環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)α-熊果苷的反應(yīng)條件優(yōu)化及分子改造

張文蕾，宿玲恰， 陶秀梅，吳敬*

1(江南大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué),生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)α-熊果苷的反應(yīng)條件優(yōu)化及分子改造

張文蕾1，2，宿玲恰1，2， 陶秀梅1，2，吳敬1，2*

1(江南大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué),生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

選擇4種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)分別為來源于Paenibacillusmacerans的α- CGTase，Bacilluscirculans251的β- CGTase,BacillusstearothermophilusNO2和Anaerobrancagottschalkii的α/β-CGTase，研究不同種類的CGTase生產(chǎn)α-熊果苷的情況。以麥芽糊精為供體，對苯二酚(Hydroquinone HQ)為受體，通過CGTase和淀粉葡萄糖苷酶的兩步酶法反應(yīng)催化合成α-熊果苷。分別優(yōu)化不同類型的酶合成α-熊果苷的條件，發(fā)現(xiàn)Anaerobrancagottschalkii來源的CGTase在如下最優(yōu)條件下獲得的HQ摩爾轉(zhuǎn)化率最高，為25%:以葡萄糖當(dāng)量(DE) 值為 9% ～ 13%的50 g/L麥芽糊精作為供體，8 g/L HQ為受體，緩沖液pH 6.0，在40 ℃下反應(yīng)24 h，沸水浴滅活后，加入糖化酶處理，高效液相色譜檢測產(chǎn)物。為了進一步提高CGTase對底物的轉(zhuǎn)化率，利用定點突變技術(shù)對A.gottschalkiiCGTase進行分子改造，得到1個突變體Y299A，在最優(yōu)的反應(yīng)條件下突變體的HQ轉(zhuǎn)化率可達40%。

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；α-熊果苷；酶催化；定點突變

熊果苷(arbutin)又稱熊果素，存在于一種來源于杜鵑花科熊果屬的灌木植物——熊果葉子細胞中，是一種新興的無刺激、無過敏、配伍性強的天然美白活性物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)[1-2]。依據(jù)結(jié)構(gòu)不同可將熊果苷分為α型和β型，α-熊果苷是β-熊果苷的差向異構(gòu)體，并且其美白效果是β-熊果苷10倍以上，從安全性上考慮，α-熊果苷比β-熊果苷更具有較高的安全性[3]。鑒于此，國內(nèi)外許多家化妝品公司已采用α-熊果苷代替β-熊果苷作為美白添加劑[4]。除此之外熊果苷還具有抗炎、抑菌鎮(zhèn)咳、平喘抗氧化的作用。

目前文獻報道的熊果苷的制備方法分別為天然產(chǎn)物提取法、植物組織培養(yǎng)法、化學(xué)合成法以及酶轉(zhuǎn)化法[5]。α-熊果苷的制備方法主要是通過微生物細胞轉(zhuǎn)化法和酶法合成制得，其中微生物細胞轉(zhuǎn)化法是通過不同微生物的酶將糖基轉(zhuǎn)移，1分子葡萄糖的葡糖基轉(zhuǎn)移至1分子HQ上形成了單一的α-熊果苷[6]。酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷主要是將糖基轉(zhuǎn)移酶作為催化劑，通過催化糖基轉(zhuǎn)移來合成α-熊果苷，而其中轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)中酶底物一般是雙糖或多糖，酶法生產(chǎn)α-熊果苷具有簡單方便的優(yōu)勢。趙如奎利用α-CGT合成α-熊果苷，HQ轉(zhuǎn)化率為 7.77%，產(chǎn)量為3.17g/L[7]。SINDHU MATHEW利用來源于Thermoanaerobactersp.的CGT酶生物催化合成α-熊果苷，對HQ轉(zhuǎn)化率最高可達 30%[8]。

