一起急性腹瀉疫情中檢出的GI.8型諾如病毒的序列測定和分子特征分析

紀(jì) 蕾，吳曉芳，陳莉萍，韓建康

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一起急性腹瀉疫情中檢出的GI.8型諾如病毒的序列測定和分子特征分析

紀(jì) 蕾，吳曉芳，陳莉萍，韓建康

目的 對湖州地區(qū)一起急性腹瀉疫情中檢出的GI.8型諾如病毒進行序列測定和分子特征分析。方法 根據(jù)GI型諾如病毒保守序列自行設(shè)計5對引物，用一步法RT-PCR分段擴增GI.8型諾如病毒CHN/Huzhou/N10的全基因組序列，采用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對序列進行整理和分析。結(jié)果 CHN/Huzhou/N10全長7 740 bp，編碼區(qū)包括3個開放讀碼框架(ORF1～ORF3)，分別長5 400 bp(5～5 404 nt)、 1 632 bp(5 388～7 019 nt)和642 bp(7 019～7 660 nt)。RdRp區(qū)，VP1區(qū)和VP2區(qū)的系統(tǒng)進化分析顯示CHN/Huzhou/N10屬于GI.8基因型。衣殼蛋白區(qū)的氨基酸序列分析表明，與原型株Boxer/2001/US相比，CHN/Huzhou/N10 VP1區(qū)的氨基酸序列共有16個變異位點，12個位于P2區(qū)。其中aa347T→S，aa397T→E這2個變異位點分別位于HBGA受體結(jié)合袋位點II和III內(nèi)。結(jié)論 本文獲得了我國GI.8型諾如病毒CHN/Huzhou/N10的全基因組序列，相關(guān)序列信息可用于病毒的遺傳進化研究、快速診斷試劑的研發(fā)以及疫苗的設(shè)計。

諾如病毒；GI.8；全基因組

急性腹瀉是世界上最常見的疾病之一，也是全球主要的公共衛(wèi)生問題之一。自從敏感的分子檢測技術(shù)的應(yīng)用以來，諾如病毒(Norovirus，NoV)已被公認(rèn)為是發(fā)達國家和發(fā)展中國家急性病毒性腹瀉的重要病原。該病毒常可通過污染的水源和食物引起急性胃腸炎的流行，各年齡人群普遍易感。根據(jù)病毒主要衣殼蛋白VP1的核苷酸序列差異，NoV可分為6個基因群(gene group I～VI，GI～GVI)，其中可以引起人類感染包括基因群GI、GII和GIV[1]。在引起急性胃腸炎流行的NoV中，GII型NoV一直處于優(yōu)勢地位，其中GII.4型是流行的主要基因型別。因此目前國內(nèi)外有關(guān)GII型NoV的分子流行病學(xué)研究相對較多，而GI型NoV的序列研究相對較少。湖州地區(qū)2008-2009年2起由GI型NoV引起的急性腹瀉疫情中均檢出了GI.8型NoV[2]，我們對檢出的其中一株GI.8型NoV進行測序，以了解其基因結(jié)構(gòu)和遺傳特征。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本信息 湖州地區(qū)2008年4月某學(xué)校一起NoV引起的急性腹瀉疫情中采集的學(xué)生糞便標(biāo)本。該份標(biāo)本經(jīng)RT-PCR檢測顯示GI型NoV核酸陽性，RT-PCR引物探針參照文獻[3]，部分衣殼蛋白序列分析顯示為GI.8型NoV[2]。

1.2 病毒核酸提取和基因組擴增 病毒核酸提取采用羅氏公司High Pure Viral RNA Kit。取糞便加入無菌磷酸鹽緩沖液制成15%懸液?；靹蚝? 500 r/min離心8 min，取200 μL上清參照試劑盒說明書提取核酸。利用5對引物擴增病毒的全基因組序列，其中 9條為參照GenBank上下載的GI型NoV全基因組序列保守區(qū)自行設(shè)計的引物， 1條用于擴增病毒3′末端的下游引物TX30SXN5則參照已發(fā)表文獻[4]。引物序列具體見表1，引物位置參照毒株NV68 (M87661)。采用大連寶生物公司的PrimeScript OneStep RT-PCR kit進行序列的擴增。反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min；94 ℃ 1.5 min； 94 ℃ 45 s、55 ℃ 35 s、72 ℃ 2 min，40次循環(huán)；72 ℃延伸10 min(其中F1和R1擴增延伸3.5 min，F(xiàn)4和R4擴增延伸1mim)。PCR擴增陽性產(chǎn)物送南京金斯瑞公司進行純化測序。

