近紅外光譜對(duì)蚌毒靈散中黃芩進(jìn)行整體定量分析研究

樊克鋒，湯法銀，孫素琴，周 群，王新杰

(1．河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院，河南 鄭州 450000;2．清華大學(xué)化學(xué)系，北京 海淀 100084; 3．北京仁森寶生物科技有限公司，北京 通州 101100)

近紅外光譜對(duì)蚌毒靈散中黃芩進(jìn)行整體定量分析研究

樊克鋒1，湯法銀1，孫素琴2，周 群2，王新杰3

(1．河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院，河南 鄭州 450000;2．清華大學(xué)化學(xué)系，北京 海淀 100084; 3．北京仁森寶生物科技有限公司，北京 通州 101100)

為了對(duì)中獸藥復(fù)方散劑建立一種單味中藥無(wú)損快速“整體定量”方法的分析研究。采用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)。結(jié)果:復(fù)方散劑中“黃芩整體含量”在樣品訓(xùn)練集測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)圖呈非常好的線性關(guān)系，預(yù)測(cè)結(jié)果滿意。表明該方法為廣泛應(yīng)用的中獸藥散劑中不同“單味中藥整體定量”分析研究提供一個(gè)新的無(wú)損快速測(cè)定技術(shù)。

近紅外光譜;黃芩;整體定量;無(wú)損快速

目前，中獸藥散劑在臨床應(yīng)用中仍占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(《獸藥典》中85%以上的中獸藥制劑仍然是散劑)，其復(fù)雜多樣的化學(xué)成分及作用機(jī)理仍然無(wú)法完全明晰，這給評(píng)價(jià)中獸藥藥理藥效和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定帶來(lái)了極大的困難。目前慣用方法仍然是模仿化學(xué)藥物的質(zhì)量控制模式，即以已知單一或幾個(gè)指標(biāo)成分作為質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)單一的定性和定量的分析，判斷中獸藥(復(fù)方)是否“合格”并制定非客觀質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。這樣做似乎是找到了一種看似合理的方法來(lái)評(píng)價(jià)中獸藥(復(fù)方)質(zhì)量，但是這種方法忽視了中獸藥整體性和復(fù)方協(xié)同作用。所以不能簡(jiǎn)單說(shuō)其中一個(gè)或幾個(gè)成分對(duì)疾病起作用，為了更好的對(duì)中獸藥(復(fù)方)進(jìn)行全面整體的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)，本試驗(yàn)利用近紅外光譜技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)，將中藥散劑中的某種“中藥整體”作為一個(gè)質(zhì)量指標(biāo)，無(wú)論含有多少成分都將這種中藥材看作一個(gè)整體。這樣既避免了樣品復(fù)雜前處理對(duì)物質(zhì)造成的流失，也較好符合中獸醫(yī)藥整體觀，同時(shí)更適合中獸藥散劑原狀態(tài)直接“無(wú)損快速”測(cè)定。

近紅外光譜同計(jì)算機(jī)和化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行非破壞分析。如在對(duì)藥物的定量分析方面，將近紅外光譜與偏最小二乘法(PLS)、主成分分析(PCA)及非線性人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法等相結(jié)合非侵入地測(cè)量了銀杏葉片［1］、黃連浸膏粉［2］、元胡止痛散［3］等中藥活性成分的含量和分布，及對(duì)甲璜酸加替沙星［4］、頭孢氨芐膠囊［5］、撲熱息痛片劑［6］、甲氧芐胺嘧啶［7］等進(jìn)行了定量分析，均取得了滿意的預(yù)測(cè)結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 儀器設(shè)備及測(cè)試條件 儀器設(shè)備:近紅外光譜儀采用布魯克公司的VECTOR 22-NIR型傅立葉變換近紅外光譜儀，配有PbS和InGaAs檢測(cè)器、外接積分球、樣品旋轉(zhuǎn)器和固體光纖探頭;PentiumⅢPC機(jī)。

測(cè)試條件:樣品粉末分別取適量放入石英樣品杯中，分布均勻，輕輕壓平。測(cè)樣方式:積分球漫反射;分辨率:8 cm-1;掃描次數(shù):64次;掃描范圍: 12 000～4 000 cm-1;溫度:20℃;空氣濕度:60%;每個(gè)樣品重復(fù)3次，求平均光譜。

1．2 試驗(yàn)樣品材料來(lái)源及制備方法 樣品材料來(lái)源 以2010年版《中國(guó)獸藥典》二部中“蚌毒靈散”［8］為研究對(duì)象，處方為:黃芩60 g，黃柏20 g，大黃10 g，大青葉10 g，即主藥黃芩含量為60%，藥材飲片購(gòu)于北京同仁堂(鄭州店)。

樣品制備方法:分別取各味藥材適量，低溫干燥，取黃芩單獨(dú)粉碎100目細(xì)粉，黃柏、大黃和大青葉按處方比例混合粉碎100目細(xì)粉，備用。依據(jù)處方要求，分別精密稱量、等量遞增混合制備黃芩含量5%～70%的70份樣品，得訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集樣本。其編號(hào)如表1。

1．3 樣品近紅外光譜采集 將70份樣品粉末分別取適量放入石英樣品杯中，混合均勻，輕輕壓平，按上述測(cè)試條件進(jìn)行掃描，每個(gè)樣品重復(fù)3次，求平均光譜，70份蚌毒靈散樣品的近紅外光譜疊加見(jiàn)中插彩版圖1。

1．4 定量校正模型的建立

表1 黃芩不同含量70份散劑樣品編號(hào)

