HIF-1α和COX-2在力學(xué)誘導(dǎo)大鼠終板軟骨細(xì)胞退變模型中的表達(dá)及意義

徐永明，高智，肖良，徐宏光，張曉玲

（1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬弋磯山醫(yī)院脊柱外科，安徽 蕪湖 241001；2.中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院骨科細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025）

醫(yī)學(xué)與護(hù)理

HIF-1α和COX-2在力學(xué)誘導(dǎo)大鼠終板軟骨細(xì)胞退變模型中的表達(dá)及意義

徐永明1，高智1，肖良1，徐宏光1，張曉玲2

（1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬弋磯山醫(yī)院脊柱外科，安徽 蕪湖 241001；2.中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院骨科細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025）

目的：探討缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）和環(huán)氧化酶2（COX-2）在間歇性循環(huán)牽張力作用下誘導(dǎo)大鼠終板軟骨細(xì)胞退變中的表達(dá)情況及意義.方法：應(yīng)用胰酶消化法獲得大鼠終板軟骨細(xì)胞，用FX-5000T儀器給予終板軟骨細(xì)胞施加10%牽張力、0.5Hz、8h/d的力學(xué)刺激誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞退變，實(shí)驗(yàn)中設(shè)對(duì)照組（無(wú)力學(xué)刺激）和實(shí)驗(yàn)組（10%、0.5Hz、8h/d力學(xué)刺激），甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞形態(tài)及二型膠原分泌情況，RT-PCR及Western blotting分別檢測(cè)軟骨細(xì)胞中HIF-1α、COX-2的mRNA和蛋白水平變化.結(jié)果：大鼠終板軟骨細(xì)胞給予一定力學(xué)刺激后出現(xiàn)退變改變，軟骨相關(guān)合成基因表達(dá)水平降低，實(shí)驗(yàn)組中HIF-1α、COX-2的mRNA及蛋白水平表達(dá)均較對(duì)照組增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05）.結(jié)論：HIF-1α、COX-2在力學(xué)誘導(dǎo)大鼠終板軟骨細(xì)胞退變模型中表達(dá)水平均增高，進(jìn)一步推測(cè)其與椎間盤退變過(guò)程有關(guān).

HIF-1α；COX-2；椎間盤退變；力學(xué)刺激

頸腰痛作為骨科一種常見病，隨著社會(huì)的發(fā)展，其發(fā)病率不斷增加，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量以及日常工作.椎間盤退變目前認(rèn)為是引起該疾病的主要因素之一[1]，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為引起椎間盤退變是由多種因素相互作用所導(dǎo)致的結(jié)果.前期有研究表明在髓核細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）表達(dá)明顯，敲除該因子后小鼠髓核細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡，導(dǎo)致椎間盤發(fā)生退變改變[2].Agrawal等報(bào)道HIF-1α可通過(guò)調(diào)控蛋白聚糖（ACAN）mRNA和蛋白合成影響椎間盤退變[3]，HIF-1α在腰椎間盤退變過(guò)程中伴有重要角色[4].同時(shí)相關(guān)研究證明環(huán)氧化酶2（COX-2）可通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)進(jìn)而影響椎間盤中微血管生成[5].我們前期研究報(bào)道大鼠終板軟骨細(xì)胞給予一定力學(xué)刺激后與軟骨相關(guān)的SOX9、二型膠原（COL2A1）、ACAN等有基因及蛋白水平發(fā)生變化，軟骨細(xì)胞發(fā)生退變改變[6]，然而HIF-1α、COX-2在力學(xué)誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞退變模型中的鮮有報(bào)道，希望通過(guò)本研究進(jìn)一步明確HIF-1α及COX-2與椎間盤退變之間關(guān)系，為明確椎間盤退行性疾病的病因提供一種新的認(rèn)識(shí).

