海洋脂肪酶YS2071的固定化及酶學性質(zhì)研究

姜峻穎，馬子賓，孫晶晶，郝建華，劉均忠，王躍軍，孫謐*

1(中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所，海洋國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島，266071)2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

海洋脂肪酶YS2071的固定化及酶學性質(zhì)研究

姜峻穎1,2，馬子賓1，孫晶晶1，郝建華1，劉均忠1，王躍軍1，孫謐1*

1(中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所，海洋國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島，266071)2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

為提高脂肪酶的利用效率，更好應用于工業(yè)化生產(chǎn)，研究了脂肪酶YS2071的固定化技術(shù)，篩選最優(yōu)載體，通過單因素實驗法對脂肪酶固定化的條件進行優(yōu)化，并對其性質(zhì)進行了研究。采用MI-BSI伯胺功能基吸附樹脂為載體，京尼平為交聯(lián)劑，吸附-交聯(lián)的方法，分析了加酶量、吸附時間、吸附溫度、初始pH、交聯(lián)劑的濃度、交聯(lián)時間等因素對脂肪酶固定化效果的影響，并通過PB實驗和響應面實驗，確定了最佳固定化條件：加酶量為8 mg，吸附時間8 h，吸附溫度為20 ℃，初始pH 8.6，交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為0.48 g/L，交聯(lián)時間為1 h時，固定化效率最高，酶活回收率達到60% 以上。

脂肪酶；固定化；酶學性質(zhì)

脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3,甘油酯水解酶)是催化三酯酰甘油水解的一類酶的總稱，是一類特殊的酯鍵水解酶。其天然底物是長鏈脂肪酸酯，可以在油-水界面上催化油脂水解生成甘油、脂肪酸和甘油二酯或甘油單酯。

脂肪酶作為生物催化劑在不同的體系下，可以催化部分酯類物質(zhì)的氨解、酯化、轉(zhuǎn)酯化、水解和醇解等化學反應[1]，且反應不需要輔酶，反應條件溫和，副產(chǎn)物少。因此，脂肪酶的應用十分廣泛，在食品工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、化學化工、環(huán)境保護、能源開發(fā)等領(lǐng)域均有研究應用[2-3]。產(chǎn)脂肪酶的微生物種類很多，海洋微生物作為海洋中一種重要的生物資源，能產(chǎn)生許多陸地微生物不能產(chǎn)生的活性物質(zhì)，如高溫酶和低溫酶，這將大大拓展脂肪酶的應用范圍，為一些有機合成及生物技術(shù)提供新方向。

游離脂肪酶用途廣泛、催化技術(shù)較成熟，但回收利用率低，易受外界環(huán)境影響，難以實現(xiàn)連續(xù)化操作。酶固定化后一般穩(wěn)定性增加，酶活損失較小，易從反應系統(tǒng)中分離，能反復多次使用[4]。固定化脂肪酶的性能主要取決于其固定化所使用載體材料的性質(zhì)和固定化方法，傳統(tǒng)的固定化方法有以下4種：包埋法、吸附法、共價結(jié)合法和交聯(lián)法。一些新的固定化方法如雙重固定化、定向固定化和無載體固定化等，可以提高固定化的效率。雙重固定法將2種傳統(tǒng)的方法聯(lián)用，克服單一方法的缺陷，減少酶活力的損失，重復使用性和操作穩(wěn)定性較好。交聯(lián)酶聚集體是一種較常用的無載體固定化酶技術(shù)，無需載體、空間效率高，但機械強度較差。姜艷軍[5]等將交聯(lián)酶聚集體與仿生硅化技術(shù)結(jié)合，京尼平為交聯(lián)劑，制得的固定化酶酶活達897 U/g，有機溶劑耐受能力、重復使用性能等方面明顯提高。定向固定化通過酶分子表面遠離活性中心的特異性基團與載體共價交聯(lián)實現(xiàn)固定化，酶穩(wěn)定性增強，但方法較為復雜，應用范圍受到限制[6]。本文采用吸附-交聯(lián)雙重固定的方法，將脂肪酶YS2071固定在MI-BSI伯胺功能基酶載體樹脂上，并對其固定化條件和酶學性質(zhì)進行研究，旨在尋找一種適合YS2071的固定化方法，提高固定化的效率與穩(wěn)定性，更好的用于工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海洋脂肪酶YS2071由黃海水產(chǎn)研究所海洋產(chǎn)物資源與酶工程課題組自行制備，京尼平(純度>98%)：之信生物科技公司；對硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)：sigma公司；對硝基苯基月桂酸酯(p-nitropHenyl laurate,pNP-lauate)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、異丙醇、叔丁醇、乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；曲拉通TritonX-100：分析純，上海麥克林生物科技有限公司；樹脂：山東魯抗立科藥業(yè)有限公司、杭州創(chuàng)科生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-10D型冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠；CR21G Ⅲ日立高速冷凍離心機，日本HITACHI公司；H1650-W臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)公司；LKB2219恒溫水浴鍋，瑞典BROMMA；ORION Model 818 pH計，美國奧立龍；THZ-C-1全溫振蕩器，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；Infinite M200Pro多功能微孔板檢測儀，瑞士帝肯(Tecan)公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 脂肪酶酶活測定方法

