VA納米乳制備工藝研究

毛跟年，曹晴，許牡丹，黃萌，周丹，馬可純，周亞麗，賀磊

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安，710021)

VA納米乳制備工藝研究

毛跟年*，曹晴，許牡丹，黃萌，周丹，馬可純，周亞麗，賀磊

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安，710021)

研究了VA納米乳的制備并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。運(yùn)用偽三元相圖篩選出了最佳表面活性劑與助表面活性劑以及二者最優(yōu)配比，確定的最優(yōu)工藝為：5.3 g吐溫80與2.7 g丙三醇攪拌均勻，加入2 g VA油，邊攪拌邊滴加去離子水，直至形成澄清透亮乳液，去離子水用量1mL。所制備的VA納米乳為水包油型，粒徑分布范圍為10～40 nm，平均粒徑23.68 nm。將VA納米乳10 000 r/min離心20 min，或常溫放置6個(gè)月均未見分層，表明制備的VA納米乳性質(zhì)穩(wěn)定。經(jīng)檢測(cè)，納米乳中VA含量41.66 mg/g。

VA；納米乳；偽三元相圖；穩(wěn)定性

VA(vitamin A)是指具有視黃醇(retinal)結(jié)構(gòu)，并具有其生物活性的一大類物質(zhì)的總稱，是人和動(dòng)物所必需的一種營(yíng)養(yǎng)元素[1]。具有維持視覺正常，基因調(diào)控，免疫功能及骨骼發(fā)育等生理功能[2]。但是VA作為一種脂溶性的維生素，在水中幾乎不溶，將VA油直接應(yīng)用于食品、藥品及保健品中，對(duì)于生物體的吸收利用率較低[3]。且VA結(jié)構(gòu)中含有較多的不飽和雙鍵，易氧化，穩(wěn)定性較差[4]，從而影響其功效。所以，提高VA的溶解度和穩(wěn)定性是一個(gè)難題。

納米乳又稱做微乳(ME)，是由水相、油相、表面活性劑及助表面活性劑按照合適的比例所形成的熱力學(xué)穩(wěn)定的膠體分散體系[5-6]。其粒徑為10～100 nm，整個(gè)體系外觀透明且黏度低、各向同性。將脂溶性的VA油制成O/W型納米乳，在水中以納米級(jí)均勻分散，一定程度上可以提高VA的溶解度，增加其穩(wěn)定性[7-8]。

本試驗(yàn)選擇普通的攪拌裝置進(jìn)行乳化，乳化劑廉價(jià)易得，降低了制備成本，為VA納米乳的工業(yè)化生產(chǎn)提供保證。作為一種營(yíng)養(yǎng)添加劑，VA納米乳的制備，解決了VA溶解度低及穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，在食品與保健飲料等方面有一定應(yīng)用前景[9]。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司；YP802N電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TG-16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；1200LC高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；Zetasizer NANO-ZS90納米粒度表面電位分析儀，英國(guó)Malvern公司；FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN型透射電子顯微鏡，美國(guó)FEI。

1.2 材料試劑

VA(100萬(wàn)IU/g，食品級(jí))，陜西金冠牧業(yè)有限公司；吐溫80(藥品級(jí))，浙江遂昌惠康藥業(yè)有限公司；聚氧乙烯清華蓖麻油(EL40，美國(guó)藥典國(guó)家處方，藥品級(jí))，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、正丁醇、PEG400、丙三醇(藥品級(jí))，四川金山制藥有限公司；蘇丹紅、亞甲基藍(lán)，生物染色劑，上海源葉生物試劑有限公司；甲醇(色譜純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 VA納米乳制備方法

將油相和表面活性劑按比例混合均勻，向其中緩慢滴加蒸餾水，邊加邊攪拌，開始時(shí)體系黏度較低，形成油包水(W/O)型納米乳，隨著水量的增加，體系黏度逐漸增加，繼續(xù)滴加蒸餾水，體系又會(huì)突然由黏變稀，此時(shí)W/O型納米乳發(fā)生轉(zhuǎn)相[10]，即形成水包油(O/W)型VA納米乳。本實(shí)驗(yàn)選用一般的攪拌裝置進(jìn)行納米乳的制備，相對(duì)于超聲、均質(zhì)等，降低了生產(chǎn)成本，防止制備過程中對(duì)藥物產(chǎn)生物理破壞。

