小型豬在生殖毒性實(shí)驗(yàn)中的研究進(jìn)展

張?jiān)?+++++高虹

[摘要] 小型豬與人類在解剖學(xué)、生理和病理學(xué)等方面有很多相似性，具有發(fā)情周期短、仔豬數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為人類醫(yī)學(xué)研究的理想動(dòng)物模型，但由于背景數(shù)據(jù)缺乏、動(dòng)物體型較大等原因，目前其在生殖毒性實(shí)驗(yàn)中并未得到廣泛應(yīng)用。本文根據(jù)小型豬自身的特點(diǎn)，對(duì)其目前在生殖毒性實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，旨在擴(kuò)大非嚙齒動(dòng)物在生殖毒性實(shí)驗(yàn)中的選擇范圍，并在必要時(shí)替代犬或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，為藥物非臨床生殖毒性試驗(yàn)提供新的研究思路。

[關(guān)鍵詞] 小型豬；生殖毒性實(shí)驗(yàn)；研究現(xiàn)狀；應(yīng)用展望

[中圖分類號(hào)] R114 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（c）-0049-04

[Abstract] As to anatomy and pathophysiology， there are lots of similarities between human and minipig. Because of its short estrus cycle and large number of piglets in a litter， minipig has become an ideal animal model for medical research in human. However， minipig has been restrictedly used in reproductive toxicity studies because of its large body size and limited background data. In this review summarizes the characteristics of minipig as well asits current applications in reproductive toxicity studies， intend to expand the range of selecting non-rodents and provide new ideas for nonclinical reproductive toxicity studies.

[Key words] Minipig； Reproductive toxicity study； Research status； Application prospect

生殖毒性是指有害因素對(duì)親代生殖功能造成的有害作用[1]，其研究是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。在20世紀(jì)60年代發(fā)生的“反應(yīng)?！笔录斐山f(wàn)名新生兒畸形，這一藥物史上的悲劇促使各國(guó)加強(qiáng)了對(duì)生殖毒性評(píng)價(jià)的重視。生殖毒性研究對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的選擇也越來(lái)越嚴(yán)格，通常選用對(duì)受試物的代謝、毒效學(xué)及其他參數(shù)與人類相近的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[2]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)小型豬研究的逐漸深入，其已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究[3]。已有證據(jù)顯示，小型豬對(duì)很多化學(xué)物質(zhì)敏感，對(duì)某些特殊藥物的反應(yīng)性比傳統(tǒng)的非嚙齒類動(dòng)物可能更具有優(yōu)勢(shì)[4]。本文針對(duì)小型豬的自身特點(diǎn)，對(duì)小型豬在生殖毒性實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，以期為此類研究提供一些參考價(jià)值。

1 小型豬動(dòng)物模型在生殖毒性實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的可行性

選擇合適的動(dòng)物模型對(duì)于藥物生殖發(fā)育毒性研究有著重要的實(shí)際意義。一般選擇何種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取決于受試物的特點(diǎn)、動(dòng)物對(duì)受試物的反應(yīng)，以及受試物在動(dòng)物體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄?fàn)顩r與人類的差異程度[5]。生殖毒性實(shí)驗(yàn)通常在兩種動(dòng)物，即嚙齒類動(dòng)物和非嚙齒類動(dòng)物中進(jìn)行。常規(guī)選用的是大鼠和家兔，在一些特殊情況下也使用犬或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物。但當(dāng)大鼠或家兔等傳統(tǒng)動(dòng)物不適合進(jìn)行致畸性實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，也可采用小型豬作為替代動(dòng)物。例如，大鼠通過(guò)催乳素維持早期妊娠，不適合于評(píng)價(jià)多巴胺類興奮劑或降低催乳素水平藥物的生殖毒性實(shí)驗(yàn)。家兔對(duì)消化道功能紊亂和抗生素敏感，臨床表現(xiàn)難以解釋。非人靈長(zhǎng)類存在動(dòng)物保護(hù)和動(dòng)物供應(yīng)方面的問(wèn)題，且大多數(shù)動(dòng)物只生產(chǎn)一個(gè)子代而使應(yīng)用受到限制。在生殖毒性試驗(yàn)中各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用的優(yōu)缺點(diǎn)，見表1。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)小型豬對(duì)許多人類致畸物質(zhì)具有敏感性[4]，如沙利度胺、羥基脲、乙醇、維甲酸、氨基蝶呤等。但幾乎無(wú)檢測(cè)方法，背景數(shù)據(jù)很少。并且小型豬的胎盤缺乏轉(zhuǎn)移大分子物質(zhì)（分子量超過(guò)5000）的能力，從而限制了小型豬在一些生物技術(shù)產(chǎn)品（例如抗體、疫苗）中的應(yīng)用[11]。關(guān)于不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)受試物的適用性見表2。

