結(jié)直腸癌中長非編碼RNA MT1DP的下調(diào)與其不良預后密切

潘軍平+王俊+朱新華+吳亞夫+丁義濤

【摘要】目的：探討假性基因（MT1DP）在結(jié)直腸癌（CRC）組織及其癌旁組織中的表達水平，及假性基因（MT1DP）的表達與結(jié)直腸癌（CRC）預后的相關性。方法：我們研究了78例患者的CRC組織及其癌旁組織，通過實時定量PCR檢測MT1DP的mRNA表達水平，并進一步評估其在結(jié)直腸癌中的臨床價值。結(jié)果：在78例CRC組織中有55例的MT1DP表達水平顯著下降（70.5%，P<0.001）。此外，CRC中MT1DP的表達水平與TNM分期（P=0.020）和遠處轉(zhuǎn)移（P=0.005）密切相關。而且，CRC患者中低MT1DP表達者的總體生存率（OS）及無病生存率（DFS）更低（P分別為0.002和0.006）。另外，單因素和多因素Cox回歸分析進一步明確MT1DP低表達可能是CRC患者的OS和DFS的獨立預后因素。結(jié)論：研究結(jié)果表明MT1DP低表達與CRC的發(fā)生發(fā)展密切相關，其有望成為結(jié)直腸癌患者一種新的診斷以及預后評價的生物標志物。

【關鍵詞】結(jié)直腸癌；長非編碼RNAs；MT1DP；預后

【中圖分類號】R735.3 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）06-00-01

1.引言：

大量證據(jù)表明lncRNAs表達異常與疾病的多樣性密切相關，包括人類惡性腫瘤[5，6]。在結(jié)直腸癌中，lncRNAs表達異常與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移密切關聯(lián)，而且其中一些在診斷與預測中頗具價值，例如：CCAT1[7]，HOTAIR[8]，UCA1[9]和MALAT1[10]在結(jié)直腸癌中高表達，而長鏈非編碼RNALET[11]，MEG3[12]，GAS5[13]以及LOC285194[14]在結(jié)直腸癌組織中低表達。

最近發(fā)現(xiàn)肝癌中一種新的lncRNA，即金屬硫蛋白1D假性基因（MT1DP），它可以作為一種腫瘤抑制基因抑制肝癌細胞生長。然而，結(jié)直腸癌中MT1DP表達與其潛在的臨床病理學作用之間的關系尚不明。在本研究中，我們旨在探索MT1DP在CRC組織及癌旁組織中的表達水平。以及其表達水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理學特征及預后價值的關系。

2.材料與方法：

2.1 患者的組織樣本

本研究共收集78例人體CRC組織及鄰近正常組織。所有患者均為近兩年在南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院接受結(jié)直腸癌手術的患者。入組均未接受術前放療或化療。組織樣本在外科手術離體后立即以液氮冷凍并儲存在-80℃用于進一步分析?；颊咴敿毜呐R床特征列于表1。隨訪數(shù)據(jù)通過審查門診患者及通過電話或郵件隨訪患者?？偵嫫趶淖畛醯耐饪剖中g日期算起，直到死亡日期或隨訪的最后日期。該項目方案由南京大學和江蘇省醫(yī)學會倫理委員會通過，所有患者簽署知情同意書。

2.2 RNA分離和定量實時逆轉(zhuǎn)錄PCR（QRT-PCR）

根據(jù)TRlozol試劑說明書（Invitrogen公司）提取組織樣本的所有RNA。RNA的濃度及純度以分光光度法在260nm和280nm處測定，只有A260/A280的OD值接近1.8～2.0的樣本進行隨后的分析。使用PrimeScriptTMFirstStrandcDNA試劑盒（Takara，大連，中國）并根據(jù)其說明書進行反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR使用SYBRPremixExTaqTMII試劑盒（Takara公司），AppliedBiosystems7500PCRSystem（ABI，TX，USA）。MT1DP引物序列為5-ATTTCTGAGGCGAGAGGACT-3（正向）和5-GCAGGAGCAGCAGTTCTTCT-3（逆向）。GAPDH（內(nèi)參）序列為5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3（正向）and5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3（逆向）。PCR擴增方案如下：95℃下5分鐘，在95℃下30秒進行40個循環(huán)變性，在58℃下30秒退火，在72℃下20秒延伸。所有反應一式三份進行，比較循環(huán)閾值（CT）的方法和方程2-ΔΔCT用于量化MT1DP的表達水平。

3.統(tǒng)計分析：

組間差異的顯著性應用Studentst檢驗，檢驗或Wilcoxon檢驗進行評價。建立受試者工作特征（ROC）曲線評價診斷價值。生存曲線構(gòu)建使用Kaplan-Meier方法和通過對數(shù)秩檢驗進行比較。單因素和多因素分析在Cox比例風險回顧模型基礎上進行。所有統(tǒng)計分析使用SPSS18.0軟件（SPSS，Chicago，IL，USA）。雙側(cè)P值小于0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。