1 材料與方法

1.1 大鼠原代終板軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng)

6只Sprague Dawley大鼠（6-8w、體重160±10g）購(gòu)買至上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司大鼠，處死后用75%酒精浸泡消毒15min，消毒后在無(wú)菌超凈臺(tái)中取出整段腰椎，組織剪剔除多余的組織后用含1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）配制的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2-3次，眼科剪將清洗后的終板軟骨組織剪成碎片（約1mm3），將獲得碎片樣終板軟骨組織給予0.25%胰酶（Gibco，美國(guó)）消化45min后再加入0.2%的II型膠原酶（Sigma，美國(guó)）消化4-6h，懸液過(guò)濾3次后以1500r/min離心5min，去除消化液后用PBS洗滌2次，最后加入含10%胎牛血清（Gibco，美國(guó)）的DMEM/F12（Hy-Clone，美國(guó)）培養(yǎng)液吹打混勻后接種至10cm培養(yǎng)皿中并放置入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（37℃含5%CO2），根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每2-3d更換培養(yǎng)液1次，細(xì)胞融合至85-90%時(shí)按1：3傳代，本實(shí)驗(yàn)中取P2代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2 力學(xué)誘導(dǎo)大鼠終板軟骨細(xì)胞退變模型建立

將上述方式所獲得P2代細(xì)胞按密度1.5×105個(gè)接種至每孔中含2ml培養(yǎng)液（含10%胎牛血清的DMEM/F12）的6孔BioFlexTM加力板（Flexcell國(guó)際公司，美國(guó)）中，實(shí)驗(yàn)設(shè)立對(duì)照組(無(wú)力學(xué)刺激)和實(shí)驗(yàn)組(10%循環(huán)牽張力，0.5Hz，8 h/d)，待細(xì)胞融合至70-80%時(shí)實(shí)驗(yàn)組給予FX-5000T細(xì)胞應(yīng)變加載系統(tǒng)（Flexcell國(guó)際公司，美國(guó)）施加上述力學(xué)條件刺激不同天數(shù)，兩組細(xì)胞均置于同一培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃含5%CO2）.

1.3 甲苯胺藍(lán)細(xì)胞染色

分別取10%循環(huán)牽張力，0.5Hz，8h/d力學(xué)刺激7d及無(wú)力學(xué)刺激的兩組大鼠終板軟骨細(xì)胞，吸除每孔中培養(yǎng)液分別加入1.5ml 4%多聚甲醛溶液固定45min，PBS洗滌2次后每孔加入2ml 1%的甲苯胺藍(lán)染色常溫浸染1h后，電動(dòng)吸引器吸除多余染料，待自然晾干后熒光顯微鏡下及數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照.

1.4 大鼠終板軟骨細(xì)胞RNA提取及RT-PCR

將上述力學(xué)刺激及無(wú)力學(xué)刺激的大鼠終板軟骨細(xì)胞用PBS洗滌3次后每孔加入1.5ml Trizol置于冰上充分裂解45min，按照廠家說(shuō)明方法提取RNA,用Nano-Drop2000儀器（Thermo＆Scientific，美國(guó)）測(cè)定所獲的RNA濃度并分析其純度，OD260/OD280值在1.8-2.0之間的RNA樣本進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，按20μl體系反轉(zhuǎn)成cDNA，反轉(zhuǎn)后得到的cDNA稀釋12.5倍后點(diǎn)板進(jìn)行RT-PCR，每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)復(fù)孔.設(shè)定反應(yīng)條件：95℃預(yù)變30s；95℃變性5s；60℃退火延伸25s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán).取GAPDH為內(nèi)部參照.用Roche LightCycler480軟件自動(dòng)分析結(jié)果，計(jì)算2-△△Ct值，實(shí)驗(yàn)中PCR所合成的基因均由上海生工公司合成，相關(guān)引物序見表1.