2 小型豬動(dòng)物模型在生殖毒性實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

根據(jù)科技文獻(xiàn)報(bào)道，目前在藥物毒理學(xué)試驗(yàn)中已有幾十種不同品系的小型豬得到應(yīng)用，但有關(guān)小型豬生殖毒性實(shí)驗(yàn)的研究資料還很有限。曾有文獻(xiàn)報(bào)道哥延根小型豬的生殖特性[13]，以及相關(guān)的致畸性實(shí)驗(yàn)方案[14]和歷史對(duì)照組數(shù)據(jù)資料，其外觀畸形和內(nèi)臟畸形的背景發(fā)生率為4%，最常見的畸形包括隱睪癥（2.8%）、并指（趾）癥（0.76%）、肌肉關(guān)節(jié)攣縮（0.32%）、腭裂（0.28%）、心室間隔缺損（0.24%）和橫膈疝（0.24%）。

哥廷根小型豬對(duì)維甲酸的致畸作用非常敏感[15]，具有明顯的劑量-反應(yīng)（畸形發(fā)生率和嚴(yán)重性）關(guān)系，且畸形表現(xiàn)與人類的視黃酸胚病（小頜、腭裂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形、小耳和心臟與胸腺的缺陷）極為相似。Hayama等[16]發(fā)現(xiàn)在哥廷根小型豬的器官形成期給予乙嘧啶可引起上腭裂和其他出生缺陷，也可導(dǎo)致功能性缺陷，如后肢癱瘓。Zomborszky-Kovács等[17]研究了煙曲霉素B（1）對(duì)豬胚胎的有害作用。另外，已有資料顯示，小型豬對(duì)抗心律不齊藥物經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)移情況也與人類的經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)移過(guò)程相似[18]。適用于晚期非小細(xì)胞肺癌的一線治療及HER2陽(yáng)性的晚期乳腺癌患者的新藥阿法替尼[19]（口服）在2013年7月12日獲美國(guó)食品及藥物管理局（FDA）核準(zhǔn)上市，在其臨床前安全性評(píng)價(jià)中，由于犬嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)，研究者選用了哥廷根小型豬進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，提示在新藥臨床前研究中小型豬具有良好的應(yīng)用前景。

3 小型豬生殖毒性實(shí)驗(yàn)研究

進(jìn)行生殖毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)，為發(fā)現(xiàn)給藥所致的速發(fā)和遲發(fā)效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)觀察應(yīng)持續(xù)一個(gè)完整的生命周期[20]，即從某一代受孕到其下一代受孕間的時(shí)間周期。根據(jù)ICH藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則，一般將一個(gè)完整生命周期過(guò)程分成以下幾個(gè)階段[21]：A：從交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的發(fā)育和成熟、交配行為、受精）。B：從受孕到著床（成年雌性生殖功能、著床前發(fā)育、著床）。C：從著床到硬腭閉合（成年雌性生殖功能、胚胎發(fā)育、主要器官形成）。D：從硬腭閉合到妊娠終止（成年雌性生殖功能、胎仔發(fā)育和生長(zhǎng)、器官發(fā)育和生長(zhǎng)）。E：從出生到離乳（成年雌性生殖功能、幼仔對(duì)宮外生活的適應(yīng)性、離乳前發(fā)育和生長(zhǎng)）。F：從離乳到性成熟（離乳后發(fā)育和生長(zhǎng)、獨(dú)立生活的適應(yīng)能力、達(dá)到性成熟的情況）。

3.1 生育力與早期胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)

生育力與早期胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)（包括上述生命周期中的A～B階段）用于評(píng)價(jià)受試物對(duì)動(dòng)物生殖的毒性或干擾作用。評(píng)價(jià)內(nèi)容包括配子成熟度、交配行為、生育力、胚胎著床前階段和著床等[22]。實(shí)驗(yàn)通常選用嚙齒類動(dòng)物如大鼠，當(dāng)大鼠不適合時(shí)則會(huì)選擇另一種嚙齒類動(dòng)物或非嚙齒類動(dòng)物替代，選擇主要基于受試物的特性，但是小鼠和非人靈長(zhǎng)類常用作替代物種。小型豬由于發(fā)情周期短，大約3周，也是一個(gè)非常合適的選擇，其精液資料與人類相似，但前列腺的發(fā)育程度低于精囊和尿道球腺（不同于人類），在雄性生殖器官病理學(xué)檢查時(shí)可能會(huì)遇到間質(zhì)細(xì)胞增生、生精小管發(fā)育不全等自發(fā)病變，從而影響研究結(jié)果的解釋和判斷。目前，國(guó)內(nèi)尚未開展應(yīng)用小型豬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行生育力和早期胚胎發(fā)育毒性的研究。

3.2 胚胎-胎仔發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)