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextringlycosyltransfer，CGT 酶，EC2. 4. 1. 19) 是一種胞外酶，同時也是一種多功能酶，能催化3種轉(zhuǎn)糖基反應(yīng) (歧化、環(huán)化和耦合反應(yīng)) 和水解反應(yīng)[9]。CGTases共有5 個結(jié)構(gòu)域，其中B域含有一個明顯的底物結(jié)合凹槽，通過凹槽周圍氨基酸與底物結(jié)合[10]。在底物結(jié)合凹槽中存在9 個亞位點，標記為+2～-7，每個亞位點能結(jié)合一個葡萄糖殘基[11]。對CGTase關(guān)鍵氨基酸的定點突變往往會造成酶活力的變化[19]。+1，+2位點是催化轉(zhuǎn)糖基的關(guān)鍵位點，對其附近的氨基酸進行突變能夠有效的改變CGTase的水解和歧化活力，而在其他位點進行突變則效應(yīng)不明顯。+1亞位點附近涉及的氨基酸殘基：Leu194、Ala230 和 His233 進行定點飽和突變，附近氨基酸殘基的突變能有效提高CGT 酶與底物分子的親和性[12]。HANS LEEMHUIS等人研究對CGTase轉(zhuǎn)糖基特異性起關(guān)鍵作用的氨基酸，發(fā)現(xiàn)將230位的Ala突變?yōu)閂al后，歧化活力大大降低，其水解能力成為突變酶的主要反應(yīng)。主要原因是受體位點附近的230Ala的側(cè)鏈較短，當(dāng)突變?yōu)閂al時它的側(cè)鏈較長會阻礙糖在受體亞位點的結(jié)合，導(dǎo)致歧化活力降低。由CGT酶催化的所有反應(yīng)都以先經(jīng)過底物結(jié)合、糖苷鍵裂解和糖基-酶共價中間體形成，這一步驟的效率由底物殘基和易斷裂鍵的結(jié)合速度決定。然后進行親核氧原子攻擊，在轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)中通過糖基受體的O4原子攻擊糖基-酶共價中間體的C1原子，在這個步驟中，最關(guān)鍵的是被攻擊的+1亞位點的+1位葡萄糖殘基的正確取向。Val側(cè)鏈對+1葡萄糖的O3原子造成空間位阻，因此干擾+1葡萄糖與酶的正確結(jié)合[13]。本實驗研究了不同來源的CGTase的轉(zhuǎn)糖基生產(chǎn)α-熊果苷的能力，優(yōu)化酶轉(zhuǎn)化條件，研究轉(zhuǎn)化率最高的CGTase受體位點附近的空間結(jié)構(gòu)，通過對受體位點附近的氨基酸進一步的分子改造提高酶對底物的轉(zhuǎn)化效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

含有分別來源于Paenibacillusmacerans(GenBank Accession No. M 208063)、Bacilluscirculans251(No.P43379.1)、Anaerobrancagottschalkii(No.CAH61550.1)、B.stearothermophilusNO2(No.X59042.1)的cgt基因的E.coliBL21(DE3)重組菌由本實驗室構(gòu)建及保藏。

1.1.2 試劑

PrimerStar、T4DNA連接酶、瓊脂糖、堿性磷酸酶CIAP、核酸分子量標準均購自寶生物(大連)公司；E.coli感受態(tài)細胞制備試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)均購自上海生工生物工程公司；α-熊果苷標樣購自Sigma公司；其他常規(guī)試劑均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 四種酶生成α-熊果苷的優(yōu)化及檢測

利用4種CGTase合成α-熊果苷，酶轉(zhuǎn)化的反應(yīng)體系如下：在20 mmol/L pH 6. 0 的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液體系中包含50 g/L麥芽糊精、8 g/L HQ，適量的4種CGTase，于水浴搖床中反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后加入葡萄糖淀粉酶，于40 ℃反應(yīng)4 h后，沸水浴5 min滅活，離心后經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析。不同的pH和HQ濃度的酶轉(zhuǎn)化實驗只需改變相應(yīng)的變量，其余同上。

1.2.2A.gottschalkiiCGTase Tyr299突變體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將不同來源的CGTase生產(chǎn)α-熊果苷的條件進行優(yōu)化，研究不同的溫度，pH和HQ濃度下CGTase生產(chǎn)α-熊果苷的摩爾產(chǎn)率。比較4種CGTase生產(chǎn)α-熊果苷的能力差異，對轉(zhuǎn)化率最高的酶的受體位點附近的氨基酸進一步的分子改造提高轉(zhuǎn)化率。