表1 NoV全基因組擴增引物

Tab.1 Primers used for the full-length genome amplification

引物名稱Primer方向Polarity序列(5′?3′)Sequences(5′?3′)位置PositionF1+GTGAATGATGATGGCGTCGAAA1?22R1-GAGGTAGGGGTTGTGGGGTTGA3629?3650F2+GGNGAAACHGAAATGGAAATCCG3104?3126R2-CTGGGTCAAAWTCTATGTCAGTMGA4886?4910F3+GGAAGAATGATGATTGGAATGGCAC4221?4245R3-CGTCCTTAGACGCCATCATCATTTA5356?5379F4+TAGTCAGGCAACAGGTGGAT4983?5002R4-TGGTAAAGGTTCAGCCGTAT5432?5455F5+AAATGATGATGGCGTCTAAGGACG5356?5379TX30SXN5-GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTPolyA

1.3 序列的遺傳進化分析 利用DNAStar的SeqMan軟件包和MegAlign軟件包對測序結(jié)果進行整理及序列的同源性分析。應(yīng)用MEGA6.0 軟件采用N-J模型進行系統(tǒng)進化分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié) 果

2.1 病毒基因組結(jié)構(gòu)特征 GI.8型NoV湖州株CHN/Huzhou/N10的基因組全長7 740 bp，編碼區(qū)包括3個開放讀碼框架(Open reading frames，ORF)。ORF1長5 400 bp(5～5 404 nt)，編碼包含RNA依賴的RNA多聚酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)在內(nèi)的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2長1 632 bp(5 388～7 019 nt)， ORF3長642 bp(7 019～7 660 nt)，分別編碼病毒的主要衣殼蛋白VP1和小衣殼蛋白VP2。CHN/Huzhou/N10的序列已上傳GenBank，登錄號為KP407450。

2.2 系統(tǒng)進化分析 從GenBank上下載GI.I～GI.9基因型NoV代表株的序列進行同源比對和分析。核苷酸序列的同源性分析顯示CHN/Huzhou/N10在RdRp區(qū)(4 593～5 404 bp)、VP1區(qū)(5 388 bp～7 019 bp)和VP2區(qū)(7 019 bp～7 660 bp)均與GI.8型代表株的同源性最高(92.8%～99.6%)。分別構(gòu)建RdRp區(qū)，VP1區(qū)和VP2區(qū)的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖1。CHN/Huzhou/N10在各區(qū)均與GI.8基因型代表株聚為一簇，屬于GI.8基因型，以上結(jié)果表明CHN/Huzhou/N10未發(fā)生重組。用于序列比對分析的GI型NoV各基因型代表株分別為GI.1_M87661，GI.2_L07418，GI.3_U04469，GI.4_AB042808，GI.5_AB039774，GI.6 _AF093797，GI.7_JN603251(RdRp區(qū))，GI.7_AJ277609(VP1區(qū))，GI.7_ JN899243(VP2區(qū))，GI.8_GU299761(RdRp區(qū))，GI.8_AF538079(VP1區(qū)和VP2區(qū))，GI.9_HQ637267。

2.3 衣殼蛋白VP1區(qū)的序列分析 CHN/Huzhou/N10 VP1區(qū)全長1 629 bp，編碼543個氨基酸。GenBank數(shù)據(jù)庫上下載已有的GI.8型NoV的VP1全序列，包括GI.8型原型株Boxer/2001/US、Beijing/53671/2007/、JP/2007/Nagoya/KY531和2008890321/2008/US。CHN/Huzhou/N10與原型株Boxer/2001/US衣殼蛋白區(qū)的氨基酸同源性為96.9%，與其他3株的氨基酸同源性為99.4%～99.6%。與原型株Boxer/2001/US相比，CHN/Huzhou/N10 VP1區(qū)的氨基酸序列共有16個變異位點,其中12個位于P2區(qū)，占8.5%。在其他區(qū)域，變異位點的數(shù)量和比例要小的多，分別為N端2個，占4.1%；S區(qū)1個，占0.6%；P1區(qū)1個，占0.6%，具體見表3。除了第357位的aa357H→R為CHN/Huzhou/N10所特有，其余11個位于P2區(qū)的變異位點為Beijing/53671/2007/、JP/2007/Nagoya/KY531、2008890321/2008/US和CHN/Huzhou/N10所共有，見圖2。其中aa347T→S，aa397T→E 這2個變異位點分別位于人外周血組織抗原(HBGA)結(jié)合位點II和III[5]。

