(Sunetal., 2016;Wrzesińskaetal., 2016)。故選擇內(nèi)參基因時(shí),需要對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與評(píng)估(Wieczoreketal., 2013)。近幾年來(lái),geNorm(Vandesompeleetal., 2002),BestKeeper(Pfaffletal., 2004),NormFinder(Andersenetal., 2004)和RefFinder(Xieetal., 2011)軟件廣泛應(yīng)用于內(nèi)參基因的篩選與評(píng)估分析中(肖翠等,2012)。geNorm對(duì)所有內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)估(M值),其中M<1.5的內(nèi)參基因被認(rèn)為較穩(wěn)定(Ongetal., 2016)。NormFinder與geNorm工作原理相同,根據(jù)穩(wěn)定度篩選出最優(yōu)的一個(gè)內(nèi)參基因。BestKeeper在變異分析的基礎(chǔ)之上對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估,標(biāo)準(zhǔn)誤(SD)或者變異系數(shù)(CV)越小,則認(rèn)為該基因穩(wěn)定性越強(qiáng)。RefFinder是一個(gè)在線綜合分析軟件,整合了geNorm,BestKeeper,NormFinder和Delta CT方法,計(jì)算出穩(wěn)定性等級(jí)的平均值,穩(wěn)定性平均等級(jí)指數(shù)越小越穩(wěn)定。近來(lái),國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者均用上述分析方法對(duì)多種昆蟲(chóng)的內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估與篩選(陳芳等,2014),例如二斑葉螨Tetranychusurticae(周興隆等,2015),絲光綠蠅Luciliasericata(Bagnalletal., 2010),褐飛虱Nilaparvatalugens(Yuanetal., 2014),棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera(Zhangetal., 2015)等。

    亞洲玉米螟是我國(guó)玉米種植上的常發(fā)性害蟲(chóng),以老熟幼蟲(chóng)形態(tài)滯育越冬,在翌年作為蟲(chóng)源造成嚴(yán)重危害。結(jié)合分子、基因等研究方法,探索亞洲玉米螟發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有良好的研究前景,利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)亞洲玉米螟基因表達(dá)(郭建青,2013;陳鵬等,2014)分析研究已有報(bào)道,但對(duì)內(nèi)參基因的篩選仍未空白。為確保目的基因表達(dá)水平的準(zhǔn)確性,需引入內(nèi)參基因作為參照。本研究選取了不同蟲(chóng)態(tài)(卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng))及不同滯育狀態(tài)下(滯育1個(gè)月,滯育2個(gè)月,滯育3個(gè)月和滯育4個(gè)月)的亞洲玉米螟共8份試驗(yàn)材料,利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了β-actin,18SrRNA,EF1-α和RPS3共4個(gè)內(nèi)參基因在不同蟲(chóng)態(tài)以及不同滯育狀態(tài)下的亞洲玉米螟中表達(dá)水平,并應(yīng)用geNorm,Normfinder,BestKeeper和RefFinder軟件分析了各候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性,篩選出最適的內(nèi)參基因,在亞洲玉米螟后續(xù)的相關(guān)基因表達(dá)的研究中,為其選擇合適的內(nèi)參基因提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 供試蟲(chóng)源

    不同滯育狀態(tài)下試蟲(chóng):于2016年10月至2017年1月期間滯育1個(gè)月,滯育2個(gè)月,滯育3個(gè)月和滯育4個(gè)月的亞洲玉米螟,從沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田剖桿采集,每次試驗(yàn)選擇3頭大小一致的幼蟲(chóng),用于分析不同滯育狀態(tài)下候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性(3次生物學(xué)重復(fù))。

    不同蟲(chóng)態(tài)試蟲(chóng):沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng),溫度為26℃±1℃,相對(duì)濕度為75%±5%,光周期為16 L∶8 D。分別收集亞洲玉米螟卵(產(chǎn)卵后12 h)、幼蟲(chóng)(5th)、蛹(化蛹后1 d)及成蟲(chóng)(羽化后3 d)用于分析不同蟲(chóng)態(tài)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性(3次生物學(xué)重復(fù))。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 亞洲玉米螟總RNA的提取及檢測(cè)

    按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取各個(gè)處理的亞洲玉米螟總RNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性,并用Thermo公司的核酸蛋白檢測(cè)儀NanoDrop2000檢測(cè)總RNA濃度與純度(所有樣本RNA均滿足條件:A260/230>2.0,2.0>A280/260>1.8)。參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

    1.2.2 亞洲玉米螟候選內(nèi)參基因表達(dá)引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)Gene bank(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)亞洲玉米螟相關(guān)信息,篩選出4個(gè)候選內(nèi)參基因β-actin(KT366041.1),18SrRNA(GU205787.1),EF1-α(KC966937.1),RPS3(EU275206.2)。通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)了計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,RT-qPCR)特異性引物,引物均由上海生物工程有限公司合成(表1)。

    表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer pairs used for PCR

    1.2.3 候選內(nèi)參基因的表達(dá)量檢測(cè)

