辛伐他汀對(duì)膿毒癥小鼠肺損傷的保護(hù)作用

楊文萍，孔冰冰，趙 欣，張 榮，王 煜

·論著·

辛伐他汀對(duì)膿毒癥小鼠肺損傷的保護(hù)作用

楊文萍，孔冰冰，趙 欣，張 榮，王 煜*

目的 觀察辛伐他丁對(duì)膿毒癥小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制。方法 采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備膿毒癥小鼠模型，將72只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組、膿毒癥急性肺損傷組(膿毒癥組)、膿毒癥+辛伐他汀治療組(治療組)。治療組給予辛伐他汀0.2 μg/g，q12h腹腔注射1周；假手術(shù)組、膿毒癥組給予等量安慰劑腹腔注射1周。分別于造模后6、12、24 h留取肺臟標(biāo)本。HE 染色觀察肺組織病理學(xué)變化，免疫組化檢測(cè)肺組織toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)蛋白的表達(dá)，ELISA測(cè)定肺組織勻漿中IL-1β及TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，造模后6、12、24 h，膿毒癥組肺組織病理學(xué)評(píng)分、肺組織TLR4蛋白的表達(dá)，以及TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P<0.05)；與膿毒癥組相比，治療組上述指標(biāo)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 辛伐他汀通過抑制TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,減少其下游炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β的釋放,對(duì)膿毒癥導(dǎo)致的急性肺損傷具有一定保護(hù)作用。

辛伐他??；膿毒癥；toll樣受體4；TNF-α；IL-1β；急性肺損傷

0 引言

膿毒癥是宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能不全，是重癥監(jiān)護(hù)病房的主要死因。肺臟是膿毒癥時(shí)最易受損傷的靶器官，急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)出現(xiàn)最早，且發(fā)生率最高[1]。Toll-like receptor 4(TLR4)在膿毒癥所致肺損傷的病情發(fā)展中發(fā)揮重要作用，敲除TLR4基因或者靶向抑制TLR4的表達(dá)可以顯著減輕ALI的程度[2-4]。近年研究表明，他汀類藥物即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，具有獨(dú)立于降血脂作用之外的抗炎、免疫調(diào)節(jié)、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞等多效性。本研究采用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)(Cecal ligation and puncture，CLP)法復(fù)制膿毒癥大鼠模型，給予藥物辛伐他汀干預(yù)，探討辛伐他汀對(duì)膿毒癥急性肺損傷的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑 健康SPF級(jí)C57BL/6成年雄性小鼠，體重：25～35 g。小鼠由我院本溪基地動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物檢疫合格證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。所有實(shí)驗(yàn)通過我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)：2015PS251K)。TLR4 Antibody購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司，羊抗鼠免疫組化二抗試劑盒SP9002購(gòu)自北京中杉金橋公生物技術(shù)公司，TNF-α 和IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司。

1.2 小鼠膿毒癥模型的制備 采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備模型[5]。小鼠經(jīng)5%水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，采取前腹正中切口，沿前腹正中線作3 cm長(zhǎng)的切口，從腹腔中取出盲腸,用5～0縫線結(jié)扎盲腸的50%(從盲腸游離端到結(jié)扎位置占盲腸全長(zhǎng)的50%)。在盲端與結(jié)扎處的中點(diǎn)處，用18號(hào)針頭由腸系膜側(cè)無血管處向非腸系膜側(cè)貫穿盲腸，避開盲腸血管。從穿孔的兩端分別擠出少量糞便，然后將盲腸回納入腹腔，逐層關(guān)腹。假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)小鼠跳過盲腸結(jié)扎穿孔步驟，其他步驟與膿毒癥組相同。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 將C57BL/6成年雄性小鼠72只隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、膿毒癥急性肺損傷組(膿毒癥組)、膿毒癥+辛伐他汀治療組(治療組)，每組24只。分別于造模前1周開始進(jìn)行預(yù)處理：治療組給予辛伐他汀0.2 μg/g，間隔12 h，腹腔注射，共1周；假手術(shù)組、膿毒癥組給予等量安慰劑0.02 mL/g，間隔12 h，腹腔注射，共1周。分別于造模后的6、12、24 h進(jìn)行取材。