1.3.2 表面活性劑的選擇

離子型表面活性劑一般毒性較大，只能應(yīng)用于外用制劑，故本研究主要采用無(wú)毒的非離子表面活性劑[11]，吐溫類HLB值較高，親水性很強(qiáng)。聚氧乙烯氫化蓖麻油HLB值13～15，能和脂肪醇、一些動(dòng)物油、植物油混均，是一種新型的食品乳化劑[12]。

本試驗(yàn)需制備O/W型納米乳，故根據(jù)HLB值初步選用吐溫80和聚氧乙烯氫化蓖麻油，再按照油相與表面活性劑質(zhì)量比為1∶9～9∶1，運(yùn)用偽三元相圖篩選出最佳的表面活性劑。

1.3.3 助表面活性劑的篩選

選用毒副作用小的無(wú)水乙醇、正丁醇、PEG400、丙三醇[13]，按照油相與表面活性劑質(zhì)量比為1∶9～9∶1，運(yùn)用偽三元相圖篩選最佳助表面活性劑。

1.3.4 VA納米乳配方的優(yōu)化

根據(jù)選定的表面活性劑與助表面活性劑，利用偽三元相圖確定其最優(yōu)配比。

試驗(yàn)過程中，記錄相轉(zhuǎn)變時(shí)的耗水量，以VA油、表面活性劑和水分別作為三角形的3個(gè)頂點(diǎn)，繪制偽三元相圖，以納米乳形成區(qū)域面積大小為指標(biāo)篩選配方，試驗(yàn)選擇油相與表面活性劑1∶9～9∶1的比例來(lái)篩選配方用量。

1.3.5 VA納米乳的質(zhì)量評(píng)價(jià)

(1)乳劑類型的判別：

根據(jù)染料蘇丹紅和亞甲基蘭在納米乳中的擴(kuò)散快慢進(jìn)行判別[14]，若紅色擴(kuò)散速度快，則為油包水(W/O)型；若藍(lán)色擴(kuò)散速度快，則為水包油(O/W)型。

(2)納米乳形態(tài)與粒徑測(cè)定：

(a)形態(tài)觀察：使用Tecnai G2 F20 200 kV場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡觀察。取VA納米乳0.1 mL，稀釋1 000倍后，滴加在銅網(wǎng)上，自然干燥，然后用2%磷鎢酸復(fù)染，待干燥后觀察。

(b)粒徑測(cè)定：采用Zetasizer NANO-ZS90型激光粒度分析儀進(jìn)行粒度分析[15]。取VA納米乳0.1 mL，稀釋250倍后，進(jìn)行檢測(cè)。

(3)納米乳中VA含量測(cè)定

采用高效液相色譜法[16]測(cè)定。

(a)色譜條件。色譜柱：C18(2.8 μm,150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(水)=98∶2；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；波長(zhǎng)：利用紫外全波長(zhǎng)掃描確定測(cè)定波長(zhǎng)。

(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。稱取VA對(duì)照品3 mg，甲醇溶解并定容至50 mL，制成0.06 mg/mL VA標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后用流動(dòng)相稀釋該溶液，制成濃度分別為0.012、0.024、0.036、0.048、0.060 μg/mL的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度分別吸取20 μL進(jìn)樣，測(cè)得峰面積。以濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

(c)溶液的制備。精密稱取3份VA納米乳樣品各0.06 g，分別編號(hào)為1、2、3，50 ℃超聲，冷卻，甲醇稀釋并定容至50 mL，作為供試品溶液。精密稱取不含VA的樣品0.06 g，同法制備，作為陰性對(duì)照溶液。2種溶液分別取20 μL進(jìn)樣。

(d)精密度和重現(xiàn)性試驗(yàn)。精密度：精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算RSD值。

重現(xiàn)性：取同一批樣品，按照上述色譜條件平行測(cè)定6份，計(jì)算RSD值。

(e)加樣回收試驗(yàn)。精密稱取供試品溶液適量，加入對(duì)照品溶液，甲醇定容至10 mL，配制濃度分別為0.029、0.032、0.035 mg/mL的待測(cè)樣品，進(jìn)樣，測(cè)定實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算回收率及RSD值。

(4)納米乳穩(wěn)定性檢驗(yàn)