    利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),采用SYBR GreenⅡ染料法,在Bio-Rad CFX96 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增、熔解曲線的分析,總反應(yīng)體系20 μL,包括2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL,上下游引物各0.8 μL,去除RNA酶ddH2O 7.6 μL,cDNA模板0.8 μL。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔,擴(kuò)增程序采用兩步法:95℃預(yù)變性30 s;然后95℃變性10 s,60℃退火延伸40 s,共40個(gè)循環(huán)。

    1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    將cDNA原液依次稀釋5、52、53、54、55、56倍作為模板。按照1.2.4反映體系及程序進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)各引物的擴(kuò)增效率進(jìn)行分析。

    1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    利用軟件geNorm(Vandesompeleetal., 2002),BestKeeper(Pfaffletal., 2004),Normfinder(Andersenetal., 2004)軟件及在線軟件RefFinder評(píng)估與分析亞洲玉米螟各候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 亞洲玉米螟內(nèi)參基因引物特異性驗(yàn)證

    以亞洲玉米螟cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增,所得擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期一致。進(jìn)一步對(duì)4個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng),所有內(nèi)參基因的溶解曲線均為單一峰,表明引物無(wú)非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象,故RT-qPCR的結(jié)果真實(shí)可靠。

    2.2 亞洲玉米螟內(nèi)參基因的CT值分析

    比較不同蟲(chóng)態(tài)及滯育狀態(tài)下亞洲玉米螟4個(gè)內(nèi)參基因的CT值,它們的表達(dá)水平均存在一定的變化(圖1),該結(jié)果說(shuō)明,不同蟲(chóng)態(tài)及不同滯育狀態(tài)可能影響這些候選內(nèi)參基因的表達(dá)量。不同蟲(chóng)態(tài)的亞洲玉米螟四個(gè)候選內(nèi)參基因β-actin、18SrRNA、RPS3和EF1-α的CT值變化范圍分別為22.11-25.95、12.11-16.46、22.44-28.51和30.35-33.39,EF1-α的CT值變異程度最小(ΔCT=3.04;CV=0.030),RPS3的CT值變異程度最大(ΔCT=6.03;CV=0.081)(圖1 A);不同滯育狀態(tài)下的亞洲玉米螟中4個(gè)候選內(nèi)參基因β-actin、18SrRNA、RPS3和EF1-α的Ct值變化范圍分別為26.03-26.80、15.41-16.33、24.59-28.63和31.18-33.18,β-actin的CT值變異程度最小(ΔCT=0.77;CV=0.011),RPS3的Ct值變異程度最大(ΔCT=2.00;CV=0.067)(圖1 B)。

    圖1 不同蟲(chóng)態(tài)(A)及滯育狀態(tài)下(B)亞洲玉米螟4個(gè)候選內(nèi)參基因CT值的比較 Fig.1 CT values of four candidate reference genes in different stages (A) and different diapause stages,i.e.,collected from October to January (B) of Ostrina furnacalis

    2.3 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)估

    2.3.1 geNorm軟件評(píng)估結(jié)果

    應(yīng)用genorm軟件評(píng)估4個(gè)候選內(nèi)參基因β-actin、18SrRNA、RPS3和EF1-α的表達(dá)穩(wěn)定度M值,并由大到小進(jìn)行排序,亞洲玉米螟不同蟲(chóng)態(tài)為RPS3(1.201)>EF1-α(0.993)>β-actin(0.974)>18SrRNA(0.875)(圖2 A);不同滯育狀態(tài)的亞洲玉米螟為RPS3(1.572)>18SrRNA(1.244)>β-actin(1.010)>EF1-α(0.966)(圖2 B),該結(jié)果表明,18SrRNA在不同蟲(chóng)態(tài)中表達(dá)最穩(wěn)定,EF1-α在不同滯育狀態(tài)下表達(dá)最穩(wěn)定。

    圖2 應(yīng)用geNorm軟件分析不同蟲(chóng)態(tài)(A)及不同滯育狀態(tài)亞洲玉米螟(B)各內(nèi)參的表達(dá)穩(wěn)定度值(M)Fig.2 Expression stability values (M) of reference genes in different stages (A) and different diapause stages,i.e.,collected from October to January (B) of Ostrina furnacalis analyzed by geNorm

    2.3.2 Normfinder軟件評(píng)估結(jié)果

    應(yīng)用Normfinder軟件評(píng)估4個(gè)候選內(nèi)參基因β-actin、18SrRNA、RPS3和EF1-α的表達(dá)穩(wěn)定度,候選內(nèi)參基因在亞洲不同蟲(chóng)態(tài)玉米螟中的穩(wěn)定度排序?yàn)椋?8SrRNA(0.348)>β-actin(0.423)>EF1-α(0.489)>RPS3(0.569);不同滯育狀態(tài)的亞洲玉米螟為:EF1-α(0.177)>β-actin(0.379)>18SrRNA(0.581)>RPS3(0.782)。在不同蟲(chóng)態(tài)中,18SrRNA表達(dá)最穩(wěn)定,在不同月份下,EF1-a為最優(yōu)內(nèi)參基因,與geNorm軟件分析結(jié)果一致(表2)。

