一株人血源豬鏈球菌的分離鑒定與毒力基因檢測

呂燕寧，李 潔，杜軼威，黎新宇， 王全意，陳麗娟

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一株人血源豬鏈球菌的分離鑒定與毒力基因檢測

呂燕寧1，2，李 潔1，杜軼威1，黎新宇1， 王全意1，陳麗娟1

目的 對北京某醫(yī)院就診的一例疑似人感染豬鏈球菌病患者的血液來源菌株進行鑒定與毒力因子檢測分析。方法 將患者血液分離菌株接種哥倫比亞血瓊脂平板，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、血清凝集試驗、VITEK 2 Compact微生物分析儀以及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測后，再用PCR技術(shù)檢測豬鏈球菌種特異性基因(16S rRNA)和豬鏈球菌2型特異性莢膜多糖編碼基因(cps2J)以及多個毒力基因：溶菌酶釋放相關(guān)蛋白(mrp)、溶血素(sly)、細胞外蛋白因子(ef)、谷氨酸脫氫酶(gdh)、纖粘連蛋白結(jié)合蛋白(fbps)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)的編碼基因和毒力相關(guān)基因orf2。結(jié)果 傳統(tǒng)細菌鑒定方法和蛋白質(zhì)譜技術(shù)以及核酸檢測方法將這株患者血源性細菌分離株鑒定為豬鏈球菌2型，該菌株的毒力基因cps2J、sly、ef、gdh、fbps、gapdh和orf2的PCR檢測均為陽性，mrp基因為陰性。結(jié)論 該株人血源細菌分離株為豬鏈球菌2型sly+/ef+/mrp強毒株。

豬鏈球菌；VITEK；MALDI-TOF-MS；毒力基因；聚合酶鏈反應(yīng)

豬鏈球菌(S.suis)是一種人獸共患病病原體，根據(jù)其莢膜抗原的差異，豬鏈球菌可分為35個血清型，即1～34型和1/2型。其中豬鏈球菌2型流行最為廣泛，不僅能引起大規(guī)模的動物疫病而導致生豬養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟損失，還可引起人偶發(fā)病例甚至造成人間疫情的暴發(fā)，嚴重者致人死亡，對公眾健康尤其是高危人群的生命安全構(gòu)成嚴重威脅，是一種危害嚴重的人獸共患病病原。近年來國內(nèi)已發(fā)生多起人感染豬鏈球菌病疫情，九十年代末我國江蘇省部分地區(qū)，連續(xù)兩年出現(xiàn)由豬鏈球菌2型引起的豬群疫病暴發(fā)，數(shù)萬頭生豬死亡，數(shù)十人感染豬鏈球菌病，死亡14例[1]；2005年四川省發(fā)生了國內(nèi)外迄今為止報告的最大規(guī)模人感染豬鏈球菌病疫情，200多人感染，38人死亡[2]，也由豬鏈球菌2型引起的；人感染豬鏈球菌病散發(fā)病例在其它省份也時有發(fā)生[3-5]。因此對該致病菌的快速鑒定與甄別以及毒力分析可以為患者的快速診斷和有效治療以及突發(fā)疫情的迅速處置提供依據(jù)。本研究對2015年在北京市某醫(yī)院就診的1例人感染豬鏈球菌疑似病例血液中分離的菌株進行了分離鑒定與毒力分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 病例信息 患者張某，男，52歲，來自河北省廊坊市，于2015年12月11日發(fā)病，就診于當?shù)蒯t(yī)院，病情加重后于13日轉(zhuǎn)至北京某醫(yī)院急診科，主要癥狀為意識障礙，譫妄，躁動不安，伴有發(fā)熱、惡心、嘔吐，二便失禁。患者在工作單位負責豬、牛、羊、驢、雞、鴨的飼養(yǎng)工作，其住所臨近豬舍，2014-2015年其工作場所均有病死豬情況發(fā)生，發(fā)病前1周，患者接觸過1只病死豬，對病死豬去毛時，手部有傷口。臨床診斷為人感染豬鏈球菌病、化膿性腦膜炎、急性腦梗死。