參照HATZINIKOLAOU[7]和李忠磊[8]的方法并改進，底物為pNP-lauate。

反應體系：A液：83.3 mgpNP-lauate 溶于異丙醇中，定容至25 mL。

B液：0.1 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液加入0.4% TritonX-100，定容至1 L。

將0.1 mL A液與1.5 mL B液混勻后，40 ℃恒溫水浴鍋中預熱4 min，隨后加入0.1 mL待測酶液(對照組為等量煮沸8 min滅活的酶液)，繼續(xù)孵育8 min，取出，加入2 mL乙醇冰浴終止反應，在410 nm處測定吸光值。固定化酶酶活力測定在游離酶基礎(chǔ)上，將游離酶替換成固定化酶(對照組為等量煮沸8 min滅活的固定化酶)。

酶活力單位(U)定義為在:40 ℃，pH 8.0條件下，游離酶或固定化酶每分鐘催化底物水解產(chǎn)生1.0 μmol/LpNP 需要的酶量。

1.3.2 固定化脂肪酶的制備

準確稱取1 g MI-BSI 伯胺功能基酶載體樹脂，加入4 mL脂肪酶YS2071酶液(2 mg/mL)于具塞三角瓶中，一段時間后，加入4 mL交聯(lián)劑，在25 ℃，200 r/min搖床上振蕩搖勻，振蕩結(jié)束后，靜置，取出上清液，用緩沖液清洗樹脂，凍干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 固定化脂肪酶酶學性質(zhì)

根據(jù)響應面實驗確定的最優(yōu)條件，對脂肪酶YS2071進行固定化后，冷凍干燥，得到固定化酶備用。測定其性質(zhì)，分析固定化脂肪酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性，最適pH及pH穩(wěn)定性，金屬離子的影響，有機試劑的影響，儲存穩(wěn)定性和重復使用性。

1.3.3.1 最適溫度及熱穩(wěn)定性

將固定化酶和游離酶置于20、30、40、50、60、70 ℃的恒溫水浴鍋中測定酶活力，確定最適反應溫度。將固定化酶和游離酶置于不同溫度下處理2 h，取出測定酶活力，分析熱穩(wěn)定性。

1.3.3.2 最適pH及pH穩(wěn)定性

將固定化酶和游離酶置于pH 4、5、6、7、8、9、10、11、12的緩沖液配制的底物中測定酶活力，確定最適pH。將固定化酶和游離酶置于不同pH的緩沖液中處理2 h，取出測定酶活力，分析pH穩(wěn)定性。

1.3.3.3 金屬離子的影響

將固定化酶和游離酶置于5 mmol/L的Al3+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Ca2+、K+、Fe3+、Zn2+、Mn2+等9種金屬離子中處理2 h，取出測定酶活力，分析金屬離子對酶活力的影響。