    2.3.3 BestKeeper軟件評(píng)估結(jié)果

    應(yīng)用BestKeeper軟件評(píng)估4個(gè)候選內(nèi)參基因結(jié)果顯示SD值(表3),亞洲玉米螟不同蟲(chóng)態(tài),EF1-α<β-actin<18SrRNA

    2.3.4 綜合評(píng)估結(jié)果

    綜合上述3種軟件及在線軟件RefFinder的評(píng)估結(jié)果表明,不同蟲(chóng)態(tài)中選擇18SrRNA為最優(yōu)內(nèi)參基因(表4),不同月份滯育下選擇β-actin為最優(yōu)內(nèi)參基因(表5)。

    表2 應(yīng)用NormFinder軟件分析亞洲玉米螟內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 2 Expression stability of reference genes of Ostrinia furnacalis by NormFinder

    3 結(jié)論與討論

    亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)做為玉米上的主要害蟲(chóng),多年來(lái)一直有大量報(bào)道,RT-qPCR技術(shù)在亞洲玉米螟目的基因表達(dá)分析研究中得到了廣泛應(yīng)用(郭建青,2013;陳鵬等,2014)。為了明確亞洲玉米螟目的基因的表達(dá)水平,必須引入內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,由于,目的基因表達(dá)量會(huì)受內(nèi)外界的多種因素影響,如RNA完整性及反轉(zhuǎn)錄效率等(Pfaffletal., 2004;Wrzesińskaetal., 2016)。也有研究表明,在柑橘大實(shí)蠅中,RPL32在不同發(fā)育階段和不同溫度處理中表達(dá)最穩(wěn)定,在不同溫度下和一個(gè)γ輻射處理下理想表達(dá)的基因是GAPDH,G6PDH和RPL32(Lüetal., 2014);β-actin在感染細(xì)菌的蜜蜂中表達(dá)穩(wěn)定,而在感染真菌的赤擬谷盜中不穩(wěn)定表達(dá)(Lordetal., 2010);β-actin和18SrRNA在蝗蟲(chóng)發(fā)育階段中穩(wěn)定表達(dá),然而,在抵低壓缺氧條件下表達(dá)水平發(fā)生改變(Zhaoetal., 2012)。周曉慧(2014)研究表明,在碦西茄干旱和鹽脅迫條件下EF1-α和GAPDH表達(dá)穩(wěn)定性最好,TUA和18SrRNA在碦西茄不同組織中表達(dá)最穩(wěn)定。因此篩選出在特定試驗(yàn)條件下表達(dá)穩(wěn)定性好的內(nèi)參基因是非常關(guān)鍵的。

    表3 應(yīng)用BestKeeper軟件分析亞洲玉米螟內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 3 Expression stability of reference genes of Ostrinia furnacalis by BsetKeeper

    表4 4個(gè)候選內(nèi)參基因不同蟲(chóng)態(tài)的穩(wěn)定性等級(jí)排序Table 4 Overall stability rank of four candidate reference genes of different stages

    表5 4個(gè)內(nèi)參基因不同滯育狀態(tài)的表達(dá)穩(wěn)定性Table 5 Overall stability rank of four candidate reference genes of different diapause stages

    在本試驗(yàn)中,選擇了4個(gè)亞洲玉米螟候選內(nèi)參基因。根據(jù)geNorm、NormFinder、BestKeeper及RefFinder軟件綜合評(píng)估了4個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。在不同蟲(chóng)態(tài)的亞洲玉米螟試驗(yàn)中,4個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性等級(jí)綜合排名為,18SrRNA(rank=1.32)>EF1-α(rank=1.73)>β-actin(rank=2.21)>RPS3(rank=4.00),18SrRNA是表達(dá)穩(wěn)定性最好的基因,其次是EF1-α,RPS3被認(rèn)為穩(wěn)定性最差。然而,geNorm和Normfinder軟件分析均顯示18SrRNA是表達(dá)穩(wěn)定性最好的基因,M值最小,BestKeeper分析表明EF1-α的SD=0.83<1,其它3個(gè)候選內(nèi)參基因的SD值均大于1,EF1-α穩(wěn)定性最好。在不同滯育狀態(tài)下的亞洲玉米螟試驗(yàn)中,4個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性等級(jí)綜合排名為β-actin(rank=1.41)>EF1-α(rank=1.73)>18SrRNA(rank=2.06)>RPS3(rank=4.00),β-actin表達(dá)穩(wěn)定性最好,18SrRNA和EF1-α穩(wěn)定性次之,RPS3最不穩(wěn)定。然而,geNorm和Normfinder軟件分析均顯示EF1-α表達(dá)最穩(wěn)定,M值最小,BestKeeper軟件分析僅RPS3的SD值大于1,其余3個(gè)候選內(nèi)參基因SD值均小于1,但β-actin的SD值最小,表達(dá)最穩(wěn)定。geNorm與NormFinder程序算法需要將數(shù)據(jù)CT值轉(zhuǎn)化為Q=2ΔCT值方法,然而B(niǎo)estKeeper軟件直接輸入CT值進(jìn)行計(jì)算分析。3種軟件分析結(jié)果之間的差異可能是由于應(yīng)用不同數(shù)據(jù)分析導(dǎo)致。因此,本文研究結(jié)果需要通過(guò)RefFinder軟件進(jìn)行綜合評(píng)估,從而得到綜合排名指數(shù),排名指數(shù)越小,說(shuō)明該基因越穩(wěn)定。