表1 RT-PCR引物序列

1.5 Western blotting檢測(cè)

按1.2所描述將兩組六孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液去除后PBS洗滌3次，各孔加入150μl RIPA（含1%PMSF）裂解液置于冰上裂解45min，分別吸取每孔中的液體至1.5ml離心管中，12000r/min、4℃離心15min后用1ml槍頭吸除離心管底中透明果凍樣細(xì)胞碎片，小心吸取離心管上層液體并計(jì)算所得量，每孔分別取10μl液體用BCA定量法測(cè)定所得到蛋白濃度，剩余液體用4×蛋白loading buffer稀釋至1×并置于99℃、900r/min煮15min使蛋白變性，配制10%分離膠并按20μg每孔蛋白濃度上樣，十二烷基酸鈉聚丙烯酸銨（SDS-PAGE）凝膠電泳，分離膠跑30min后濃縮膠跑70min, 300mA4℃冷庫(kù)中轉(zhuǎn)膜150min.5%牛血清白蛋白(BSA)常溫?fù)u床上封閉2h，一抗（5%BSA稀釋1:800），4℃冷庫(kù)搖床上孵育過(guò)夜后TBST洗滌三次，每次5min，用二抗（5%BSA稀釋1:2000）室溫?fù)u床孵育1h后再次用TBST洗膜三次，凝膠成像系統(tǒng)（Tanon，中國(guó)）進(jìn)行拍照，實(shí)驗(yàn)中主要有關(guān)抗體GAPDH(Cell Signaling Technology,14C10,美國(guó)),SOX9(Abways,CY5400,中國(guó)),COL2A1(Bioworld,P02458,美國(guó))，COX-2(Abways,CY3818,中國(guó))，HIF-1α（Abways，CY2173，中國(guó)）.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體外力學(xué)刺激后大鼠終板軟骨細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化

實(shí)驗(yàn)中大鼠終板軟骨細(xì)胞在間歇性循環(huán)牽張力（10%、0.5Hz、8h/d）刺激7天后，倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)由多角狀形逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形狀，局部細(xì)胞形態(tài)較為紊亂，甲苯胺藍(lán)染色見實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞二型膠原分泌較對(duì)照組減少（見圖1）.

2.2 力學(xué)刺激誘導(dǎo)大鼠終板軟骨細(xì)胞出現(xiàn)退變

大鼠終板軟骨細(xì)胞分別應(yīng)用10%間歇性循環(huán)牽張力、0.5Hz、8h/d刺激1d、3d、7d后，RT-PCR與Western blotting分別檢測(cè)軟骨合成相關(guān)基因（SOX9、COL2A1、ACAN）及蛋白（COL2A1、SOX9）水平表達(dá)隨力學(xué)刺激時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)水平逐漸降低，大鼠終板軟骨細(xì)胞出現(xiàn)退變改變（見圖2A-D）.

2.3 力學(xué)刺激對(duì)大鼠終板軟骨細(xì)胞中HIF-1α及COX-2 mRNA水平表達(dá)影響

圖1 對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組甲苯胺藍(lán)染色鏡下和整體改變.

圖2 A-C 10%間歇性循環(huán)牽張力、0.5Hz、8h/d刺激1d、3d、7d后軟骨細(xì)胞中SOX9、COL2A1、ACAN基因水平變化（?為P〈0.05,??為P〈0.01），D10%間歇性循環(huán)牽張力、0.5Hz、8h/d刺激7d后軟骨細(xì)胞中蛋白水平變化

我們發(fā)現(xiàn)大鼠終板軟骨細(xì)胞體外給予力學(xué)刺激后，實(shí)驗(yàn)組中COX-2 mRNA水平表達(dá)較對(duì)照組逐漸增高，HIF-1α在刺激1d時(shí)兩組之間mRNA水平變化無(wú)差異，但隨著力學(xué)刺激時(shí)間延長(zhǎng)，3d、7d時(shí)mRNA水平表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組中均較對(duì)照組增高（見圖3A-B）.