在胚胎-胎仔發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)中（包括上述生命周期中的C～D階段），小型豬的給藥期從著床日（妊娠第11天）開始，至硬腭閉合日（妊娠第35天）結(jié)束[23]，包含整個(gè)妊娠期。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃可采用最為合適的給藥途徑，包括皮內(nèi)注射、靜脈輸注、外用給藥等，但經(jīng)口給藥仍最為常見。在妊娠28～35 d，可通過(guò)超聲檢查確定小型豬的妊娠狀態(tài)。研究期間需要對(duì)小型豬各種臨床體征進(jìn)行觀察，并記錄攝食量和體重的變化。在妊娠110～112 d處死小型豬進(jìn)行剖宮檢查。足月產(chǎn)小型豬胎仔體重為350～400 g，故此可對(duì)所有的胎豬進(jìn)行尸檢。胎豬的檢查項(xiàng)目一般包括黃體數(shù)量、活胎數(shù)量、死胎數(shù)量、吸收胎數(shù)量、著床數(shù)量，對(duì)胎豬進(jìn)行稱重和外觀畸形的檢查，并確定胎豬的性別[24]。Bouin液固定后對(duì)半數(shù)胎豬進(jìn)行內(nèi)臟檢查，通過(guò)茜素紅染色法對(duì)半數(shù)胎豬進(jìn)行骨骼檢查。此外，也可采用X射線法或CT掃描對(duì)全部胎豬進(jìn)行骨骼檢查，檢查的質(zhì)量也超過(guò)茜素紅染色法。

另外，為了進(jìn)一步縮短小型豬致畸實(shí)驗(yàn)的期限，有研究者對(duì)哥廷根小型豬中期（妊娠第60天）和終末（妊娠第110天）剖宮產(chǎn)檢查結(jié)果進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)中期剖宮產(chǎn)胎豬大小與終末處死家兔時(shí)胎兔的大小和體重相當(dāng)，生殖器官內(nèi)部檢查可確定胎豬性別，骨骼和軟骨雙染法可檢出骨骼改變，并可檢查出乙胺嘧啶誘發(fā)的胎仔異常[23]。從而表明小型豬中期剖宮產(chǎn)技術(shù)可行，并具有節(jié)省時(shí)間、開支等方面的優(yōu)勢(shì)。

3.3 圍生期毒性實(shí)驗(yàn)

圍生期毒性實(shí)驗(yàn)（包括上述生命周期中的C～F階段）是對(duì)處于妊娠期或哺乳期的雌性動(dòng)物從胚胎著床到幼仔離乳給藥，目的是檢測(cè)藥物對(duì)母體以及胚胎和子代發(fā)育的不良影響，由于產(chǎn)生的不良作用可能延遲，實(shí)驗(yàn)應(yīng)持續(xù)觀察至子代性成熟[25-26]。評(píng)價(jià)內(nèi)容包括妊娠雌性動(dòng)物增強(qiáng)的毒性、產(chǎn)前產(chǎn)后子代的死亡情況、生長(zhǎng)發(fā)育的異常以及子代的功能缺陷，包括F1代的行為、性成熟和生殖功能[27]。雌性動(dòng)物給藥期應(yīng)從胚胎硬腭閉合至哺乳結(jié)束，即上述生命周期中的C～E階段。通常，小型豬為妊娠第35天至離乳（出生后第174天）[15]。與其他非嚙齒類動(dòng)物相比，哥延根小型豬每窩仔豬數(shù)多，仔豬生長(zhǎng)快，性成熟快，已建立許多成熟的行為測(cè)試方式[28]。在開展哥延根小型豬圍生期毒性實(shí)驗(yàn)方面，已積累了一些經(jīng)驗(yàn)。

4 小型豬動(dòng)物模型在生殖毒性實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用前景

小型豬發(fā)情周期和妊娠期短，胎仔數(shù)量多，胚胎大，便于觀察微小畸形[29]，與人類在解剖學(xué)、生理學(xué)、疾病發(fā)生機(jī)制等方面存在一定的相似性，表明其可能作為生殖毒性實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型。其屬于食源性動(dòng)物，從動(dòng)物福利的角度來(lái)看壓力也要小很多。雖然人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到小型豬作為毒理學(xué)研究模型動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)[30]，但目前小型豬并未廣泛應(yīng)用于各類科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，在生殖毒性實(shí)驗(yàn)研究中也遠(yuǎn)不及家兔的位置。一方面是家兔已積累了豐富的背景信息，且容易獲得、操作簡(jiǎn)單。另一方面，小型豬的應(yīng)用還具有一定的局限性。首先是實(shí)驗(yàn)操作不便。雖然相對(duì)于普通豬，小型豬的體型已經(jīng)小了很多，但還是和犬、猴一樣屬于大動(dòng)物，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，人員體能消耗大，并且缺乏實(shí)驗(yàn)室診斷的商業(yè)試劑盒[31]。其次，小型豬的胎盤缺乏轉(zhuǎn)移大分子能力，從而限制了小型豬在一些生物技術(shù)產(chǎn)品（例如抗體、疫苗）中的應(yīng)用。因此，目前在生殖毒性實(shí)驗(yàn)中小型豬還不能完全替代傳統(tǒng)的非嚙齒類動(dòng)物。期待隨著研究的不斷深入，小型豬的背景數(shù)據(jù)會(huì)不斷完善，在預(yù)測(cè)藥物對(duì)人類產(chǎn)生的生殖毒性作用方面將具有越來(lái)越大的應(yīng)用價(jià)值。

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