    本文研究結(jié)果表明,亞洲玉米螟不同蟲(chóng)態(tài)中,18SrRNA表達(dá)穩(wěn)定性最好,RPS3穩(wěn)定性最差;在不同滯育狀態(tài)下,β-actin表達(dá)穩(wěn)定性最好,RPS3穩(wěn)定性最差。這些結(jié)果依據(jù)上述3種不同軟件及在線軟件RefFinder綜合分析得到。因此,在亞洲玉米螟不同蟲(chóng)態(tài)試驗(yàn)中選擇18SrRNA作內(nèi)參基因;在不同滯育狀態(tài)下,可選擇β-actin作最適內(nèi)參基因。本研究結(jié)果可為亞洲玉米螟生長(zhǎng)發(fā)育及滯育等過(guò)程的分子機(jī)理研究提供參考依據(jù)。

    References)

    Andersen CL, Jensen JL, ?rntoft TF.Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets [J].CancerResearch, 2004, 64 (15): 5245-5250.

    Bagnall NH, Kotze AC.Evaluation of reference genes for real-time PCR quantification of gene expression in theAustraliansheepblowfly, Lucilia cuprina [J].MedicalandVeterinaryEntomology, 2010, 24 (2): 176-181.

    Chen F, Lu YY.Selection of reference genes inPhenacoccussolenopsis(Hemiptera:Pseudococcidae) under heat stress [J].ActaEntomologicaSinica, 2014, 57 (10): 1146-1154.[陳芳, 陸永躍.熱脅迫下棉花粉蚧內(nèi)參基因的篩選[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2014, 57 (10): 1146-1154]

    Chen P, Qu MB, Yang J.Cloning and expression of two laccase genesOfLac1 andOfLac2 from the insectOstriniafurnacalis[J].ScientiaAgriculturaSinica, 2014, 47 (7): 1341-1350.[陳鵬, 屈明博, 楊君.亞洲玉米螟兩種漆酶基因OfLac1和OfLac2 cDNA的克隆及基因表達(dá)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47 (7): 1341-1350]

    Cui M, Liu XJ, Li T,etal.Selection of reference genes on different days during the development of the fifth-instar nymph ofLocustamigratoriawith quantitative real-time PCR [J].ChineseJournalofAppliedEntomology, 2014, 51 (3): 733-740.[崔淼, 劉曉健, 李濤, 等.五齡飛蝗不同發(fā)育時(shí)間實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選[J].應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2014, 51 (3): 733-740]

    Guo JQ.Cloning and Expression Analysis of Glycogen Phosphorylase Gene inOstriniafurnacalis(Guenée) (Lepidoptera: Crambidae) [D].Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences Master Dissertation, 2013.[郭建青.亞洲玉米螟糖原磷酸化酶基因的克隆及表達(dá)分析[D].北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2013]Ikten C, Ustun R, Catal M,etal.Multiplex real-time qPCR assay for simultaneous and sensitive detection of phytoplasmas in sesame plants and insect vectors [J].PLoSONE, 2016, 11 (5): e0155891.

    Li J, Jia H, Han X,etal.Selection of reliable reference genes for gene expression analysis under abiotic stresses in the Desert Biomass Willow,Salixpsammophila[J].FrontiersinPlantScience, 2016, 7 (131): 1505.

    Lord JC, Hartzer K, Toutges M,etal.Evaluation of quantitative PCR reference genes for gene expression studies inTriboliumcastaneumafter fungal challenge [J].JournalofMicrobiologicalMethods, 2010, 80 (2): 219-221.

    Lü ZC, Wang LH, Dai RL,etal.Evaluation of endogenous reference genes ofBactrocera(Tetradacus)minaxby gene expression profiling under various experimental conditions [J].FloridaEntomologicalSociety, 2014, 97 (2): 597-604.

    Normann KR, Berland ?ystese KA, Berg JP,etal.Selection and validation of reliable reference genes for RT-qPCR analysis in a large cohort of pituitary adenomas [J].MolecularandCelluarEndocrinonogy, 2016, 437 (C): 183-189.

    Ong OTW,Young LJ,Old JM.Valuation of reference genes for gene expression in red-tailed Phascogale (Phascogalecalura) liver, lung, small intestine and spleen [J].PeerJ., 2016, 4: e2552.

    Pan C, Zhang YH, Pang H,etal.Selection of the reference genes for gene expression studies inCryptolaemusmontrouzieriMulsant by qRT-PCR [J].JouranlofEnviromentalEntomology, 2016, 38 (2): 261-270.[潘暢, 張宇宏, 龐虹.孟氏隱唇瓢蟲(chóng)qRT-PCR分析中內(nèi)參基因的篩選[J].環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2016, 38 (2): 261-270]

    Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C,etal.Determination of stable housekeeping genes,differentially regulated target genes and sample integrity: Bestkeeper-excel-based tool using pair-wise correlations [J].Biotechnol.Lett., 2004, 26 (6): 509-515.

