鴨大腸桿菌血清型分析和疫苗菌株的篩選

袁小遠(yuǎn),王曉麗，亓麗紅,邵桂賓,邵桂平,楊金興,艾 武,王永明

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鴨大腸桿菌血清型分析和疫苗菌株的篩選

袁小遠(yuǎn)1,王曉麗2，亓麗紅1,邵桂賓3,邵桂平3,楊金興1,艾 武1,王永明2

目的 分析鴨大腸桿菌的血清型分布，并進(jìn)行疫苗菌株的篩選。方法 近年來從山東、河北等地區(qū)的商品鴨場送檢的病料中分離大腸桿菌，并進(jìn)行血清型鑒定和生物特性分析；通過毒力檢測和免疫原性試驗(yàn)篩選疫苗菌株。結(jié)果 共分離到44株鴨大腸桿菌。根據(jù)菌體抗原O進(jìn)行分型，共鑒定血清型有6種：O78、O93、O76、O2、O92和O32；其中O78為優(yōu)勢血清型，占56.8%(25/44)；O93血清型次之，占15.9%(7/44)。免疫原性試驗(yàn)證實(shí)O78血清型菌株SD具有較強(qiáng)的毒力和良好的免疫原性。結(jié)論 分析地區(qū)的鴨場鴨大腸桿菌以 O78、O93、O76為優(yōu)勢血清型；免疫原性較好的SD菌株可作為下一步研制滅活疫苗的候選菌株。

鴨大腸桿菌；血清型；生物學(xué)特性；疫苗菌株

大腸桿菌病是由某些血清型大腸桿菌(E.coli)引起的原發(fā)性或繼發(fā)性的細(xì)菌病，菌株在人體和動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，部分致病性的大腸桿菌危害較大[1-2]。該病在衛(wèi)生條件差、飼養(yǎng)管理不良的養(yǎng)殖場可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是危害養(yǎng)禽業(yè)最重要的細(xì)菌性傳染病之一。目前我國已分離到的禽致病性大腸桿菌血清型有很多種，各地分離的血清型也不盡相同。目前分離的常見致病性血清型是O78、O2、O76、O93和O92等。國外亦有其它一些血清型的報(bào)道，但不同發(fā)病地區(qū)的優(yōu)勢致病性血清型亦往往不同，從而給本病的防治增加了困難[3-4]。本文就近年來國內(nèi)鴨攜帶的大腸桿菌進(jìn)行調(diào)查并進(jìn)行血清型的分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基及含0.1%微量鹽溶液的馬丁肉湯培養(yǎng)基，購自濟(jì)南寶太試劑公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7日齡和21日齡健康易感鴨，購自山東濱州某鴨場。

1.1.3 試劑 葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甘露醇等細(xì)菌微量生化發(fā)酵管，購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20120412。

1.1.4 大腸桿菌O抗原因子血清 由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)：20140706。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)查背景 取自2015-2016年間從山東、河北、廣東等5地市13個(gè)養(yǎng)鴨場的送檢病料。對(duì)有明顯臨診癥狀、病理剖檢初步診斷為鴨大腸桿菌病的病鴨或?yàn)l死鴨的心臟、肝、脾、淋巴、輸卵管等組織，共計(jì)67份樣品。

1.2.2 鑒定培養(yǎng) 病料劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)20～24 h。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢初步鑒定后，挑取磚紅色、表面光滑的單個(gè)菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，置4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 取麥康凱瓊脂平板上磚紅色、表面光滑的單個(gè)菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)和染色特征。

1.2.4 分離菌生化特性試驗(yàn) 取微量生化發(fā)酵管及各種生化培養(yǎng)基，將純化培養(yǎng)的各菌株接入后封口，37 ℃培養(yǎng)24～72 h，觀察結(jié)果。

1.2.5 分離株的毒力試驗(yàn) 將各分離菌株接種普通肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。將各菌株菌液分別稀釋為5.0×109CFU/mL～5.0×105CFU/mL等5個(gè)不同劑量組，每個(gè)劑量組接種21日齡健康易感鴨10只，頸部皮下0.2mL/只，觀察10 d，記錄攻毒試驗(yàn)鴨發(fā)病及死亡情況。