1.3.3.4 有機溶劑的影響

將固定化酶和游離酶置于乙醇、正己烷、石油醚、叔丁醇、冰乙酸、乙酸乙酯及丙酮等7種有機溶液中處理2 h，取出測定酶活力，分析有機溶劑對酶活力的影響。

1.3.3.5 重復使用性

將固定化酶與底物在最適反應條件下催化反應，測定酶活力。反應結(jié)束后，將固定化酶從反應體系中分離出來，重復上述反應，總計10次。以首次測定的酶活力為100%，研究其重復使用性。

1.3.3.6 儲存穩(wěn)定性

將固定化酶與游離酶在4 ℃放置0、5、10、15、20、25、30 d，分別測定固定化酶和游離酶的酶活力。以首次測定的酶活力為100%，研究其儲存穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素法優(yōu)化固定化條件

2.1.1 加酶量對固定化脂肪酶酶活力的影響

考察不同的加酶量下，脂肪酶固定化效果。由圖1可知，隨著加酶量的增加，酶活力隨之增加，當加酶量達到一定程度，酶活力趨于平衡?？赡苁且驗檩d體的載酶量有限，當加酶量為80 mg時，載體承載酶的能力趨于飽和。酶活回收率隨著加酶量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，加酶量為8 mg時，酶活回收率最大，在63%以上。加酶量增加，但酶與載體的結(jié)合位點有限，大量的酶重疊，降低了酶與底物結(jié)合的能力，酶的回收率降低[9]。因此，選擇8 mg為最佳加酶量。

圖1 加酶量對酶活的影響Fig.1 Effects of amount of enzyme on relative activity of immobilized lipase

2.1.2 溫度對固定化脂肪酶酶活力的影響

酶是一種蛋白質(zhì)，溫度對酶的影響比較敏感[10]?？疾觳煌臏囟认?，脂肪酶固定化效果。由圖2可知，隨著溫度的升高，酶活先增加后降低，20 ℃酶活達到最高。因為酶吸附到載體上是一個吸熱過程，溫度太低，分子的熱運動較慢，不利于酶與載體的結(jié)合，酶的吸附率較低；溫度過高會導致部分酶的失活，吸附率下降。因此，選擇20 ℃為最佳固定化溫度。

圖2 溫度對酶活的影響Fig.2 Effects of temperature on relative activity of immobilized lipase

2.1.3 吸附時間對固定化脂肪酶酶活力的影響

吸附時間是影響固定化酶活和載體吸附蛋白量的重要因素之一?？疾觳煌奈綍r間，脂肪酶固定化效果。由圖3可知，2～8 h時，隨著時間的增加，酶活逐漸增加，8 h時酶活最大，可能是因為吸附時間較短，載體承載的酶量較少，傳質(zhì)的動力較大，吸附迅速[11]；8～16 h，隨著時間的增加，酶活逐漸降低，可能是長時間的吸附導致部分酶失活，并且載體的載酶量有限，吸附時間過長導致酶的空間增大，固定化酶的酶活位點被掩蓋，酶活降低。因此，選擇8 h為最佳吸附時間。

圖3 吸附時間對酶活的影響Fig.3 Effects of adsorption time on relative activity of immobilized lipase

2.1.4 pH對固定化脂肪酶酶活力的影響

在固定化過程中，緩沖液的pH會改變酶分子和孔壁表面的離子化狀態(tài)，影響酶與載體的結(jié)合程度，進而影響固定化酶的酶活力[12]?？疾觳煌木彌_液pH，脂肪酶固定化效果。由圖4可知，pH 9時，酶活最大?？赡苁沁^酸、過堿的環(huán)境會對部分酶的活性有一定的抑制作用，也可能是pH值影響酶分子周圍的微環(huán)境，在特定的pH環(huán)境下，酶分子的活性處于適合于載體結(jié)合的狀態(tài)，pH過高或過低，酶分子的活性處于不適合與載體結(jié)合的狀態(tài)。因此，選擇pH 9為最佳緩沖液的pH。