1.2 樣本 該病例的血培養(yǎng)物(BD公司BACTEC Plus Aerobic/F血培養(yǎng)瓶，全自動需氧培養(yǎng)24 h)。

1.3 試劑 哥倫比亞血瓊脂平板(貨號為PB0123A)購自英國OXOID公司，豬鏈球菌1型和2型抗血清(貨號分別為22280 Type 1和22280 Type 2)購自丹麥SSI公司，豬鏈球菌2型單克隆抗體由中國疾病預(yù)防控制中心提供，VITEK2革蘭氏陽性細菌鑒定卡(貨號21342)購自法國生物梅里埃公司，PCR試劑為Invitrogen Platinum○RPCR SuperMix(貨號11306-016)購自美國賽默飛公司。

1.4 儀器 法國生物梅里埃VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，德國布魯克公司的MALDI Biotyper微生物快速鑒定系統(tǒng)，美國伯樂公司的iCycler PCR儀以及德國Qiagen公司的毛細管核酸電泳儀QIAXCEL。

1.5 細菌分離培養(yǎng)與染色鏡檢 將血培養(yǎng)物取200 μL接種于血瓊脂平板劃線培養(yǎng)，置37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落特征，挑取單個可疑菌落進行革蘭染色后鏡檢。

1.6 血清分型試驗 挑取菌落分別與豬鏈球菌1型和2型抗血清做玻片凝集試驗，同時設(shè)生理鹽水對照。

1.7 篩檢生化試驗 觸酶實驗，取潔凈玻片1張，接種環(huán)挑取菌落，加3% H2O21滴，立即觀察結(jié)果。

1.8 VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀檢測 挑取單個菌落轉(zhuǎn)種血瓊脂平板，于37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用消毒棉簽沾取適量菌苔，以0.45%的氯化鈉溶液配制濃度為0.5～0.65 Mac單位的菌懸液3 mL；將預(yù)溫25 ℃的VITEK 2革蘭氏陽性細菌鑒定卡用已配制好濃度的菌懸液進行自動填充后，置于讀卡器中進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后儀器自動讀卡并打印出最終結(jié)果。

1.9 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測 以5 mL乙腈 + 0.25 mL三氟乙酸(TFA)+ 4.75 mL純水配制10 mL標準溶劑。以標準溶劑配制飽和HCCA基質(zhì)溶液(終濃度為10 mg/mL)備用。以接種環(huán)取單一菌落，加入1 mL 70%乙醇振蕩滅活，離心去上清，再向沉淀中加入70%甲酸50 μL以及乙腈50 μL，振蕩離心取上清待測。取1 μL上清滴于樣品盤上晾干，再加上1 μL基質(zhì)溶液，晾干后上機檢測。

1.10 豬鏈球菌靶基因檢測 菌株DNA制備:刮取1-2接種環(huán)菌苔加入150 μL三蒸水中，振蕩混勻制成菌懸液，100 ℃煮沸10 min；14 500 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩⒄障嚓P(guān)文獻的引物序列及PCR方法檢測豬鏈球菌種特異的16S rRNA基因和豬鏈球菌2型cps2J基因以及其他毒力基因：莢膜多糖(cps)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、溶血素(sly)、細胞外因子(ef)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gadph)、谷氨酸脫氫酶(gdh)、粘連蛋白/纖粘連蛋白結(jié)合蛋白(fbps)和毒力相關(guān)因子orf2。引物序列、退火溫度及產(chǎn)物片段大小詳見表1。反應(yīng)體系(20 μL)為上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 1 μL、預(yù)混液17 μL混合而成。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃、4 min，變性95 ℃、30 s，退火30 s，退火溫度參見表1，延伸72 ℃、1 min，35個循環(huán)，最后延伸72 ℃、7 min。