    Silva PRAD, Vidal MS, Soares CDP,etal.Selection and evaluation of reference genes for RT-qPCR expression studies onBurkholderiatropicastrain Ppe8, a sugarcane-associated diazotrophic bacterium grown with different carbon sources or sugarcane juice [J].AntonievanLeeuwenhoek, 2016, 109 (11): 1493-1502.

    Sun HP, Li F, Ruan QM,etal.Identification and validation of reference genes for quantitative real-time PCR studies inHederahelixL [J].PlantPhysiologyandBiochemistry, 2016, 108: 286-294.

    Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F,etal.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes [J].GenomeBiology, 2002, 3 (7): 1-12.

    Wang J, Zhao J,Liu YH.Evaluation of endogenous reference genes inBactroceraminax(Diptera:Tephritidae) [J].ActaEntomologicaSinica, 2014, 57 (12): 1375-1380.[王佳, 趙靜, 劉映紅.柑橘大實(shí)蠅內(nèi)參基因的評(píng)估[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2014, 57 (12): 1375-1380]

    Wieczorek P, Wrzesińska B,Obr?palska-St?plowska A.Assessment of reference gene stability influenced by extremely divergent disease symptoms inSolanumycopersicumL [J] .JournalofVirologicalMethods, 2013, 194 (1-2): 161-168.

    Wrzesińska B,Kierzek R,Obr?palska-St?plowska A.Evaluation of six commonly used reference genes for gene expression studies in herbicide-resistantAvenafatuabiotypes [J].WeedResearch, 2016, 56 (4): 284-292.

    Xiao C, Yan JW, Long GY,etal.Stability evaluation of reference genes in citrus [J].JournalofFruitScience, 2012, 29 (6): 978-984.[肖翠, 嚴(yán)佳文, 龍桂友, 等.柑橘內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)[J] .果樹(shù)學(xué)報(bào), 2012, 29 (6): 978-984]

    Xie F, Sun G, Stiller JW,etal.Genome-wide functional analysis of the cotton transcriptome by creating an integrated EST database [J].PLoSONE, 2011, 6 (11): e26980.

    Yang CX, Preisser E, Zhang HJ,etal.Selection of reference genes for RT-qPCR analysis inCoccinellaseptempunctatato assess un-intended effects of RNAi transgenic plants [J] .FrontiersinPlantScience, 2016, 7: e53006.

    You YH, Zhang L, Li PM,etal.Selection of reliable reference genes for quantitative real-time PCR analysis in plum (PrunussalicinaLindl) under different postharvest treatments [J].ScientiaHorticulturae, 2016, 210: 285-293.

    Yuan M, Lu YH, Zhu X,etal.Selection and evaluation of potential reference genes for gene expression analysis in the brown planthopper,Nilaparvatalugens(Hemiptera:Delphacidae) using reverse-transcription quantitative PCR [J].PLoSONE, 2014, 9 (1): e86503.

    Zhang SD, An SH, Li Z,etal.Identification and validation of reference genes for normalization of gene expression analysis using qRT-PCR inHelicoverpaarmigera(Lepidoptera:Nocidae) [J].Gene, 2015, 555 (2): 393-402.

    Zhao DJ, Guo K, Kang L.Identification of condition-specific reference genes from microarray data for locusts exposed to hypobaric hypoxia [J].FederationofEuropeanBiochemicalSocieties, 2012, 8 (1): 235-240.

    Zhou XH, Liu J, Zhuang Y.Selection of appropriate reference genes inSolanumaculeatissimumfor quantitative gene expression studies under different experimental conditions [J].ActaHorticulturaeSinica, 2014, 41 (8): 1731-1738.[周曉慧, 劉軍, 莊勇.喀西茄內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)[J].園藝學(xué)報(bào), 2014, 41 (8): 1731-1738]

    Zhou XL, Yang SY, Hao Y,etal.Selection of the most suitable reference genes and expression profiling ofCYP392Asubfamily genes in the multi-pesticide resisitant strain ofTetranychusurticae(Acari: Tetranychidae) [J].ActaEntomologicaSinica, 2015, 58 (11): 1229-1236.[周興隆, 楊順義, 郝雨,等.二斑葉螨多重抗性品系最優(yōu)內(nèi)參基因的篩選及CYP392A亞家族基因的表達(dá)分析[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2015, 58 (11): 1229-1236]

    Selection of the reference genes inOstriniafurnacalis(Guenée) under diapause and different insect states

    LIU Ning1, ZHANG Tong-Shu1, LI Zhong-Zhou2,DUAN Li-Jia1, LI Shuai-Qiang1, DONG Hui1*, CONG Bin1*

    (College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China;2.Entering/Leaving Country Examination Quarantine Bareau of Funshun City,Fushun 113006,Liaoning Province, China)

    Selecting the suitable reference genes inOstriniafurnacalis(Guenée) under different diapause stages and different stages, this result provides an accurate reference for future study of the different diapause stages, i.e., collected from October to January, and different stages ofOstriniafurnacalis(Guenée) in the experiment of the level of gene expression.In the study, by the method of RT-qPCR,Ostriniafurnacalis(Guenée) as experimental material, the mRNA levels of four candidate reference genes such asβ-actin, 18SrRNA,EF1-aandRPS3 were assessed; Three software-based approaches (geNorm, Normfinder and BestKeeper) and one web-based comprehensive tool (RefFinder) were used to analyze the expression stability of these genes under different treatments.According to the comprehensive rank of RefFinder, the expression stability of above four candidate reference genes were 18SrRNA>EF1-a>β-actin>RPS3 from different stages ofOstriniafurnacalis(Guenée); the expression stability of above four candidate reference genes wereβ-actin>EF1-a>18SrRNA>RPS3 from different diapause stages, i.e., collected from October to January ofOstriniafurnacalis(Guenée).18SrRNAandβ-actincan be respectively uesd as a reference gene for different stages and different diapause stages ofOstriniafurnacalis(Guenée) in the experiment of the level of gene expression.