表2 CHN/Huzhou/N10 RdRp、VP1、VP2區(qū)的核苷酸序列同源性分析(%)

Tab.2 Nucleotide identity of RdRp，VP1，and VP2 region between2008/Huzhou/N11 and the representatives of GI.1-GI.9 genotypes(%)

GI．IGI．2GI．3GI．4GI．5GI．6GI．7GI．8GI．9RdRp75．776．682．374．075．576．179．199．678．8VP164．564．570．662．963．864．266．792．868．7VP258．556．947．854．756．559．461．893．770．1

A. RdRp 區(qū)B. VP1區(qū) C. VP2區(qū)圖1 CHN/Huzhou/N10 RdRp區(qū)、VP1區(qū)、VP2區(qū)序列系統(tǒng)進化分析Fig.1 Phylogenetic analyses based on partial RdRp gene(A)， complete VP1 gene (B) and VP2 gene (C)

表3 NoV湖州株CHN/Huzhou/N10衣殼蛋白區(qū)氨基酸水平變異位點分析

Tab.3 Variation sites in the capsid protein VP1 of CHN/Huzhou/N10

區(qū)域Domainaa位置aapositionaa長度Totallength(aa)變異位點所占比例No．(%)ofinformativeaaN1?49492(4．1)S50?2191701(0．6)P1227?279，420?5431771(0．6)P2280?41914012(8．5)

圖2 NoV湖州株CHN/Huzhou/N10衣殼蛋白P2區(qū)的變異位點分析Fig.2 Variation sites in the capsid protein P2 region of CHN/Huzhou/N10

3 討 論

NoV基因型別眾多，根據(jù)病毒VP1區(qū)的核苷酸序列差異，GI型NoV可進一步分為9個基因型(GI.1～GI.9)，其中Boxer/2001/US是GI.8型的原型參考株[6]。此外，作為RNA病毒，NoV易發(fā)生變異和重組，這些重組株的RdRp和VP1區(qū)基因分屬于不同基因型。目前已發(fā)現(xiàn)的GI型NoV重組株包括GI.2/GI.6，GI.d/GI.3等[7-8]。因此全基因組序列的獲得將有助于更全面準(zhǔn)確的對病毒進行遺傳進化分析。我們用自行設(shè)計的5對引物成功擴增了GI.8型NoV湖州株CHN/Huzhou/N10的全基因組序列， RdRp、VP1和VP2區(qū)的同源性分析和系統(tǒng)進化結(jié)果分析表明CHN/Huzhou/N10為GI.8型，未發(fā)生重組現(xiàn)象。

衣殼蛋白VP1作為NoV的主要結(jié)構(gòu)蛋白可以折疊成2個區(qū)域，形成內(nèi)殼的S區(qū)(Shell，S)和形成拱樣凸起的P區(qū)(Protruding，P)。P區(qū)包括P1和P2兩個亞區(qū)，分別構(gòu)成拱樣凸起的基底部和頂部，P2區(qū)位于衣殼的最外面，被認(rèn)為是抗體識別和受體結(jié)合的關(guān)鍵部位，也是病毒序列最易變異的區(qū)域。目前GenBank上已有的GI.8型VP1全序列僅有5條，除了原型株Boxer/2001/US外，其余4條分別來自于2007-2008年中國、日本和美國檢出的GI.8型NoV(Beijing/53671/2007/、JP/2007/Nagoya/KY531、2008890321/2008/US、CHN/Huzhou/N10)。此外，文獻表明2008年杭州余杭地區(qū)的多起胃腸炎暴發(fā)中也曾檢出GI.8型NoV[9]。以上有限的序列信息和文獻報道提示GI.8型NoV在2008年前后在我國及其他國家有一定的流行。進一步VP1區(qū)氨基酸序列的分析表明，與原型株Boxer/2001/US相比，2007年以來檢出的GI.8型NoV在P2區(qū)有11個共有的變異位點，其中aa347T→S，aa397T→E 這兩個變異位點分別位于HBGA受體結(jié)合袋位點II和III內(nèi)。這些位于P2區(qū)的氨基酸變異是否導(dǎo)致病毒抗原性和受體結(jié)合模式發(fā)生變化，從而影響了病毒的感染與流行，值得進一步研究。

NoV尚無法進行常規(guī)的細胞培養(yǎng)，基于分子生物學(xué)技術(shù)其進行遺傳進化研究是目前認(rèn)識病毒的重要方法。目前GenBank中唯一的1條GI.8基因組全序列(KJ196298)由日本上傳，本文獲得了我國GI.8型諾如病毒CHN/Huzhou/N10的全基因組序列，相關(guān)序列信息可用于病毒的遺傳進化研究、快速診斷試劑的研發(fā)以及疫苗的設(shè)計。