1.2.6 分離株的免疫原性試驗(yàn) 鴨大腸桿菌分離株制備滅活疫苗進(jìn)行免疫原性鑒定。取7日齡健康易感鴨10只，頸部皮下注射滅活疫苗0.3 mL/只，14 d后攻毒組和對(duì)照組均頸部皮下注射一個(gè)最小感染劑量(1MID)的對(duì)應(yīng)制苗用強(qiáng)毒菌液0.2 mL/只，觀察10 d，記錄對(duì)照組及免疫組試驗(yàn)鴨免疫保護(hù)及發(fā)病情況。

2 結(jié) 果

2.1 臨床癥狀及病理變化 通過對(duì)所有病例的觀察，臨床癥狀及病理變化總結(jié)如下：多引起局部或全身性感染，表現(xiàn)為敗血癥、心包炎、氣囊炎、腹膜炎等。心包炎：此類病例較多，一般發(fā)生敗血癥時(shí)會(huì)引起心包炎，心包囊渾濁，心外膜水腫，并覆蓋有淡黃色纖維蛋白滲出物。氣囊炎：咳嗽、甩鼻、有呼嚕聲、腫頭、腫眼、個(gè)別出現(xiàn)張口伸頸呼吸。腹膜炎：主要為產(chǎn)蛋鴨感染，其特征是急性死亡、在腹腔有纖維素滲出和破碎卵黃。

2.2 細(xì)菌分離 從67份病死鴨病料中共分離出44株鴨大腸桿菌。病料接種培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)20～24 h后，普通肉湯呈均勻混濁，管底有淡白色粘稠沉淀。營養(yǎng)瓊脂平板為中等大小、圓形微凸起、表面光滑濕潤、淺灰色半透明菌落。在麥康凱瓊脂平板上形成的菌落，肉眼觀察為粉紅色或磚紅色，菌落隆起、表面光滑。

2.3 形態(tài)學(xué)和生化試驗(yàn) 鏡檢均可見兩端鈍圓、多數(shù)散在排列，偶爾有2～3個(gè)連在一起的革蘭氏陰性桿菌。從不同地區(qū)分離的細(xì)菌能發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、乳糖，不產(chǎn)生硫化氫，甲基紅試驗(yàn)陽性，吲哚試驗(yàn)陽性，V.P試驗(yàn)陰性，不液化明膠，尿素酶試驗(yàn)陰性，氧化酶陰性。

2.4 血清型 44株分離株的血清型共有6種，其中O78為優(yōu)勢血清型。O78分離株為25株，占分離株比例的56.8%(25/44)，7株O93(15.9%)。另外還分離出5株O76、5株O2及1株O92、1株O32血清型。

2.5 毒力檢測 SD菌株1.0×107CFU的劑量能夠使試驗(yàn)鴨100%發(fā)病，并引起部分死亡，表現(xiàn)明顯的鴨大腸桿菌病癥狀。剖檢可見明顯的大腸桿菌病病理變化(表1)。毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，鴨大腸桿菌SD株能使21日齡健康易感鴨100%發(fā)病的最小感染量(MID)為1.0×107CFU，表明鴨大腸桿菌SD株具有較強(qiáng)毒力。

2.6 疫苗菌株的免疫原性檢測 將SD株按照常規(guī)技術(shù)制備滅活苗，免疫7日齡健康易感鴨，免疫后14 d，頸部皮下注射SD株菌液，攻毒量為1.0×107CFU，觀察10 d。結(jié)果：免疫鴨10/10健活，對(duì)照鴨全部發(fā)病，并有部分死亡，對(duì)照鴨剖殺后可見明顯的鴨大腸桿菌病病理變化，同時(shí)可分離到血清O78型鴨大腸桿菌。所有免疫鴨全部剖殺，無肉眼可見的病理變化，未分離到鴨大腸桿菌。以上結(jié)果表明鴨大腸桿菌SD株具有良好的免疫原性。

表1 鴨大腸桿菌SD株菌種毒力試驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Virulence test results of duckE.coliSD strain

攻毒菌液菌數(shù)Numberofattackingbacteria發(fā)病鴨(只)Sickduck死亡鴨(只)Deadduck1．0×109CFU1081．0×108CFU1061．0×107CFU1051．0×106CFU621．0×105CFU30