1.4 肺組織病理學(xué)觀察 4%多聚甲醛固定小鼠肺組織，切割至厚度約0.5 cm組織塊，常規(guī)組織梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、連續(xù)切片，行 HE 染色。光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。綜合肺泡水腫、間質(zhì)水腫、肺泡內(nèi)白細(xì)胞聚集數(shù)量、出血和肺泡壁厚度等采用肺損傷評(píng)分法評(píng)價(jià)肺損傷程度[6]。

1.5 肺組織TLR4蛋白的表達(dá) 肺組織TLR4蛋白檢測(cè)采用SP法。石蠟包埋肺組織切成3.5 u切片，常規(guī)脫蠟，PBS漂洗，3%過氧化氫去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。胰蛋白酶修復(fù)后，正常兔血清封閉非特異性抗原，滴加1∶500羊抗小鼠TLR4 抗體，4 ℃過夜。PBS漂洗后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗，37 ℃溫孵育30 min，PBS漂洗后DAB顯色蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。陽(yáng)性結(jié)果為呈環(huán)狀分布的棕黃色或棕褐色顆粒，通過NIS-ElementSF 2.30圖像采集軟件進(jìn)行圖像采集,應(yīng)用image-pro-plus軟件測(cè)出陽(yáng)性部分平均光密度值(OD值)。

1.6 ELISA法測(cè)定肺組織TNF-α 和IL-1β 肺組織放入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(pH 7.4，0.01 mol/L，Tris-HCL 0.000 1 mol/L EDTA-2Na,0.01 mol/L蔗糖，0.8%氯化鈉溶液)中研磨，4 ℃環(huán)境下制備肺組織勻漿。ELISA試劑盒測(cè)定小鼠肺組織TNF-α 和IL-1β含量，嚴(yán)格按使用說明書步驟進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下肺組織病理變化 假手術(shù)組小鼠肺臟無炎癥損害改變；膿毒癥組鏡下肺間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為主，支氣管周圍可見淋巴細(xì)胞團(tuán)分布，彌漫的支氣管及肺泡擴(kuò)張，肺泡相互融合。肺臟病理?yè)p害呈時(shí)間依賴性，其中以24 h肺臟損害最為明顯；辛伐他汀治療組可見淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，淋巴細(xì)胞團(tuán)減少，甚至局部消失，支氣管及肺泡擴(kuò)張較前明顯減輕，肺泡融合減少。見圖1。與假手術(shù)組比，膿毒癥組6 h、12 h和 24 h肺組織病理評(píng)分明顯增高(P<0.05)；治療組各時(shí)間點(diǎn)肺組織評(píng)分均較同期膿毒癥組明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 三組小鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織病理學(xué)評(píng)分比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與膿毒癥組比較，#P<0.05

2.2 肺組織TLR4蛋白的表達(dá)情況 TLR4為炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要介質(zhì)，主要表達(dá)于肺泡細(xì)胞膜上，鏡下觀察陽(yáng)性表達(dá)為棕色環(huán)形沉著顆粒，藍(lán)色為蘇木素染色的細(xì)胞核。鏡下可見假手術(shù)組無棕色顆粒沉著，TLR4表達(dá)不明顯；膿毒癥組肺泡細(xì)胞膜棕色顆粒廣泛均勻增多，且呈時(shí)間依賴性；治療組鏡下可見棕色顆粒明顯減少。與假手術(shù)組比，膿毒癥組6 h、12 h、24 h OD值均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與膿毒癥比，治療組12 h、24 h OD值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2和表2。

圖1 三組小鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織病理學(xué)變化(400×)

注：A.假手術(shù)組6 h;B.假手術(shù)組12 h;C.假手術(shù)組24 h;D.膿毒癥組6 h;E.膿毒癥組12 h;F.膿毒癥組24 h;G.治療組6 h;H.治療組12 h;I.治療組24 h。肺HE染色顯示，肺間質(zhì)有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),廣泛的支氣管和肺泡擴(kuò)張；任何時(shí)間點(diǎn)治療組的肺損傷均較膿毒癥組減輕

圖2 三組小鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織TLR4蛋白的表達(dá)(400×)

注：A.假手術(shù)組6 h;B.假手術(shù)組12 h;C.假手術(shù)組24 h;D.膿毒癥組6 h;E.膿毒癥組12 h;F.膿毒癥組24 h;G.治療組6 h;H.治療組12 h;I.治療組24 h。免疫組化染色顯示，任何時(shí)間點(diǎn)膿毒癥組肺組織TLR4 蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組,假手術(shù)組的TLR4 蛋白表達(dá)均低于其他兩組