[1] White PA. Evolution of norovirus[J]. Clin Microbiol Infect，2014，20(8): 741-745. DOI: 10.1111/1469-0691.12746[2] Ji L，Chen L，Wu X，et al. Rapid emergence of novel GII.4 sub-lineages noroviruses associated with outbreaks in Huzhou，China，2008-2012[J]. PLoS ONE，2013，8(12): e82627. DOI: 10.1371/journal.pone.0082627

[3] Qian MM，Xu HY，Zong Q，et al. Establishment of conventional RT-PCR and real-time RT-PCR to detect norovirus and its application[J].Chin J Zoonoses，2015，31(7): 602-606. DOI:10.3696/j.issn.1002-2694.2015.07.002 (in Chinese)

錢明明，許海燕，宗晴，等.常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測GⅠ、G型諾如病毒方法的建立及其應(yīng)用[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2015，31(7): 602-606.

[4] Katayama K,Shirato-Horikoshi H,Kojima S,et al. Phylogenetic analysis of the complete genome of 18 norwalk-like viruses[J]. Virology,2002，299(2): 225-239.

[5] Tan M，Jiang X. Norovirus gastroenteritis，carbohydrate receptors，and animal models[J]. PLoS Pathog，2010，6(8): e1000983. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000983

[6] Kroneman A，Vega E，Vennema H，et al. Proposal for a unified norovirus nomenclature and genotyping[J]. Arch Virol，2013，158(10): 2059-2068. DOI: 10.1007/s00705-013-1708-5

[7] Bull RA，Tanaka MM，White PA. Norovirus recombination[J]. J Gen Virol，2007，88(12): 3347-3359.

[8] Bruggink LD，Oluwatoyin O，Sameer R,et al. Molecular and epidemiological features of gastroenteritis outbreaks involving genogroup I norovirus in Victoria，Australia，2002-2010[J]. J Med Virol，2012，84(9): 1437-1448. DOI: 10.1002/jmv.23342

[9] Gong LM，Ge Q，Chen Y，et al. Molecular characteristics of norovirus in 3 outbreak-episodes of gastroenteritis in Zhejiang from2008 to 2009[J]. Chin J Epidemiol,2011，2(5): 490-493. (in Chinese)

龔黎明，葛瓊，陳寅，等. 浙江省2008-2009年三起諾如病毒胃腸炎暴發(fā)的病原分子特征分析[J]. 中華流行病學(xué)雜志， 2011，32(5):490-493.

Complete genome sequence of a genogroup I geno type 8 norovirus identified in Huzhou，China

JI Lei，WU Xiao-fang，CHEN Li-ping，HAN Jian-kang

(HuzhouCenterforDiseaseControlandPrevention，Huzhou313000，China)

We identified and characterized the full-length genome of a GI.8 norovirus strain CHN/Huzhou/N10 isolated in an outbreak in Huzhou，China. The full-length genome of CHN/Huzhou/N10 was amplified using five pairs of primers which were designed according to the full-length GI norovirus genome sequences published in GenBank database. Multiple alignments were performed using DNAStar，the phylogenetic relationship of CHN/Huzhou/N10 and the representative NoV (Norovirus) strains from each genogroup were assessed using the software MEGA version 6.0. The viral genome of CHN/Huzhou/N10 was 7 740 nucleotides in length，which was consist of three ORFs spanning 5-5 404 nt (ORF1)，5 388-7 019 nt(ORF2)，and 7 019-7 660 nt (ORF3)，respectively. Phylogenetic analysis based on polymerase and capsid sequences VP1 and VP2 region indicated that CHN/Huzhou/N10 belonged to GI.8 genotype. The amino acid sequence analysis of the VP1 region showed that CHN/Huzhou/N10 had 16 mutations compared with the representative strain Boxer/2001/US，12 of these variations were located in the P2 subregion. Moreover，a single amino acid change (T347S) occurred at histo-blood group antigen (HBGA) binding site II and another single amino acid change (T397E) occurred at HBGA binding site III. In this study，the first full genome of norovirus GI.8 isolated in Huzhou，China was extensively characterized. The data would be helpful not only for the epidemiology study，but also for the diagnostic tool development and effective vaccine design in the future.

norovirus; GI.8; complete genome

湖州疾病預(yù)防控制中心，湖州 313000 Email: jileichn@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.008

R373.2

A

1002-2694(2017)07-0613-04

2016-11-16 編輯：張智芳