根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析，本研究以A.gottschalkiiCGTase的299位酪氨酸為研究對象，通過設(shè)計一對引物，采用基于一步PCR介導(dǎo)的定點突變方法對CGTase編碼基因進行定點突變。引物分別為：正向引物：5’-GGTGAGTGG GCTTTAGGTAA AGATGAA-3’反向引物：5’-TTCATCTTTA CCTAAAGCCC ACTCACC-3’(下劃線為突變堿基)。PCR擴增后取10 μL經(jīng)過Dpn I處理的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109，涂布到LB固體平板(含ampicillin，AMP)上。挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8～10 h并提取質(zhì)粒，交由上海生工生物工程有限公司測序。將測序正確的突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主E.coliBL21(DE3)，得到含有突變基因的基因工程菌。

線陣聲學(xué)段內(nèi)張力則關(guān)系到系固在段內(nèi)的水聽器的安全保障性能及其工作穩(wěn)定性。因此，準確對線陣聲學(xué)段內(nèi)張力進行估計和預(yù)報是非常有必要的。

1.2.3 突變CGTase的表達

分別將測序正確成功突變的菌株接種于10 mL的LB 培養(yǎng)基中，200 r/min搖床，37 ℃培養(yǎng)8～10 h。取上述菌液按4% (V/V) 的接種量，接種至100 mL TB，37 ℃培養(yǎng)當(dāng)菌體長至OD600為0.6 時，添加IPTG 至0.01 mmol/L，25 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)48 h后，發(fā)酵液8 000 r/min、4 ℃離心15 min，除去菌體，上清即為粗酶液。

1.2.4 酶活測定

歧化活力[18]：取600 μL含有終濃度4 mmol/L的4-硝基苯基-α-D-麥芽庚糖-4-6-O-亞乙基(EPS)和20 mmol/L的麥芽糖溶液于50 ℃保溫10 min，然后加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，反應(yīng)10 min，加入50 μL 3 mol/L HCl終止反應(yīng)，5 min后用50 μL 3 mol/L NaOH溶液中和，然后加入 100 μL α-葡萄糖苷酶于60 ℃反應(yīng)60 min，加入100 μL 1 mol/L Na2CO3溶液將pH調(diào)節(jié)到pH8以上，401 nm處測定溶液的吸光值。1個酶活單位(U)定義為每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol EPS所需的酶量。

1.2.5 突變體的晶體結(jié)構(gòu)模擬

野生型 (突變型) CGT 酶的理論晶體結(jié)構(gòu)通過SWISS-MODEL蛋白模擬在線服務(wù)器進行同源模擬獲得[15]，模板為來源于B.circulans251的CGT 酶 (PDB 編碼：1CXK)[16]。麥芽九糖抑制劑由模板PDB 1CXK 的活性位點轉(zhuǎn)移至模型的活性位點。

2 結(jié)果與討論

2.1 四種來源CGTase的表達與合成α-熊果苷的條件優(yōu)化

將來源于P.macerans、B.circulans251、B.stearothermophilusNO2和A.gottschalkii分別屬于 α-CGTase、β-CGTase和α/β-CGTase進行搖瓶發(fā)酵，粗酶液的岐化活力分別為：55 U/mL、20 U/mL、55 U/mL和 60 U/mL,本文研究不同類型的CGTase的轉(zhuǎn)糖基作用，不同來源的CGTase生產(chǎn)α-熊果苷的能力有很大差異，以上4種酶的最適加酶量分別為74 U/mL、60 U/mL、65 U/mL和 60 U/mL 對它們合成α-熊果苷的條件進行優(yōu)化，分別研究溫度，pH和HQ濃度對反應(yīng)的影響。

2.1.1 反應(yīng)溫度對生產(chǎn)α-熊果苷的影響

為考察溫度對CGTase合成α-熊果苷的影響，以HQ和麥芽糊精為底物用4種CGTase分別在30～50 ℃范圍內(nèi)進行酶轉(zhuǎn)化，由圖1可知，在低于40 ℃的時候，溫度升高有利于提高酶的活性，相應(yīng)的HQ的轉(zhuǎn)化率會提高，最高為來源于A.gottschalkii的轉(zhuǎn)化率可達23%。當(dāng)酶反應(yīng)溫度過高，酶對底物的催化活力會降低，而且高溫下HQ易氧化，導(dǎo)致反應(yīng)體系中可利用的底物變少，轉(zhuǎn)苷效率降低。4種CGTase均在40℃對HQ的轉(zhuǎn)化率較高，因此選擇40 ℃為酶反應(yīng)的最佳溫度。