表2 小鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)水平的OD值(n=7)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與膿毒癥組比較，#P<0.05

2.3 肺組織TNF-α水平 與假手術(shù)組比較，膿毒癥組6、12、24 h肺組織TNF-α水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以膿毒癥組12 h TNF-α 水平升高最顯著；辛伐他丁治療組各時(shí)點(diǎn)肺組織TNF-α水平較同期膿毒癥組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 小鼠肺組織TNF-α表達(dá)水平(pg/mL，n=7)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與膿毒癥組比較，#P<0.05

2.4 肺組織IL-1β水平 與假手術(shù)組比較，膿毒癥組6 h、12 h、24 h肺組織IL-1β水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以膿毒癥組12 h IL-1β 水平升高最顯著；辛伐他丁治療組各時(shí)點(diǎn)肺組織IL-1β水平較同期膿毒癥組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 小鼠肺組織IL-1β表達(dá)水平(ng/mL,n=7)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與膿毒癥組比較，#P<0.05

3 討論

膿毒癥導(dǎo)致的急性肺損傷在臨床中有很高的發(fā)生率和病死率，在抗感染治療基礎(chǔ)上，有效防治感染繼發(fā)的肺損傷是降低膿毒癥病死率的重要手段。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥導(dǎo)致的肺臟病理?yè)p害主要為炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、淋巴細(xì)胞團(tuán)的形成、肺泡及支氣管的擴(kuò)張、肺泡相互融合等一系列炎癥反應(yīng)[7]。

Toll樣受體家族是一類固有免疫受體，分布十分廣泛，在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞中具有很高的表達(dá)。其中，TLR4是toll樣受體家族中的重要成員之一，屬于Ⅰ類跨膜受體，分子結(jié)構(gòu)由細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)組成。TLR4的細(xì)胞外區(qū)是識(shí)別脂多糖的重要結(jié)構(gòu)，經(jīng)過跨膜區(qū)及細(xì)胞內(nèi)區(qū)將信息整合導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)區(qū)域發(fā)生聚合活化反應(yīng)，引起細(xì)胞內(nèi)廣泛的信號(hào)傳導(dǎo)，使NF-κB以二聚體的活化形式轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并與編碼TNF-α及IL-1β基因的順式元件結(jié)合，參與這些促炎因子基因的表達(dá)和調(diào)控[8]。膿毒癥引起急性肺損傷的一系列過度炎癥反應(yīng)也正是通過TLR4通路的作用使肺泡巨噬細(xì)胞呈瀑布樣釋放TNF-α、IL-1β等促炎因子，最終導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征[9-10]。TNF-α 是膿毒癥最早產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子，可以激活肺組織中的中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板，進(jìn)一步誘導(dǎo)氧自由基、其他炎性因子及溶酶體酶的產(chǎn)生和釋放，發(fā)揮“級(jí)聯(lián)放大”的作用，直接損害肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ型細(xì)胞，從而加重肺組織的損傷。炎癥反應(yīng)過程中TNF-α是始動(dòng)因素，IL-1β起協(xié)同作用[11]。IL-1β不能直接活化炎性白細(xì)胞，但可以引起IL-8的分泌，通過改變前炎癥介質(zhì)或抗炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和影響組織多形核中性粒細(xì)胞聚集而促進(jìn)炎癥的發(fā)展[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠6 h即出現(xiàn)肺組織TNF-α、IL-1β升高，12 h 達(dá)高峰，24 h稍下降。而辛伐他汀治療組各時(shí)點(diǎn)肺組織TNF-α、IL-1β表達(dá)明顯下降。膿毒癥組鏡下肺間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為主，彌漫的支氣管及肺泡擴(kuò)張，肺泡相互融合；辛伐他汀治療組肺組織病理?yè)p傷明顯減輕。辛伐他汀的作用機(jī)制可能是其抑制了膿毒癥小鼠肺組織TLR4信號(hào)的激活,并由此減少了該信號(hào)通路下游炎癥因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生,能部分改善膿毒癥所致的肺損傷。辛伐他汀是一種多靶點(diǎn)的肺損傷保護(hù)藥物,有望為膿毒癥的治療提供新的靶點(diǎn)。

[1] Ornellas DS，Maron-Gutierrez T，Ornellas FM，et al.Early and late effects of bone marrow-derived mononuclear cell therapy on lung and distal organs in experimental sepsis[J].Respir Physiol Neurobiol，2011，178 (2)：304-314.