圖4 pH對酶活的影響Fig.4 Effects of pH on relative activity of immobilized lipase

2.1.5 交聯(lián)劑濃度對固定化脂肪酶酶活力的影響

京尼平作為一種生物交聯(lián)劑，可以連接酶和載體，增強固定化酶的機械強度，但也會對酶蛋白分子有一定的毒性，致使酶活力降低，其用量是影響固定化酶活力的重要因素之一[13]?？疾觳煌慕宦?lián)劑濃度，脂肪酶固定化效果。由圖5可知，交聯(lián)劑濃度在0.2～0.4 g/L時，相對酶活力隨著濃度的增加而增大，可能是因為交聯(lián)劑濃度較低，載體表面活性基團較少，不能將更多的載體與酶交聯(lián)，且酶易脫落，酶活力較低；交聯(lián)劑濃度在0.4～6 g/L時，相對酶活力隨著濃度的增加而減小，交聯(lián)劑濃度過高，可能會對酶分子以及載體產(chǎn)生毒害作用，酶活力降低。因此，選擇0.4 g/L為最佳交聯(lián)劑濃度。

圖5 交聯(lián)劑濃度對酶活的影響Fig.5 Effects of concentration of crosslinker on relative activity of immobilized lipase

2.1.6 交聯(lián)時間對固定化脂肪酶酶活力的影響

考察不同的交聯(lián)時間，脂肪酶固定化效果。由圖6可知，交聯(lián)時間對酶活的影響。0.5～1 h，隨著交聯(lián)時間的增加，酶活力增加，可能是交聯(lián)時間較短，交聯(lián)劑不能將較多的酶與載體結(jié)合，酶活力較低；1～4 h，隨著交聯(lián)時間的增加，酶活力降低，可能是交聯(lián)時間過長，降低酶分子的靈活性。因此，選擇1 h為最佳交聯(lián)時間。

圖6 交聯(lián)時間對酶活的影響Fig.6 Effects of crosslinking time on relative activity of immobilized lipase

2.2 響應面法優(yōu)化固定化條件

2.2.1 Plackett-Burman法篩選主要影響因子

對加酶量、吸附時間、吸附溫度、pH、交聯(lián)時間、交聯(lián)劑濃度等6個因素進行了優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，通過PB試驗篩選主要影響因子，設(shè)計見表1。

表1 試驗篩選主要影響因素的實驗設(shè)計及結(jié)果

由表2可以看出，吸附時間、pH、交聯(lián)劑濃度P<0.05，為顯著因素且3者的貢獻值之和為95.14%，因此3者是固定化條件中的主要影響因素。

表2 PB試驗設(shè)計分析

2.2.2 響應面法中心組合設(shè)計確定固定化最優(yōu)條件

根據(jù)PB試驗確定吸附時間、pH、交聯(lián)劑濃度為3個顯著影響因子，采用Box-Behnken設(shè)計原理，進行3因素3水平的響應面分析試驗，進一步探討3因素對固定化脂肪酶酶活力的影響，并確定最優(yōu)的固定化條件，每組做3次平行。中心組合試驗設(shè)計如表3。

表3 中心組合設(shè)計及結(jié)果

用Design-Expert V8.0.6 數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析，P值0.000 3<0.05，說明該模型是顯著的，失擬向P=0.117 2>0.05，表明該模型的失擬向不顯著。綜上，該模型能較好的解釋酶活力的變化，回歸方程對數(shù)據(jù)有較好的擬合，二次多項式回歸方程如下：

Y=885.85+21.66A+17.60B-16.04C-2.94AB+2.95AC+1.12BC-55.73A2-127.82B2-129.64C2

表4 響應面模型方差分析表

用Design-Expert V8.0.6 數(shù)據(jù)分析軟件進行分析，各因素的交互作用對固定化酶酶活力的影響如圖7所示。

圖7 響應面三維圖及等高線圖Fig.7 3D and contour plot of various factors

2.2.3 驗證試驗

對回歸方程求導得到極值點，理論吸附時間為8.19 h，pH為8.6，交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為0.48 g/L，酶活的響應值達到最大，其理論值為948.97 U/g。