(a)外觀 將所制備的納米乳常溫6個(gè)月，觀察其外觀、透明度及分層情況[18]，判斷納米乳的穩(wěn)定性。

(b)高速離心試驗(yàn) 將VA納米乳于10 000 r/min離心20 min，觀察其外觀是否有變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳表面活性劑的確定

選擇吐溫80、聚氧乙烯氫化蓖麻油(EL40)以及二者復(fù)配作為表面活性劑，制備VA納米乳，以VA油、表面活性劑及滴加水量為坐標(biāo)繪制偽三元相圖，如圖1所示。

圖1 不同表面活性劑對(duì)納米乳形成區(qū)域的影響Fig.1 Effect of different surfactants on the formation of emulsion

由圖1可知，以吐溫80作為表面活性劑制備VA納米乳時(shí)形成的微乳區(qū)域最大，表明吐溫80作為表面活性劑更易形成納米乳。形成的微乳區(qū)域越大，越有利于減少表面活性劑的用量、增加VA的載藥量[19]，故表面活性劑選擇吐溫80較適宜。

2.2 助表面活性劑篩選結(jié)果

助表面活性劑從無(wú)水乙醇、正丁醇、丙三醇、PEG400中進(jìn)行選擇，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 不同助表面活性劑對(duì)納米乳形成的影響

由表1可知，當(dāng)以無(wú)水乙醇和正丁醇為助表面活性劑時(shí)，乳液出現(xiàn)渾濁，說(shuō)明并未形成納米乳。而丙三醇與PEG400作為助表面活性劑時(shí)，均可形成澄清透明的納米乳，再通過偽三元相圖從丙三醇和PEG400中篩選出適宜的助表面活性劑。

分別以丙三醇和PEG400為助表面活性劑，表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比按1∶1進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同助表面活性劑對(duì)納米乳形成區(qū)域的影響Fig.2 Effect of differentcosurfactant on the formation of nano emulsion

由圖2可得，與PEG400相比，丙三醇作為助表面活性劑，所形成納米乳的微乳區(qū)域面積更大。由于丙三醇易溶于水，且具有一定的親脂性，提高了界面膜的柔順性和牢固性，降低了體系的黏度。作為助表面活性劑，丙三醇還可以調(diào)節(jié)體系的親水親油平衡值(HLB值)，當(dāng)其與吐溫80混合后，HLB值與VA更接近，有利于降低體系的油水界面張力[20]，有助于O/W型納米乳的形成，故最終確定丙三醇為制備VA納米乳的助表面活性劑。

2.3 VA納米乳最優(yōu)配方確定

以吐溫80為表面活性劑，丙三醇為助表面活性劑，設(shè)定表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比(Km)為1∶1、1∶2和2∶1進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同Km對(duì)納米乳形成區(qū)域的影響Fig.3 Effect of different Km on the formation ofnano emulsion

當(dāng)吐溫80與丙三醇比例為2∶1時(shí)，HLB值與油相最接近，所制備納米乳的微乳區(qū)域最大，隨著表面活性劑用量的增加，納米乳更易形成，且粒徑更小。當(dāng)表面活性劑與油達(dá)到一定比例時(shí)，體系形成層狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生最小界面張力，促進(jìn)了納米乳滴的形成。根據(jù)微乳區(qū)域大小及納米乳在水中的分散性，確定出最佳配方及制備工藝為：取5.3 g吐溫80與2.7 g丙三醇攪拌均勻，加入2 gVA油，邊攪拌邊滴加去離子水，直至形成澄清透亮乳液，去離子水最終用量為1 mL。

2.4 VA納米乳質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4.1 納米乳類型的判別

在制備的納米乳中加入油溶性染料蘇丹紅和水溶性染料亞甲基蘭，結(jié)果藍(lán)色擴(kuò)散速度較快，說(shuō)明所制備的乳劑為水包油型。

2.4.2 納米乳形態(tài)與粒徑分布結(jié)果

VA納米乳形態(tài)和粒徑分布分別如圖4、圖5所示。

圖4 VA納米乳透射電鏡照片F(xiàn)ig.4 TEM photograph of vitamin A nano emulsion

圖5 VA納米乳粒度測(cè)定結(jié)果Fig.5 The results of VA nano emulsion particle size

由圖4、圖5可得，所制備VA納米乳在水中分散呈球形，大小較均勻，沒有黏連，粒徑分布10～40 nm，平均粒徑為23.68 nm，說(shuō)明VA納米乳的粒徑分布范圍較窄，粒徑較均勻，符合納米乳基本要求。