表1 豬鏈球菌基因檢測引物及其產(chǎn)物大小

Tab.1 Primers ofStreptococcussuisgene detection and product sizes

目的基因Targetgene引物序列(5′?3′)Primerssequence產(chǎn)物大小/bpSizeofproducts退火溫度/℃Annealingtemperature參考文獻References16SrRNACAGTATTTACCGCATGGTAGATAT32860[6]GTAAGATACCGTCAAGTGAGAAcps2JGTTGAGTCCTTATACACCTGTT45060[7]CAGAAAATTCATATTGTCCACCmrpGGTATACCTTGCTGGTACCGTTC53260[7]AGTCTCTACAGCTGTAGCTGGslyAGTTCGCACTTGATTTTAAG150051[7]AATACATTGCCAGATTACTCefACAAAGGCGTAGGTTCAATC26956[7]CGGCATCAAGAATGTCTTTGgdhGCAGCGTATTCTGTCAAACG65756[8]CCATGGACAGATAAAGATGGorf2CAAGTGTATGTGGATGGG85856[8]ATCCAGTTGACACGTGCAfbpsTGTCCTCAACATCCGCA18460[9]CATTGTCCAACTGACGAATCTCCTCgapdhTGACAAGAAAGTAACTGCTGA12348[9]CAATGAACCGAATGAGA

2 結(jié) 果

2.1 菌落特征與鏡檢結(jié)果 可疑菌株在血瓊脂平板上培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)細小突起、光滑濕潤的圓形菌落，半透明略帶灰白色、邊緣整齊，聚集性菌苔周圍呈明顯的α溶血現(xiàn)象，單個菌落周圍α溶血現(xiàn)象不明顯，革蘭染色后油鏡下觀察，細菌呈成對或短鏈狀革蘭氏陽性球菌。結(jié)果見圖1。

圖1 細菌的生長形態(tài)與革蘭氏染色Fig.1 Growth form and Gram stain of the bacteria

圖2 PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR results

2.2 血清分型結(jié)果 分離菌株與豬鏈球菌2型抗血清以及豬鏈球菌2型單克隆抗體發(fā)生凝集反應(yīng)，與豬鏈球菌1型抗血清不發(fā)生凝集反應(yīng)。生理鹽水對照未發(fā)生凝集現(xiàn)象。

2.3 篩檢生化試驗 無氣泡產(chǎn)生，觸酶試驗陰性。

2.4 VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀檢測結(jié)果 鑒定結(jié)果顯示，分離菌株為豬鏈球菌2型。

2.5 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測結(jié)果 MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果顯示該菌株與豬鏈球菌1型DSM 9683、DSM 9684和豬鏈球菌2型DSM 9682T(German Culture Collection，Braunschweig，Germany)最為相似，分值(Score Value)分別為2.341、2.268和1.870。

2.6 PCR檢測結(jié)果 PCR檢測結(jié)果顯示豬鏈球菌種特異的16S rRNA基因、豬鏈球菌2型特有的毒力基因cps2J及毒力基因sly、ef、gdh、fbps、gapdh和orf2均出現(xiàn)預(yù)期大小的DNA擴增條帶，為陽性；mrp則未見擴增條帶，為陰性。結(jié)果見圖2。

3 討 論

豬鏈球菌是一種呈世界性分布的人獸共患病原菌，雖然有35個血清型，并非所有的血清型都有致病性，能感染人的致病血清型主要包括1、2、1/2、7、9和14型6種。毒力最強的是1型，而2型分布最廣泛，是從病豬和患者中分離最多的一種血清型[10]，也是我國豬鏈球菌病疫情的主要流行株，但并不是所有的豬鏈球菌2型都具有致病性，其致病力取決于它的毒力因子，根據(jù)菌株毒力因子的差異，可將其分為強毒株、弱毒株和無毒株，因此對分離菌株的鑒定、分型以及毒力因子的檢測分析對病人的診斷治療和疫情處置很重要。