為操作簡便，選定交聯(lián)時間8 h，pH為8.6，交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為0.48 g/L時，實際試驗結(jié)果的酶活為936.71 U/g，與理論值相符，證明該模型是可靠的，可以用于優(yōu)化脂肪酶的固定化條件。

2.3 固定化脂肪酶的酶學性質(zhì)

2.3.1 固定化酶和游離酶的最適溫度

將固定化酶和游離酶置于20～70 ℃的恒溫水浴鍋中測定酶活力，確定最適反應溫度。由圖8可以看出，固定化酶與游離酶的最適反應溫度均為40 ℃，說明固定化并沒有改變脂肪酶的適應范圍，但可以看出，隨著溫度的升高，固定化酶的酶活力高于游離酶的酶活力，酶的熱穩(wěn)定性有所提高。

圖8 固定化酶和游離酶的最適溫度Fig.8 The optimal temperature of immobilized lipase

2.3.2 固定化酶和游離酶的溫度穩(wěn)定性

將固定化酶和游離酶于20～70 ℃的恒溫水浴鍋中處理2 h，取出測定酶活力，分析熱穩(wěn)定性。由圖9可以看出，隨著溫度的增加，固定化酶與游離酶的熱穩(wěn)定性均呈現(xiàn)下降的趨勢，但在20～40 ℃，酶活力下降緩慢；40～70 ℃，酶活力明顯下降，固定化酶在70 ℃時，殘余酶活40%左右，而游離酶的殘余酶活僅為20%。說明固定化提高了酶的熱穩(wěn)定性，可能是因為酶與載體結(jié)合后，載體對酶分子起到了一定的保護作用，維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

圖9 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性Fig.9 The temperature stability of immobilized lipase

2.3.3 固定化酶和游離酶的最適pH

將固定化酶和游離酶置于pH 4～12下測定酶活力，確定最適反應pH。由圖10知，固定化酶和游離酶的最適pH均為9，隨著pH的增加，固定化酶和游離酶的酶活變化趨勢相同，固定化并沒有改變脂肪酶pH的適應范圍，但固定化后酶活力均高于游離酶的酶活力，說明固定化提高了脂肪酶對酸堿的耐受性。

2.3.4 固定化酶和游離酶的pH穩(wěn)定性

將固定化酶和游離酶置于pH 4～12下2 h后測定酶活力，確定pH穩(wěn)定性。由圖11可知，隨著pH的增加，固定化酶與游離酶的活力均先增加后減少，但pH 7～10時固定化酶與游離酶的穩(wěn)定性相差不大，pH 4～6、pH 11～12時，固定化酶的酶活力明顯高于游離酶的酶活力，說明固定化后，脂肪酶對酸和堿的耐受性增強。

圖11 固定化酶和游離酶的pH穩(wěn)定性Fig.11 The pH stability of immobilized lipase

2.3.5 金屬離子的影響

將固定化酶和游離酶置于5 mmol/L的9種金屬離子中處理2 h，取出測定酶活力，分析金屬離子對酶活力的影響。由圖12可知，金屬離子對固定化酶的影響較小，可能是固定化后，酶的空間更加穩(wěn)定。Al3+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+對酶活有抑制作用，Al3+、Cu2+的抑制作用較明顯。Mg2+、Ca2+、K+、Mn2+對酶活有促進作用，Ca2+、K+的促進作用較明顯。

圖12 金屬離子對酶活的影響Fig.12 Effects of metal ion on relative activity of immobilized lipase

2.3.6 有機溶劑的影響

將固定化酶和游離酶置于7種有機溶液中處理2 h，取出測定酶活力，分析有機溶劑對酶活的影響。由圖13可知，有機試劑對固定化酶的影響小于游離酶。乙酸、乙酸乙酯的影響較大，乙醇、叔丁醇、丙酮的影響較小，且叔丁醇的空間位阻大，不易與其他成分發(fā)生反應[14]，可以作為催化反應的溶劑，為脂肪酶的應用提供了思路。