圖1 反應(yīng)溫度對生產(chǎn)α-熊果苷的影響Fig.1 Effects of temperature on the yield of α-arbutin

2.1.2 pH對生產(chǎn)α-熊果苷的影響

為考察轉(zhuǎn)化α-熊果苷的最適pH，本研究分別在pH 5.0～7.0范圍內(nèi)用4種CGTase在40 ℃下進行酶轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖2所示。4種CGTase在pH6.0時對HQ的轉(zhuǎn)化率最高，A.gottschalkii來源的酶可以達到25%。原因可能是由于pH6.5時底物HQ與酶的受體位點的結(jié)合更容易，因此有利于CGTase的轉(zhuǎn)糖基作用，選擇pH6.0作為生產(chǎn)α-熊果苷的初始pH。

圖2 pH對生產(chǎn)α-熊果苷的影響Fig.2 Effects of pH on the yield of α-arbutin

2.1.3 HQ濃度對生產(chǎn)α-熊果苷的影響

CGTase轉(zhuǎn)化HQ生成α-熊果苷的反應(yīng)是雙底物反應(yīng)，底物的濃度是影響酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的重要因素。麥芽糊精濃度過高會殘留在酶反應(yīng)體系中，造成浪費，過低又會影響HQ的轉(zhuǎn)化。HQ的毒性對酶反應(yīng)有抑制作用，在高濃度下更易氧化，當(dāng)緩沖液中HQ濃度超過8 g/L時，酶活性會下降[7]。因此，糖基供體與受體的比例對生產(chǎn)α-熊果苷影響較大，本研究考察了HQ對α-熊果苷產(chǎn)量的影響。反應(yīng)體系為50 g/L的麥芽糊精，不同質(zhì)量濃度的HQ，40 ℃下進行酶轉(zhuǎn)化。結(jié)果如圖3：HQ的轉(zhuǎn)化率隨著濃度先增加后降低，當(dāng)HQ的濃度為8 g/L時，摩爾轉(zhuǎn)化率最高可以達到25%，此時α-熊果苷的產(chǎn)率為7.9g/L。因此本研究選擇8 g/L的HQ和50 g/L的麥芽糊精為生產(chǎn)α-熊果苷的最佳底物濃度。

圖3 HQ質(zhì)量濃度對生產(chǎn)α-熊果苷的影響Fig.3 Effects of HQ concentration on the yield of α-arbutin

2.2A.gottschalkiiCGTaseTyr299突變體的構(gòu)建及對合成α-熊果苷的影響

2.2.1A.gottschalkiiCGTase突變體的構(gòu)建

通過對α-熊果苷合成條件優(yōu)化，4種CGTase中A.gottschalkii來源的CGT酶的HQ的摩爾轉(zhuǎn)化率最高為25%，嘗試對CGTase進行分子改造，提高CGT酶的歧化活力以A.gottschalkiiCGTase的299位氨基酸為目標，通過設(shè)計一對引物，利用PCR擴增技術(shù)，得到擴增序列，用雙酶切驗證后經(jīng)凝膠電泳分析，突變體在2 166bp和3 716bp處有特異性條帶，如圖4所示。將測序正確的突變菌株，搖瓶發(fā)酵獲得酶液，用于酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-熊果苷。

M1，M2-DNA Marker；1-質(zhì)粒雙酶切后的條帶圖4 重組質(zhì)粒pET-20b(+)-cgt酶切驗證Fig.4 Restriction analysis of recombinant plasmid pET-20b(+)-cgt

2.2.2 突變對酶活及α-熊果苷產(chǎn)量的影響

對原始酶的第299位氨基酸進行突變后酶活也相應(yīng)的改變，原始酶的粗酶液的酶活為 60 U/mL，突變體Y299 A的岐化活力為 69 U/mL，通過定點突變，酶的歧化活力得到了提高。通過對突變酶生產(chǎn)α-熊果苷的條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)其最適酶轉(zhuǎn)化條件與野生酶相同，因此在20 mmol/L pH 6.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液體系中加入終濃度為50 g/L麥芽糊精，HQ含量為8 g/L ，水浴搖床在不同的溫度中反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后加入糖化酶處理后經(jīng)高效液相色譜(HPLC) 分析。結(jié)果如圖5所示：野生型的轉(zhuǎn)化率為25%，突變體轉(zhuǎn)化率可達到40%，突變體Y299A 相對于野生型轉(zhuǎn)化的熊果苷產(chǎn)量取了較顯著的提高。