2.4.3 納米乳中VA含量測(cè)定結(jié)果

2.4.3.1 最大波長(zhǎng)的確定

對(duì)所制備的對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照品在190～500 nm進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，結(jié)果如圖6所示。

圖6 VA納米乳波長(zhǎng)掃描結(jié)果Fig.6 The results of wavelength scanning of vitamin A nano emulsion

由圖6結(jié)果可得，VA對(duì)照品和VA納米乳供試品在325 nm處均有最大吸收峰，而陰性對(duì)照與供試品在285 nm處均有吸收峰，其對(duì)VA的含量測(cè)定不會(huì)產(chǎn)生影響，故選擇波長(zhǎng)325 nm進(jìn)行VA含量測(cè)定。

2.4.3.2 含量測(cè)定

根據(jù)所配濃度梯度對(duì)照品測(cè)定結(jié)果，以樣品濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：y=118 861x-270.29，R2=0.999 3，線性范圍：0.012～0.06 mg/mL。取供試品溶液20 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算可得納米乳中VA含量為41.66 mg/g。

2.4.3.3 精密度和重現(xiàn)性試驗(yàn)

將對(duì)照品進(jìn)樣3次，所得結(jié)果的RSD為0.87%，表明儀器精密度良好；同一批供試品平行測(cè)定6次，結(jié)果RSD為1.13%，表明該方法重現(xiàn)性好。

2.4.3.4 加樣回收試驗(yàn)

經(jīng)測(cè)定，3個(gè)濃度的加樣回收率分別為101.65%、100.48%、98.95%，平均回收率100.4%，RSD為1.77%，表明測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確。

2.4.4 納米乳穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

2.4.4.1 外觀

由圖7可知，所制備的VA納米乳澄清透亮，常溫下放置6個(gè)月未出現(xiàn)渾濁、分層等現(xiàn)象，表明該納米乳穩(wěn)定性良好。

圖7 VA納米乳穩(wěn)定性考察結(jié)果Fig.7 Results of the stability of vitamin A nano emulsion

2.4.4.2 高速離心試驗(yàn)

將VA納米乳10 000 r/min離心20 min后仍為澄清、透亮、流動(dòng)性好、均一穩(wěn)定的乳液，未出現(xiàn)分層、破乳現(xiàn)象，說(shuō)明所制納米乳性質(zhì)穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本文制備了水包油型VA納米乳，利用偽三元相圖進(jìn)行配方和工藝優(yōu)化，確定最優(yōu)配比為：2 g VA油，5.3 g吐溫80，2.7 g丙三醇，去離子水1 mL。所制備乳劑粒徑分布為10～60 nm，平均粒徑23.68 nm，該納米乳中VA含量41.66 mg/g，穩(wěn)定性良好。采用本工藝技術(shù)能夠?qū)⒅苄缘腣A有效地轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄缘腣A納米乳，能夠?yàn)橹苄訴A在食品和保健飲料、口服液中的應(yīng)用提供便利。

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Study on preparation of vitamin A nano emulsion

MAO Gen-nian*, CAO Qing, XU Mu-dan, HUANG Meng, ZHOU Dan, MA Ke-chun, ZHOU Ya-li, HE Lei

(College of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science&Technology, Xi’an 710021,China)

The preparation of vitamin A nano emulsion was studied and its properties were evaluated. The best surfactant, co-surfactant and the two optimal ratio were screened out by using the pseudoternary phase diagram. The optimal process was as follows: 5.3 g Tween 80 and 2.7 g glycerol, stir evenly, add Vitamin A oil 2g, stir while dropping deionized water, until the forming a clear and transparent emulsion, the amount of deionized water was 1mL. The vitamin A nano emulsion for the preparation was of oil-in-water, the distribution range of particle size was 10-40 nm, the average particle size was 23.68 nm. By centrifuged at 10 000 r/min for 20 min, the vitamin A nano emulsion was stable without stratification at the room temperature for 6 months. The vitamin A of 41.66 mg/g in nano emulsion was detected.

vitamin A; nano emulsion; pseudoternary phase diagram; stability

學(xué)士，教授(本文通訊作者,E-mail：maogn@sust.edu.cn)。

陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-167)

2016-09-26，改回日期：2016-11-23

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706039