圖13 有機溶劑對酶活的影響Fig.13 Effects of organic solvents on relative activity of immobilized lipase

2.3.7 重復使用性

將固定化酶與底物在最適反應條件下催化反應，測定酶活力，重復10次，分析固定化酶的重復使用性。由圖14可知，重復使用10次后，固定化酶的殘余酶活力仍保留在30%以上，固定化酶具有良好的操作性，可以進行下一步研究。

圖14 重復次數(shù)對酶活的影響Fig.14 Effects of repeat times on relative activity of immobilized lipase

2.3.8 儲存穩(wěn)定性

將固定化酶與游離酶在4 ℃放置0、5、10、15、20、25、30 d，分別測定酶活力，分析其儲存穩(wěn)定性。由圖15可知，隨著儲存時間的增加，固定化酶與游離酶的酶活力均下降，但固定化酶酶活力下降的趨勢更平緩。儲存30 d后，固定化酶的酶活仍在60%以上，而游離酶的酶酶活僅有30%左右，說明經(jīng)過固定化，脂肪酶YS2071的穩(wěn)定性能得到了提高。

圖15 儲存天數(shù)對酶活的影響Fig.15 Effects of storage days on relative activity of immobilized lipase

3 結(jié)論

通過吸附法和交聯(lián)法相結(jié)合的方法，將脂肪酶YS2071固定在MI-BSI伯胺功能基載體樹脂上，采用單因素法和響應面法對固定化條件進行優(yōu)化，并對酶學性質(zhì)進行研究，結(jié)論如下：

(1)通過單因素實驗、PB實驗和響應面實驗，對影響酶活的因素進行篩選，并確定最佳固定化條件：加酶量為8 mg，吸附時間8 h，吸附溫度為20 ℃，初始pH 8.6，交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為0.48 g/L，交聯(lián)時間為1 h時，固定化效率最高，最大酶活可達到936.71 U/g，酶活回收率達到60%以上。

(2)對固定化酶酶學性質(zhì)進行研究，與游離酶相比，固定化酶的最適溫度和最適pH均沒有改變，但熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性均有明顯的提高，固定化酶使用10次后，相對酶活仍在30%以上。儲存30 d，相對酶活在60%以上。說明脂肪酶YS2071經(jīng)固定化后，具有良好的操作性，可進一步進行應用研究。

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The immobilization and enzymatic properties of lipase YS2071

JIANG Jun-ying1,2,MA Zi-bin1,SUN Jing-jing1,HAO Jian-hua1, LIU Jun-zhong1,WANG Yue-jun1,SUN Mi1*

1(Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts of Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China)2(College of Food Sciences & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Free lipase is difficult to achieve continuous operation. In order to improve the efficiency of lipase and apply it to the industrialized production, the technology of immobilized lipase YS2071 was studied by screening the optimal carrier and using single factor experiment method to optimize lipase immobilized conditions. Using MI-BSI resin as carrier and genipin as cross-linking agent, adsorption-crosslinking method was employed to maintain relative high enzyme activity. Immobilized conditions were studied by using PB experiment and the response surface design. The optimal conditions of immobilized lipase YS2071 were as followes: the enzyme dosage was 8 mg, the adsorption time was 8 h, the adsorption temperature was 20 ℃, the initial pH was 8.6, the concentration of genipin was 0.48 g/L, the crosslinking time was 1 h. Under these conditions, the recovery rate of immobilized enzyme was up to 60%.

lipase; immobilization; enzymatic properties

碩士研究生(孫謐為通訊作者,E-mail: sunmi@ysfri.ac.cn)。

NSFC-山東聯(lián)合資助海洋研究中心項目(U1406402-5)；國際科技合作與交流專項 (2014DFG30890)；國家實驗室-鰲山科技計劃(2015ASKJ02-06)；國家863計劃(2014AA093516)

2016-12-12，改回日期：2017-03-01

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706007