1．4．1 光譜預(yù)處理方法的選擇 通過(guò)比較不同預(yù)處理方法對(duì)RMSECV(均方差，即交叉驗(yàn)證誤差均方根)和R2(相關(guān)系數(shù))的影響，最終選擇了Vector Normalization(矢量歸一化)預(yù)處理的方法對(duì)70分樣品進(jìn)行建模。此時(shí)RMSECV分別為0．963;R2分別為99．77。預(yù)處理圖譜見(jiàn)中插彩版圖2。

1．4．2 建模譜段的選擇 選擇合適的波段對(duì)于建立定量模型來(lái)說(shuō)是非常重要的。本文以RMSECV和R2為衡量的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選出模型最合適的波段。結(jié)果選擇波段為6102～5446 cm－1，Rank=4。

1．4．3 樣品定量模型的建立 運(yùn)用Bruker OPUS/ QUANT22定量分析軟件中PLS法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，其中60份樣品作為校正樣品集，8份樣品作為預(yù)測(cè)樣品集。訓(xùn)練集樣品通過(guò)軟件分析，36，38號(hào)樣品為建模溢出值，將其刪除后，建立模型更為準(zhǔn)確。用校正樣品集進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證RMSECV=0．963，R2=99．77(如圖3)，確定最佳主成份數(shù)為4(如圖4)。近紅外光譜法測(cè)得值與真實(shí)值之間的絕對(duì)誤差在±1%之間(如圖5)。

圖3 訓(xùn)練集測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)圖(Rank:4 R2=99．77 RMSECV=0．963)

圖4 訓(xùn)練集RMSECV與Rank之間的相關(guān)圖(Rank:4 R2=99．77 RMSECV=0．963)

圖5 訓(xùn)練集絕對(duì)誤差與真實(shí)值之間的相關(guān)圖(Rank:4 R2=99．77 RMSECV=0．963)

2 結(jié)果

將前述所建立的定量校正模型用于對(duì)8份樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表2。

表2 檢驗(yàn)集樣品預(yù)測(cè)結(jié)果

檢驗(yàn)集預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在黃芩的投藥量相差10%的范圍內(nèi)預(yù)測(cè)結(jié)果還是比較準(zhǔn)確的，可以成功的分出不同投藥量的樣品。

3 討論

3．1 在模型建立的過(guò)程中，取樣和混合是非常重要的，藥材混合是否均勻直接影響到模型建立的好壞。為了盡量消除混合均勻的問(wèn)題，首先制樣時(shí)按等量遞增法混合，再者測(cè)定時(shí)從混合樣品的不同部位取樣，另外在測(cè)定過(guò)程中，采取多次測(cè)量取平均圖譜的方法，盡量消除混合不均勻和顆粒大小不均勻?qū)y(cè)量的影響。

3．2 由于樣品只是添加的黃芩多少不同，在近紅外原始光譜圖上很難看出差異。但將近紅外光譜技術(shù)與計(jì)算機(jī)技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，對(duì)原始圖譜進(jìn)行必要的預(yù)處理之后，就會(huì)在處理過(guò)的圖譜中顯示出各個(gè)樣品的不同，這種不同與化學(xué)值(稱量值)是一一對(duì)應(yīng)的。

3．3 在建立模型的時(shí)候，本文將黃芩作為一個(gè)整體這是一種新的嘗試。按不同的比例投入黃芩，不再測(cè)定指標(biāo)成分黃芩苷的含量，而是將黃芩整體的投入量直接作為基礎(chǔ)值。因此訓(xùn)練集測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)圖呈非常好的線性關(guān)系。雖然樣品的含量不是分散的而是等比例增加的，但預(yù)測(cè)結(jié)果令人滿意，說(shuō)明模型的建立還是成功的。如果可以將投藥量的密度進(jìn)一步的減小，建立的模型可能會(huì)更好，這種新的嘗試值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)將復(fù)方蚌毒靈散劑中“黃芩整體”當(dāng)作一種指標(biāo)，采用PLC法建立近紅外光譜方模型，內(nèi)部交叉驗(yàn)證RMSECV=0．963，R2=99．77，確定最佳主成分?jǐn)?shù)為4。近紅外光譜法測(cè)得值與真實(shí)值之間的絕對(duì)誤差在±1%之間，基本上可以分出5% ～70%的樣品。通過(guò)預(yù)測(cè)值結(jié)果可以看出，樣品近紅外光譜與黃芩藥材之間存在一定的相關(guān)性，因此將該方法用于黃芩原藥材占有量的測(cè)定基本可行，在擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)樣品集的數(shù)量后，有望獲得結(jié)果更可靠的數(shù)學(xué)模型。如果模型能夠建立就可以很方便地監(jiān)督投藥量是否合乎處方，監(jiān)督是否減少了貴重藥材的投藥量。

利用近紅外光譜技術(shù)對(duì)中藥復(fù)方中單味藥材“整體定量”的初步研究。嘗試了將整體藥材作為指標(biāo)性成分，建立了快速定量檢測(cè)處方中某種藥材占有量的新方法。在建立模型的時(shí)候，不再測(cè)定它們單一指標(biāo)成分含量，按不同的比例將黃芩的投入量整體直接作為基礎(chǔ)值。因此訓(xùn)練集測(cè)定值與真實(shí)值之間的相關(guān)圖呈非常好的線性關(guān)系，預(yù)測(cè)結(jié)果令人滿意，說(shuō)明模型的建立還是成功的。進(jìn)一步可以將投藥量的密度進(jìn)一步的減小，建立的模型可能會(huì)更好，這種新的嘗試值得進(jìn)一步研究。

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0529-6005(2017)06-0102-03

2016-09-27

河南省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2008A230010)

樊克鋒(1973-)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槔矛F(xiàn)代分析手段對(duì)中藥品質(zhì)的研究，E-mail:fanke333@aliyun．com