傳統(tǒng)的細菌鑒定有一系列的流程和方法，耗時長，程序繁瑣，通常還需要實驗者具有一定的經(jīng)驗。MALDI-TOF-MS是近年來發(fā)展起來的一種新型的有機質(zhì)譜技術(shù)，是一種利用蛋白質(zhì)譜學的全新的微生物快速檢測和鑒定技術(shù)，對于已經(jīng)分離純化的菌株能夠在短至幾分鐘的時間內(nèi)進行初步鑒定。目前應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)在檢測和鑒定微生物方面國內(nèi)外已經(jīng)取得了很好的進展，尤其是在細菌的種屬鑒定方面，有學者使用MALDI-TOF-MS方法鑒定了129株豬鏈球菌分離株，符合率可達96.9%[11]，可以很好的將菌株鑒定到屬的水平。本研究中采用MALDI-TOF-MS方法對分離株進行鑒定，結(jié)果顯示該方法可將可疑菌株鑒定為豬鏈球菌，但不能進一步精確區(qū)分血清型。因此我們進一步使用了豬鏈球菌1型和2型抗血清以及2型單克隆抗體進行了血清凝集試驗，試驗結(jié)果顯示該菌株只能與2型抗血清發(fā)生凝集反應(yīng)，提示該分離株為2型豬鏈球菌。

VITEK 2 compact系統(tǒng)是微生物快速檢測分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠準確快速地分析出菌株的鑒定結(jié)果。馬麗梅等[12]應(yīng)用此方法對111株豬鏈球菌進行了鑒定，其中110株為豬鏈球菌2型，1株為豬鏈球菌1型，正確率100%。因此作者認為VITEK 2 compact分析系統(tǒng)可作為一種簡便快速的豬鏈球菌鑒定方法。但也指出，該實驗所用的菌懸液配制濃度要非常準確，而且必須以培養(yǎng)18～24 h的新鮮菌落來配制，否則對鑒定結(jié)果的影響會較大。本研究應(yīng)用VITEK 2 compact分析系統(tǒng)對疑似菌株進行了鑒定，并且做了重復(fù)實驗，實驗結(jié)果也顯示該方法的鑒定結(jié)果并非每次都很穩(wěn)定，其中一次鑒定結(jié)果顯示為豬鏈球菌1型，這也是為什么我們要選擇豬鏈球菌1型抗血清進行血清凝集試驗來做進一步的確證，鑒定該菌株到底是1型、2型還是1/2型的原因。