[2] Tauseef M,Knezevic N,Chava KR,et al.TLR4 activation of TRPC-6-dependent calcium signaling mediates endotoxin-induced lung vascular permeability and inflammation[J].J Exp Med,2012,209(11):1953-1968.

[3] He Z,Chen X,Wang S,et al.Toll-like receptor 4 monoclonal antibody attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice[J].Exp Ther Med,2014,8(3):871-876.

[4] Deng Y,Yng Z,Gao Y,et al.Toll-like receptor 4 mediates acute lung injury induced by high mobility group box-1[J].PloS One,2013,8(5):e64375.

[5] Rittirsch D,Huber-Lang MS,Flierl MA,et al.Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture[J].Nat Protoc,2009,4(1):31-36.

[6] Mikawa K，Nishilla K，Takao Y，et al.0NO-1714，a nitric oxide synthase inhibitor，attenuates endotoxin-induced acute lung injury in rabbits[J].Anesth Analg，2003，97(6)：1751-1755.

[7] Tasaka S，Koh H，Yamada W，et al.Attenuation of endotoxin-induced acute lung injury by the Rho-associated kinase inhibitorY-27632[J] .Am J Respir Cell Mol Biol，2005，32(6)：504-510.

[8] 付朝暉，姚尚龍，袁世熒.鹽酸戊乙奎醚對(duì)膿毒癥致大鼠急性肺損傷時(shí)Toll樣受體4及NT-κB表達(dá)的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2013，33(9):1134-1137.

[9] 石計(jì)朋，黃麗密，錢燕，等.橄欖油脂肪乳對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷SD幼年大鼠前炎癥因子TNF-α IL-1β、IL-6的影響[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，21(3):275-277.

[10]岳穩(wěn)娜.Toll樣受體與呼吸道感染性疾病的研究進(jìn)展[J].國(guó)際兒科學(xué)雜志，2016,43(8):618-621.

[11]Levi M.The coagulant response in sepsis and inflammation[J].Ham ostaseologie，2010，30(1)：10-12.

[12]Kim GP,Roh SI,Park SK.Alleviation of experimental spectic shock in mice by acidic polysaccharide isolated from the medicinal mushroom Phellinus Linteus[J].Biol Pharm Bull,2003,26(1q):1418-1423.

Protective effects of simvastatin on lung injury of sepsis mice

YANG Wen-ping,KONG Bing-bing,ZHAO Xin,ZHANG Rong,WANG Yu*

(Emergency Department,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To explore the protective effect of simvastatin on sepsis-induced lung injury of mice and its possible mechanisms.Methods Totally 72 male C57BL/6 rats were randomly divided into sham group,sepsis group of acute lung injury(sepsis group) and cecal ligation and puncture operation (CLP)+ simvastatin (treatment group).Rat sepsis model was established by CLP.The mice in treatment group were intraperitoneally injected with simvastatin (0.2 μg/g,once per 12 hours) for a week;mice in sham group and sepsis group were given equal volume of placebo.The lung tissue specimens were gathered at 6,12 and 24 h after operation.Pathological changes of lung tissue were observed by HE staining;the contents of lung TNF-α and IL-1β were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA);the expression of TLR4 protein in lung tissues were detected by immunohistochemical method.Results The pathological scores of lung tissue,the expression of TLR4 protein and the levels of TNF-α and IL-1β in sepsis group were higher than those of sham group (P<0.05),and the above indexes in treatment group were lower than those of sepsis(P<0.05).Conclusion Simvastatin has certain protective effect on lung injury caused by sepsis.The effect may be mediated by the inhibition of TLR4 signal pathway by simvastatin and the consequent decrease of the generation of downstream inflammatory factors,such as TNF-αand IL-1β.

Simvastatin；Sepsis；Toll-like receptor 4；TNF-α;IL-1β；Acute lung injury

2017-03-14

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科, 沈陽(yáng) 110004

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015020527)

10.14053/j.cnki.ppcr.201707001

*通信作者