圖5 野生型 CGT 酶與麥芽九糖抑制劑在實299位氨基酸處的作用的模擬結(jié)構(gòu)Fig.5 Close-up the wild-type CGTases theoretical structure with a maltononaose substrate at acceptor Site

推測突變體的轉(zhuǎn)化率提高的原因，利用SWISS-MODEL蛋白模擬系統(tǒng)，模擬CGT酶的晶體結(jié)構(gòu)。通過結(jié)構(gòu)比對(如圖5)，發(fā)現(xiàn)突變前第299位酪氨酸在受體位點+1和+2之間，該位點在空間結(jié)構(gòu)中處于非常重要的位置。Tyr的較大的苯環(huán)側(cè)鏈形成了空間位阻，較大程度的阻擋了+2位附近的受體氧原子攻擊糖基-酶共價中間體，導(dǎo)致轉(zhuǎn)糖基作用較弱[16]。通過結(jié)構(gòu)模擬將Tyr突變?yōu)閭?cè)鏈最短的非極性的丙氨酸Ala，如圖6所示，CGT 酶第299 位的氨基酸由Tyr突變?yōu)锳la后苯環(huán)對受體位點的空間位阻效應(yīng)消失，使得HQ和糖基-酶的共價中間體更好地接觸而且Ala為非極性氨基酸，對非極性的HQ親和性高于極性的酪氨酸更加有利于轉(zhuǎn)糖基作用。

圖6 突變型 CGT 酶與麥芽九糖抑制劑在實299位氨基酸處的作用的模擬結(jié)構(gòu)Fig.6 Close-up the mutant CGTases theoretical structure with a maltononaose substrate at acceptor Site

3 結(jié)語

本實驗將來源于A.gottschalkii、P.macerans、B.stearothermophilusNO2以及B.circulans251的CGTase用于生產(chǎn)α-熊果苷，分別探索了溫度，pH，對苯二酚濃度對酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響，得出最適溫度均為40℃，最適pH均為6.0，最佳底物濃度為50 g/L的麥芽糊精，對苯二酚的質(zhì)量濃度為8 g/L時，反應(yīng)24 h均達到平衡,糖化酶處理熊果苷的轉(zhuǎn)化率分別為25%、20%、14%、11%。利用定點突變將A.gottschalkiiCGTaseTyr 299突變?yōu)锳la，獲得突變基因Y299A，相同條件下突變酶Y299A的α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率為40%，實現(xiàn)了α-熊果苷的產(chǎn)量的提高，轉(zhuǎn)化率達到了目前利用CGTase生產(chǎn)α-熊果苷的最高。

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Optimization of conditions for production of α-arbutin by cyclodextrin glucosyltransferase and its molecular modification

ZHANG Wen-lei1，2,SU Ling-qia1，2,TAO Xiu-mei1，2,WU Jing1，2*

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(School of Biotechnology and Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

α-CGTase ofPaenibacillusmacerans，β-CGTase ofBacilluscirculans251, α/β-CGTase ofBacillusstearothermophilusNO2andAnaerobrancagottschalkiiwere selected to study the effects of cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase) on production of α-arbutin.α-arbutin was synthesized by a two-step enzymatic reaction system of CGTase and amyloglucosidase. The optimum conditions for the synthesis of α-arbutin were optimized, and the highest conversion rate of hydroquinone (HQ) was 25% by CGTase fromAnaerobrancagottschalkii. The optimum conditions for enzyme conversion were as follows: 50 g/L maltodextrin with glucose equivalent (DE) of 9%-13%, 8 g/L hydroquinone, buffer pH 6.0, reaction at 40 ℃ for 24 h. The production of α-arbutin was determined by high performance liquid chromatography. In order to further improve the conversion rate of HQ, site - directed mutagenesis on CGTase under the optimal reaction conditions was carried out, and the hydroquinone conversion rate of the mutant Y299A was 40%.

Cyclodextrin glucosyltransferase(CGTase)； α-arbutin；enzyme-catalyzed；site-directed mutagenesis

碩士研究生(吳敬博士為通訊作者,E-mail:jingwu@jiangnan.edu.cn)。

國家杰出青年基金(31425020)

2016-12-12,改回日期：2017-02-18

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706008