4.結(jié)果：

4.1 MT1DP在CRC患者中表達下調(diào)

如圖1A，B所示，與癌旁組織相比，MT1DP在腫瘤組織中表達明顯下降，P<0.001。78例CRC患者中有55例腫瘤組織MT1DP的表達水平低于癌旁組織70.5%），腫瘤組織比癌旁組織中MT1DP的表達水平低1.52倍。

4.2 CRC中MT1DP下調(diào)的診斷價值

我們發(fā)現(xiàn)ROC曲線下面積（AUC）為0.714，95%可信區(qū)間（Cl）為0.636-0.783，靈敏度為88.46%（95%Cl：79.2-94.6），特異性為51.28%（95%Cl：39.7-62.8），Youden指數(shù)（J=0.3974）為最大值，P<0.001。（圖2）。

4.3 CRC患者MT1DP表達與臨床特征的關系

我們根據(jù)78例CRC患者腫瘤組織中MT1DP表達水平的中位數(shù)為界，將78例患者分為低MT1DP組（n=39）和高MT1DP組（n=39）。結(jié)果表明，CRC中MT1DP低水平組與TNM分期（P=0.020）及遠處轉(zhuǎn)移（P=0.005）存在顯著相關性。相反的，MT1DP表達與其他臨床參數(shù)如年齡（P=0.365）、性別（P=0.610）、腫瘤大?。≒=0.103）、腫瘤位置（P=0.640）和腫瘤分化程度（P=0.147）之間無關聯(lián)（表1）。

4.4 MT1DP表達與CRC患者預后的關聯(lián)

生存分析表明，被分到兩組的患者的總存活率（OS）和無病生存率（DFS）的顯著差異是基于他們MT1DP表達水平的差異。具體表現(xiàn)為CRC患者中MT1DP低表達者的OS和DFS低于那些MT1DP高表達者（對數(shù)秩檢驗，P=0.002和0.006，分別如圖3A，3B）。

另外，Cox比例風險分析用于進一步評估MT1DP表達在CRC中對預后判斷的價值。單因素生存分析顯示，腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期、遠處轉(zhuǎn)移和MT1DP表達與CRC患者的OS和DFS顯著相關（所有P<0.05）。相反的，其他臨床病理參數(shù)，如年齡、性別和腫瘤位置不是具有統(tǒng)計學差異的預后因子（所有P>0.05，表2）。隨后，多因素Cox比例風險分析顯示MT1DP表達、TNM分期和遠處轉(zhuǎn)移與CRC患者的OS和DFS顯著相關（所有P<0.05，表2），這提示MT1DP可能是CRC的一個獨立預后因素。

5.討論

CRC仍是導致全球癌癥相關死亡的主要原因之一，其致死的主要原因是腫瘤的侵襲性及轉(zhuǎn)移[16-18]。根據(jù)癌癥統(tǒng)計，大約60%的CRC患者處于轉(zhuǎn)移的進展狀態(tài)。盡管最近已發(fā)展出多種治療方法，中晚期CRC患者預后仍然很差。

在本次研究中，我們提供了一種新的候選生物標記物，即MT1DP，用于CRC的診斷、預后判斷和治療?；?8例CRC患者腫瘤與癌旁組織的qRT-PCR結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，MT1DP在CRC組織中顯著下調(diào)。ROC曲線表明MT1DP表達水平在CRC中具有潛在的診斷價值。我們也發(fā)現(xiàn)CRC中MT1DP低表達與TNM分期和遠處轉(zhuǎn)移密切先關，這提示MT1DP表達情況可以幫助我們預測CRC腫瘤分期和判斷進展程度。連同前面肝癌研究中的發(fā)現(xiàn)，即MT1DP可以抑制肝癌細胞增殖和表型改變[15]，我們的數(shù)據(jù)顯示MT1DP可能在CRC致癌過程中發(fā)揮腫瘤抑制物的作用。

另一方面，我們的Kaplan-Meier分析表明MT1DP表達與CRC患者的OS和DFS密切關聯(lián)。另外，單因素和多因素Cox風險比例分析進一步揭示MT1DP可能是CRC患者OS和DFS的獨立預后因素。因此，MT1DP可能有助于確定具有較高死亡風險的高風險CRC患者，并可能成為一種更積極的、有效的治療的候選靶點。

總的來說，我們目前的研究首次報道了結(jié)直腸癌組織樣本中MT1DP水平的下調(diào)與結(jié)直腸癌患者的不良預后密切相關。此外，MT1DP有望成為結(jié)直腸癌患者預后的獨立危險因素。為結(jié)直腸癌患者的診斷及預后評估提供一條新途徑。

參考文獻

[1]Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin 2011；61：69-90.

[2]Morris V，Kopetz S.Clinical biomarkers in colorectal cancer.Clin Adv Hematol Oncol 2013；11：768-76.