    Ostriniafurnacalis; reference genes; RT-qPCR; 18SrRNA;β-actin

    劉寧,張統(tǒng)書(shū),李忠洲,等.滯育及不同蟲(chóng)態(tài)下亞洲玉米螟內(nèi)參基因的篩選[J].環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2017,39(3):611-617.

    農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201303026);國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0300704)

    劉寧,女,1991年生,遼寧人,碩士研究生,研究方向?yàn)楹οx(chóng)生物防治與昆蟲(chóng)分子生態(tài)學(xué),E-mail:13940434836@139.com

    *通訊作者Author for correspondence,E-mail: biocontrol@163.com; bin1956@163.com

    Received: 2017-01-22;接受日期Accepted: 2017-03-19

    Q963;S433.4

    A

    1674-0858(2017)03-0611-07

    猜你喜歡
    蟲(chóng)態(tài)內(nèi)參玉米螟
    低氧對(duì)幾種主要儲(chǔ)糧害蟲(chóng)蟲(chóng)態(tài)的致死效果
    二代玉米螟防治方法
    松褐天牛不同蟲(chóng)態(tài)的營(yíng)養(yǎng)成分評(píng)價(jià)
    二代玉米螟發(fā)生趨勢(shì)預(yù)報(bào)
    內(nèi)參報(bào)道如何在全媒體時(shí)代“出圈”
    薇甘菊頸盲蝽基礎(chǔ)生物學(xué)特性
    辦好黨報(bào)內(nèi)參的思考與探索
    臨河地區(qū)玉米螟的發(fā)生與綜合防治措施
    內(nèi)參影響力與媒體公信力
    新聞傳播(2015年10期)2015-07-18 11:05:39
    淺談赤眼蜂防治玉米螟的意義及發(fā)展前景
    日韩免费av在线播放| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 久久香蕉激情| 亚洲av国产av综合av卡| 国产成人精品无人区| 国产一区二区激情短视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久婷婷成人综合色麻豆| 午夜日韩欧美国产| 午夜日韩欧美国产| 大码成人一级视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美精品一区二区免费开放| 高清在线国产一区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 我要看黄色一级片免费的| 欧美日韩福利视频一区二区| 免费在线观看黄色视频的| 黄片播放在线免费| 少妇 在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 成人三级做爰电影| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 露出奶头的视频| 亚洲av日韩在线播放| 欧美激情久久久久久爽电影 | 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产一区二区 视频在线| 黑人操中国人逼视频| 成人特级黄色片久久久久久久 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产区一区二久久| 欧美大码av| 亚洲午夜理论影院| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 国产又爽黄色视频| 亚洲久久久国产精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品偷伦视频观看了| 后天国语完整版免费观看| 亚洲成国产人片在线观看| av电影中文网址| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 91国产中文字幕| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜视频精品福利| 露出奶头的视频| 精品久久久久久电影网| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 无遮挡黄片免费观看| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 老司机在亚洲福利影院| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲五月婷婷丁香| 怎么达到女性高潮| 午夜免费成人在线视频| 大型av网站在线播放| 大香蕉久久成人网| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 一级毛片电影观看| 91九色精品人成在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 国产精品国产av在线观看| 99在线人妻在线中文字幕 | 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品1区2区在线观看. | 精品免费久久久久久久清纯 | 老司机在亚洲福利影院| 一进一出好大好爽视频| 一级,二级,三级黄色视频| 多毛熟女@视频| 一级a爱视频在线免费观看| 两个人免费观看高清视频| 夜夜爽天天搞| 黄色怎么调成土黄色| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲avbb在线观看| 亚洲精品在线美女| 大香蕉久久网| 国产精品亚洲av一区麻豆| av不卡在线播放| 欧美在线黄色| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产在视频线精品| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品偷伦视频观看了| xxxhd国产人妻xxx| 午夜福利视频在线观看免费| 丝袜人妻中文字幕| 看免费av毛片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 天天操日日干夜夜撸| 成人18禁在线播放| 久久久久久久国产电影| 90打野战视频偷拍视频| www.精华液| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 在线观看舔阴道视频| 丝袜喷水一区| cao死你这个sao货| 看免费av毛片| 国产真人三级小视频在线观看| 电影成人av| 欧美久久黑人一区二区| 精品人妻1区二区| 亚洲av日韩在线播放| 在线播放国产精品三级| 国产精品久久久久久精品古装| 国产三级黄色录像| 国产精品免费大片| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 色尼玛亚洲综合影院| 在线观看www视频免费| 国产三级黄色录像| 亚洲欧洲日产国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 久久久久久久精品吃奶| 日日夜夜操网爽| 涩涩av久久男人的天堂| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 搡老熟女国产l中国老女人| 免费少妇av软件| 一级,二级,三级黄色视频| 日本av手机在线免费观看| 国产深夜福利视频在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产男女超爽视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲av电影在线进入| 久久性视频一级片| 亚洲成国产人片在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 色播在线永久视频| 国产不卡av网站在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 一本大道久久a久久精品| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 性少妇av在线| 亚洲熟女毛片儿| 美女高潮到喷水免费观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲精品国产一区二区精华液| 一区二区三区激情视频| 日韩欧美免费精品| 日本av手机在线免费观看| 国产野战对白在线观看| 亚洲天堂av无毛| 国产亚洲精品一区二区www | 波多野结衣一区麻豆| 咕卡用的链子| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 在线av久久热| 99re6热这里在线精品视频| 日本黄色日本黄色录像| 天堂中文最新版在线下载| 