3 討 論

本研究通過分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化反應(yīng)試驗(yàn)、血清型鑒定等，共分離出44株不同血清型的鴨大腸桿菌菌株。臨床上不僅有雛鴨，而且育成鴨、肉種鴨、產(chǎn)蛋鴨也時(shí)有發(fā)病。由于鴨大腸桿菌病的廣泛流行，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)構(gòu)成比較嚴(yán)重的危害。另外，部分鴨大腸桿菌和人的O157血清型大腸桿菌親緣關(guān)系較近，尤其是和人出血性E.coliO157:H7 血清型聚為一個(gè)小分支，所以從遺傳進(jìn)化的關(guān)系分析這些菌株有可能是人類的潛在病原[5]。

本研究分離鑒定的44株致病菌的生化反應(yīng)符合鴨大腸桿菌屬的特性。血清型鑒定結(jié)果表明，分離的鴨大腸桿菌菌株的血清型包括O78、O93、O76、O2、O92和O32，其中O78、O93為主。這一研究結(jié)論也和國內(nèi)的一些研究報(bào)告相符[6-7]。國內(nèi)外不同地區(qū)的優(yōu)勢血清型都有不同，耐藥性差異也顯著[8-10]。因此，鴨大腸桿菌的防制也需在流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上適時(shí)調(diào)整。

現(xiàn)在大腸桿菌疫苗仍以多價(jià)或多聯(lián)的滅活疫苗或亞單位疫苗為主[11-12]。為免疫防制需要，從分離的優(yōu)勢血清型為O78的菌株挑選出毒力相對(duì)較強(qiáng)、免疫原性較好的SD菌株用于下一步的滅活疫苗的制備研究，這將為鴨大腸桿菌的防控提供重要的免疫基礎(chǔ)。

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Serotypes of duckEscherichiacoliand strain selection for vaccine

YUAN Xiao-yuan1，WANG Xiao-li2，QI Li-hong1，SHAO Gui-bin3， SHAO Gui-ping3，YANG Jin-xing1，AI Wu1，WANG Yong-ming2

(1.InstituteofPoultryResearch，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Ji’nan250023，China;2.ShandongHuahongBiologicalEngineeringCo.，Ltd.，Binzhou256600，China;3.ShandongLvxianZhongxinAgricultureandAnimalHusbandryCo.，Ltd.，Rizhao276500，China)

In order to obtain the serotype distribution ofE.colifrom duck and to screen the vaccine bacterial strains，the serotype identifications and biological characteristics ofE.coliwere analyzed in recent years from Shandong，Hebei and other areas of commercial duck field; selections of vaccine strains were detected by the virulence and immunogenicity. Totally 44 isolated bacterial strains ofE.colifrom duck were identified to a total of six serotypes: O78，O93，O76，O2，O92 and O32. The O78 serotype was the dominant serotype，accounting for 56.8% (25/44); O93 serotype for 15.9% (7/44) according to bacterial O-antigen typing. The strain SD (O78 serotype) was confirmed to have strong virulence and good immunogenicity. The O78，O93 and O76 are the dominant serotypes of duckE.coliin the study areas. The SD strain could be used as the candidate for the next development of inactivated vaccine.

duckEscherichiacoli; serotype; biological characteristic; vaccine strain

s: Ai Wu，Email: 767068849@qq.com.cn；Wang Yong-ming，Email: wym197972@163.com

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.ZR2015CM009)、科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)(No.2012FY111000)、山東省2015年度農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目和山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院青年基金項(xiàng)目(No.2014QNM15、No.2015YQN61、No.2016YQN56)聯(lián)合資助

艾 武，Email：767068849@qq.com.cn； 王永明， Email：wym197972@163.com

1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，濟(jì)南 250023； 2.山東華宏生物工程有限公司，濱州 256600； 3.山東莒縣眾鑫農(nóng)牧有限公司，日照 276500

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.006

R378.2

A

1002-2694(2017)07-0604-03

2016-07-20 編輯：張智芳

Supported by the Shandong Provincial Natural Science Foundation (No.ZR2015CM009)，the National Science and Technology Special Fund of China (No.2012FY111000)，the Shandong Innovation Project of Agricultural Major Application Technology(2015)，and the Youth Scientific Research Foundation of Shandong Academy of Agricultural Sciences (Nos.2014QNM15，2015YQN61，2016YQN56)