分子生物學技術(shù)因其敏感、快速、準確的優(yōu)點在細菌鑒定和分型方面得到越來越多的應(yīng)用。豬鏈球菌16S rRNA基因片段具有種特異性，cps2J基因不僅是其毒力基因之一，也是豬鏈球菌2型的型特異性基因，可以作為鑒定豬鏈球菌2型的靶基因，本研究中該分離株的16S rRNA和cps2J基因均為陽性，提示本研究中的疑似菌株為豬鏈球菌2型菌株。豬鏈球菌2型的毒力因子與其致病性密切相關(guān)，是判定其毒力強弱的指標。目前認為豬鏈球菌2型的毒力因子主要有cps、mrp、sly、ef、gadph、gdh、fbps、orf2等[13]。ef和mrp的表達與豬鏈球菌2型菌株的毒力有顯著關(guān)系。根據(jù)mrp和ef及其類似物的存在與否，豬鏈球菌2型存在著以下幾種表現(xiàn)型：mrp+ef+、mrp-ef-、mrp+ef*(ef類似物)、mrp+ef-、mrp*(mrp類似物)ef-、mrp-ef*、mrp-ef+等。我國1998年江蘇省及2005年四川省豬鏈球菌病疫情中的病豬體內(nèi)分離到的菌株也為mrp+ef+型[14]。由于mrp和ef在非致病菌株中檢出率很低，而在強毒株中檢出率很高，因此mrp和ef常被認為是豬鏈球菌2型高致病性的標志，但其他毒力基因，如sly等也對豬鏈球菌的致病性起重要作用[15-16]。一般認為sly、mrp及ef3個毒力因子可用來區(qū)分高致病、低致病與非致病菌株，sly/ef/mrp陽性常被認為是與菌株的高致病性相關(guān)的[17]。然而，近年國外研究者從病豬中分離的多個2型豬鏈球菌菌株表現(xiàn)為sly-/ef-/mrp-/+[17-18]。2008-2011年從加拿大分離的127株2型豬鏈球菌中，52%為sly-/ef-/mrp+型，44%為sly-/ef-/mrp-型，并且研究者發(fā)現(xiàn)mrp-較mrp+菌株的毒力似乎更強[19]。陳經(jīng)雕等[7]研究了22株來自人和豬的2型豬鏈球菌，其中有10株(7株人源、3株豬源)為sly+/ef+/mrp+型，另外10株分離自病人的菌株為sly-/ef+/mrp+，2株分離自病豬的菌株分別為sly+/ef+/mrp-和sly-/ef-/mrp-。總而言之，國內(nèi)人源豬鏈球菌2型分離株多為sly+/ef+/mrp+型。本研究以cps2J、mrp、sly、ef、gadph、fbps、gdh和orf2為靶基因?qū)σ伤凭赀M行了PCR鑒定，其結(jié)果除mrp基因外均為陽性，結(jié)合患者危重的臨床表現(xiàn)，表明本例人血源分離菌株為表現(xiàn)型為sly+/ef+/mrp-的豬鏈球菌2型強毒株，與以往的研究結(jié)果略有差異，表明mrp基因并不是豬鏈球菌2型致病力強弱的決定性因素。

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Identification and virulence analysis of aStreptococcussuisstrain isolated from human blood

LYU Yan-ning1,2，LI Jie1，DU Yi-wei1，LI Xin-yu1，WANG Quan-yi1，CHEN Li-juan1

(1.BeijingCenterforDiseasesControlandPrevention，BeijingResearchCenterofPreventiveMedicine，Beijing100013，China;2.SchoolofPublicHealth，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

To identify and analyze the virulence of a bacteria strain isolated from the blood of a patient with suspectedStreptococcussuis(S.suis) infection in a hospital of Beijing，we inoculated the bacteria strain isolated from the blood of the patient to the Columbia with sheep blood agar plate，after Gram staining and microscopical examination，serum agglutination test，VITEK 2 Compact microbial identification system test and matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) test，S.suisspecies specific gene 16SrRNA，S.suisspecies serotype 2 specific virulence gene capsule polysaccharide 2J (cps2J) and virulence gene muramidase-released protein (mrp)，hemolysin (sly)，extracellular factor protein (ef)，glutamate dehydrogenase (gdh) genes，fibronectin-binding protein (fbps)，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapdh) genes and virulence correlated gene orf2 were further detected by PCR. Results showed that the suspicious bacteria strain ofS.suiswas identified asS.suistype 2 (S.suis2) by conventional methods，MALDI-TOF-MS and PCR. PCR results showed thatcps2J，sly，ef，gdh，fbps，gapdhandorf2 genes were positive，and mrp gene was negative. In conclusion，the bacteria strain isolated from the patient’s blood is sly+/ef+/mrp-virulentS.suis2.

S.suis; VITEK; MALDI-TOF-MS; virulence gene; PCR

Chen Li-juan，Email: bjcdcchlj@hotmail.com

國家科技重大專項(No.2012ZX10004215-003-001)資助

陳麗娟，Email：bjcdcchlj@hotmail.com

1.北京市疾病預(yù)防控制中心,北京市預(yù)防醫(yī)學研究中心，北京 100013； 2.首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,北京 100069

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.005

R378.1

A

1002-2694(2017)07-0599-05

2016-07-11 編輯：張智芳

Supported by the National Key Science and Technology Project of China (No. 2012ZX10004215-003-001)