男人操女人黄网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 人人澡人人妻人| av免费在线观看网站| 国产又爽黄色视频| 亚洲七黄色美女视频| 桃花免费在线播放| 在线观看www视频免费| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品国内亚洲2022精品成人 | 日本五十路高清| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲欧美日韩另类电影网站| 在线av久久热| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲国产欧美在线一区| xxxhd国产人妻xxx| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲成人免费av在线播放| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲黑人精品在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产成人免费无遮挡视频| 九色亚洲精品在线播放| 免费少妇av软件| 亚洲七黄色美女视频| 久久久久国内视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| av欧美777| 亚洲天堂av无毛| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品国产高清国产av | 免费在线观看日本一区| 欧美精品亚洲一区二区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产三级黄色录像| 久久香蕉激情| 久久热在线av| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久av网站| 一区二区av电影网| 国产精品电影一区二区三区 | 757午夜福利合集在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 免费观看a级毛片全部| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久精品国产综合久久久| 美女视频免费永久观看网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲午夜理论影院| 色在线成人网| 久久精品国产亚洲av高清一级| 2018国产大陆天天弄谢| 757午夜福利合集在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 在线av久久热| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩中文字幕欧美一区二区| avwww免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲人成电影免费在线| 午夜福利视频精品| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久亚洲真实| 午夜激情久久久久久久| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲五月色婷婷综合| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 午夜福利,免费看| 高清毛片免费观看视频网站 | 两个人免费观看高清视频| 亚洲av国产av综合av卡| 操美女的视频在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲天堂av无毛| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲精品国产区一区二| 国产av一区二区精品久久| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产野战对白在线观看| 亚洲精华国产精华精| 美女扒开内裤让男人捅视频| 女性被躁到高潮视频| av视频免费观看在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲国产欧美网| 精品亚洲成a人片在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品亚洲一级av第二区| 午夜福利一区二区在线看| 中国美女看黄片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产成人欧美| 国产精品一区二区在线观看99| 久久热在线av| 国产av一区二区精品久久| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 悠悠久久av| 男女边摸边吃奶| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品欧美亚洲77777| 精品亚洲成国产av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 不卡一级毛片| 一级片免费观看大全| 在线观看舔阴道视频| 亚洲熟妇熟女久久| 天堂8中文在线网| 精品一品国产午夜福利视频| 日韩大片免费观看网站| 国产野战对白在线观看| 国产区一区二久久| videos熟女内射| 女警被强在线播放| 18禁观看日本| 欧美日韩一级在线毛片| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美日韩成人在线一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美精品一区二区大全| 9热在线视频观看99| 免费观看av网站的网址| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 69精品国产乱码久久久| 飞空精品影院首页| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲av国产av综合av卡| 日韩一区二区三区影片| 最新的欧美精品一区二区| 曰老女人黄片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 不卡av一区二区三区| 我要看黄色一级片免费的| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美精品av麻豆av| 国产一卡二卡三卡精品| 国产激情久久老熟女| 国产精品久久久av美女十八| 欧美成人免费av一区二区三区 | 国产精品久久久av美女十八| 久久久久国产一级毛片高清牌| 十八禁高潮呻吟视频| 日本一区二区免费在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 在线观看免费午夜福利视频| 在线观看免费视频日本深夜| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 亚洲视频免费观看视频| 正在播放国产对白刺激| 国产精品免费一区二区三区在线 | 热re99久久国产66热| 岛国毛片在线播放| 午夜福利视频精品| 午夜福利在线免费观看网站| 香蕉久久夜色| 51午夜福利影视在线观看| 香蕉久久夜色| 日本a在线网址| 亚洲专区字幕在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 少妇的丰满在线观看| 男女午夜视频在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 免费少妇av软件| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品亚洲成a人片在线观看| 免费不卡黄色视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 最黄视频免费看| 悠悠久久av| 久久久国产成人免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品人妻1区二区| 性少妇av在线| 国产精品久久久av美女十八| 2018国产大陆天天弄谢| 另类亚洲欧美激情| 91大片在线观看| 蜜桃在线观看..