圖3 A-B10%間歇性循環(huán)牽張力、0.5Hz、8h/d刺激不同天數(shù)兩組大鼠終板軟骨細(xì)胞中HIF-1α、COX-2基因水平變化（?為P〈0.05,??為P〈0.01），C兩組大鼠終板軟骨細(xì)胞中HIF-1α、COX-2蛋白水平改變

2.4 力學(xué)刺激對(duì)大鼠終板軟骨細(xì)胞中HIF-1α及COX-2蛋白水平表達(dá)影響

大鼠終板軟骨細(xì)胞體外給予10%間歇性循環(huán)牽張力、0.5Hz、8h/d分別刺激1d、3d、7d后，Western blotting檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組中HIF-1α及COX-2蛋白水平表達(dá)水平在3d、7d時(shí)均較對(duì)照組增高，蛋白表達(dá)水平與RT-PCR結(jié)果一致（見圖3C）.

3 討論

目前認(rèn)為椎間盤退變與遺傳、生活環(huán)境方式、機(jī)體免疫以及急慢性損傷等諸多因素有關(guān)，但上述因素中何種因素作為啟動(dòng)因素目前仍存在爭(zhēng)議，相關(guān)研究證實(shí)，椎間盤退變過(guò)程中生物力學(xué)影響具有重要意義，不恰當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激可導(dǎo)致椎間盤退變進(jìn)而出現(xiàn)腰腿痛[7]，終板軟骨細(xì)胞退變將進(jìn)一步引起椎間盤退變發(fā)生，因此明確力學(xué)在該過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制尤為重要.

缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）主要由HIF-1、HIF-2、HIF-3組成，是細(xì)胞低氧狀態(tài)下反應(yīng)最重要的調(diào)節(jié)因子，能有有效緩解組織缺血、缺氧.其中HIF-1由α及β兩個(gè)亞基組成，HIF-1的活性主要有α亞基決定.環(huán)氧化酶（COX）又稱前列腺酶，目前主要發(fā)現(xiàn)COX-1、COX-2，其中COX-2可通過(guò)調(diào)劑血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子進(jìn)而促進(jìn)微血管通透性增加，影響血管生成[8].

盡管有研究報(bào)道HIF-1α、COX-2在人退變的椎間盤及髓核組織中表達(dá)水平較正常人中增高[2,5]，但目前該結(jié)論尚未在體外誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞退變模型中得以驗(yàn)證，本研究首先通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠終板軟骨細(xì)胞，給予一定強(qiáng)度及頻率的牽張力刺激后誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生退變，成功建立體外大鼠終板軟骨細(xì)胞退變模型后，通過(guò)RT-PCR及Western blotting方法分別檢測(cè)HIF-1α、COX-2基因及蛋白水平變化，初步檢測(cè)在退變的終板軟骨細(xì)胞中表達(dá)量較正常終板軟骨細(xì)胞高，說(shuō)明HIF-1α、COX-2均參與終板軟骨細(xì)胞退變過(guò)程中相關(guān)調(diào)控，與椎間盤退行疾病有關(guān)，然而本實(shí)驗(yàn)現(xiàn)對(duì)其引起終板軟骨細(xì)胞退變的機(jī)制不清，我們暫無(wú)法在細(xì)胞水平觀察COX-2是否在終板軟骨細(xì)胞退變過(guò)程中對(duì)VEGF也進(jìn)行相關(guān)調(diào)控，力學(xué)刺激是否會(huì)引起細(xì)胞耗氧量的改變進(jìn)而通過(guò)HIF-1α調(diào)控影響細(xì)胞退變，這將都是我們下一步研究重點(diǎn)，希望通過(guò)闡明力學(xué)作用、COX-2、HIF-1α這三者間關(guān)系，進(jìn)一步加深對(duì)椎間盤退行性疾病有關(guān)認(rèn)識(shí).

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R681.5

A

1673-260X（2017）07-0023-03

2017-03-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（81572185）