| 搡老乐熟女国产| 久久天堂一区二区三区四区| 国产精品一区二区免费欧美| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久久水蜜桃国产精品网| 色视频在线一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 男男h啪啪无遮挡| 成人免费观看视频高清| 美国免费a级毛片| 91av网站免费观看| 色老头精品视频在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲专区国产一区二区| 欧美乱妇无乱码| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日韩有码中文字幕| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 亚洲成a人片在线一区二区| videos熟女内射| 成年女人毛片免费观看观看9 | 狠狠精品人妻久久久久久综合| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产成人免费无遮挡视频| 一区福利在线观看| av片东京热男人的天堂| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产成人精品无人区| 国产免费视频播放在线视频| 久热这里只有精品99| 日韩中文字幕视频在线看片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲av电影在线进入| 青青草视频在线视频观看| 国产又爽黄色视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 久热爱精品视频在线9| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久青草综合色| av视频免费观看在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 99久久人妻综合| 桃花免费在线播放| 国产又色又爽无遮挡免费看| av天堂久久9| 91精品三级在线观看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲av电影在线进入| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美在线一区亚洲| 国产精品亚洲一级av第二区| av福利片在线| 亚洲全国av大片| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产在线观看jvid| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美黄色片欧美黄色片| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 18禁国产床啪视频网站| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 纯流量卡能插随身wifi吗| 婷婷成人精品国产| 18在线观看网站| 怎么达到女性高潮| 久久久久精品国产欧美久久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产精品 国内视频| 看免费av毛片| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产片内射在线| tube8黄色片| 国产av又大| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 性色av乱码一区二区三区2| 国产亚洲欧美精品永久| 嫩草影视91久久| 久久九九热精品免费| 精品福利观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 香蕉国产在线看| 精品国产国语对白av| 国产欧美日韩一区二区三| 91麻豆av在线| 国产xxxxx性猛交| www.熟女人妻精品国产| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 老鸭窝网址在线观看| 不卡一级毛片| 亚洲免费av在线视频| h视频一区二区三区| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 日本av免费视频播放| 乱人伦中国视频| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 午夜日韩欧美国产| 夜夜爽天天搞| 久久久久久久大尺度免费视频| 日韩大片免费观看网站| 日韩欧美三级三区| 国产av国产精品国产| 91av网站免费观看| 日韩一区二区三区影片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 午夜福利欧美成人| 精品少妇久久久久久888优播| 久久国产精品大桥未久av| 老司机在亚洲福利影院| 99香蕉大伊视频| 午夜福利视频在线观看免费| 久久午夜综合久久蜜桃| 老司机影院毛片| 午夜激情av网站| 久久久国产成人免费| 一个人免费看片子| 国产一区二区 视频在线| 国产在线免费精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 在线看a的网站| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲国产av影院在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 黄色怎么调成土黄色| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲精品成人av观看孕妇| 99热国产这里只有精品6| 国产日韩欧美在线精品| 国产成人av激情在线播放| 久久中文字幕一级| 麻豆乱淫一区二区| 久久这里只有精品19| 久久亚洲精品不卡| 国产av国产精品国产| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 婷婷成人精品国产| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产成人影院久久av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 欧美中文综合在线视频| 日韩三级视频一区二区三区| 飞空精品影院首页| 午夜福利,免费看| 亚洲精品av麻豆狂野| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 91精品国产国语对白视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产老妇伦熟女老妇高清| 18禁美女被吸乳视频| 9热在线视频观看99| 麻豆av在线久日| 国产精品国产高清国产av | 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品久久久精品久久久| 国产精品av久久久久免费| 亚洲专区字幕在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 女性被躁到高潮视频| 亚洲黑人精品在线| 手机成人av网站| 一级片免费观看大全| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 久久人妻av系列| 免费在线观看完整版高清| xxxhd国产人妻xxx| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国精品久久久久久国模美| 一个人免费在线观看的高清视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 女人久久www免费人成看片| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品一区二区精品视频观看| 中国美女看黄片| 一区二区三区激情视频| 久久久久久久久久久久大奶| 在线观看66精品国产| 中国美女看黄片| 999久久久精品免费观看国产| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精品自拍成人| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品久久久久久电影网| 国产男靠女视频免费网站| 国产成人欧美在线观看 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美精品av麻豆av| 久久久精品免费免费高清| 搡老乐熟女国产| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产伦理片在线播放av一区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品免费一区二区三区在线 | 国产欧美日韩一区二区精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 午夜老司机福利片| 搡老岳熟女国产| www.精华液| 一区福利在线观看| 制服人妻中文乱码| kizo精华| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一个人免费在线观看的高清视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 中文字幕制服av| 国产单亲对白刺激| 国产91精品成人一区二区三区 | 精品乱码久久久久久99久播| 在线观看免费高清a一片| 男女之事视频高清在线观看| 精品国产国语对白av| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久午夜亚洲精品久久| 嫩草影视91久久| 大码成人一级视频| 丁香欧美五月| 久久热在线av| 国产av精品麻豆| 色老头精品视频在线观看| 制服诱惑二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 大码成人一级视频| a级片在线免费高清观看视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| kizo精华|