巢脾多糖脫蛋白工藝優(yōu)化及其對油脂抗氧化活性的研究

殷 玲,吉 挺,張煥新,李冠華,戰(zhàn)旭梅

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院,江蘇泰州 225300;2.揚州大學 動物科學與技術學院,江蘇揚州225009)

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巢脾多糖脫蛋白工藝優(yōu)化及其對油脂抗氧化活性的研究

殷 玲1,吉 挺2,張煥新1,李冠華1,戰(zhàn)旭梅1

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院,江蘇泰州 225300;2.揚州大學 動物科學與技術學院,江蘇揚州225009)

本實驗旨在對蜜蜂巢脾多糖(HCP)脫蛋白工藝進行優(yōu)化,并分析其對食用油脂抗氧化作用,為HCP的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。以蛋白脫除率和多糖損失率為指標,比較Sevage法、酶法和酶法-Sevage法對蜜蜂巢脾粗多糖中的蛋白脫除效果,并通過正交實驗優(yōu)化工藝。結果表明酶-Sevage法脫蛋白效果優(yōu)于其它脫除方法,最優(yōu)工藝參數(shù)為:木瓜蛋白酶添加量為2%,酶解溫度為60 ℃,酶解時間為3 h,聯(lián)用Sevage法脫蛋白2次,蛋白脫除率可達90.60%,多糖損失率20.36%。以過氧化值為指標,采用Schaal烘箱法分析HCP在菜籽油、大豆油、豬油體系中的抗氧化活性,研究結果表明:HCP在菜籽油及大豆油中抗氧化效果不明顯,而在豬油中表現(xiàn)出較好的抗氧化效果,HCP添加量達到0.08% 時,POV值比空白對照組降低了17.14 meg/g。

巢脾,多糖,脫蛋白,食用油脂,抗氧化活性

巢脾是蜜蜂生活和繁衍的場所,因此留有大量幼蟲的繭衣,花粉,蜂蜜,蜂王漿,蜂膠及其分泌物,分析發(fā)現(xiàn)蜜蜂巢脾含有大量的生物活性成分如多糖、生物堿、鞣質、有機酸、昆蟲激素以及苷類等[1-3]。作為動物中藥,蜜蜂巢脾具有抗癌抑菌殺菌,殺蟲攻毒,祛風鎮(zhèn)痛,降血壓,降血脂,抗氧化(清除自由基)等多種生物學及藥理學價值[4]。近年來,隨著人們對天然多糖研究的深入,天然多糖所具有的調節(jié)人體免疫、抗氧化、抗腫瘤、降低固醇等各種生理功能逐漸為人們所重視,多糖已經(jīng)開始在食品、藥物、功能性保健品以及化妝品等領域進行開發(fā)應用[5-6]。蜜蜂巢脾多糖(HCP)是蜜蜂巢脾中的主要功效成分,有著重要的開發(fā)價值和廣闊的應用空間,而目前對于巢脾多糖的提取純化及開發(fā)應用仍處于空白。本實驗對木瓜蛋白酶除蛋白工藝進行優(yōu)化,確定蜜蜂巢脾多糖脫蛋白的最佳條件,同時使用烘箱自氧化法研究蜜蜂巢脾多糖對食用油脂抗氧化性能,為提高巢脾多糖純度,進一步研究蜜蜂巢脾多糖的生物活性及開發(fā)應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

意大利蜜蜂老巢脾 購自揚州大學實驗蜂場;食品級木瓜蛋白酶(120 萬U/g);牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍、葡萄糖、正丁醇、氯仿、無水乙醇、硫酸、苯酚、硫代硫酸鈉、抗壞血酸、叔丁基對苯二酚,以上試劑均為分析純;菜籽油、大豆油、豬油(新鮮豬板油熬制而成)。

臺式低速大容量離心機-TD5A-WS 金壇市津南儀器制造有限公司;旋轉蒸發(fā)器RE-52D 上海青浦滬西儀器廠;手提式高速中藥粉碎機DFF-100 上海新諾儀器設備有限公司;紫外可見分光光度計-754 上海菁華科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 巢脾多糖的提取 選用3年以上意大利蜜蜂老巢脾,粉碎過篩后加水加熱30 min后用紗布擠干,殘渣重復提取2次,合并濾液,旋轉蒸發(fā)濃縮。冷卻后加入無水乙醇靜置沉淀離心,棄上清后烘干即可獲得巢脾粗多糖。

1.2.2 多糖含量的測定方法 采用硫酸苯酚法[7],以葡萄糖做標準曲線。多糖損失率的計算按以下公式計算:

多糖損失率(%)=(C1-C2)/C1×100

式(1)

式中:C1為脫蛋白前多糖溶液濃度,C2為脫蛋白后多糖溶液濃度。

1.2.3 蛋白質含量的測定 以牛血清白蛋白為對照品,采用考馬斯亮藍 G-250法[8]測定蛋白質含量。蛋白質脫除率按以下公式進行計算:

蛋白質脫除率(%)=(A1-A2)/A1×100

式(2)

式中:A1為脫蛋白前溶液蛋白濃度,A2為脫蛋白后溶液蛋白濃度。

1.2.4 巢脾多糖蛋白去除綜合評分 綜合評分按以下公式計算:

式(3)

式中:C1為脫蛋白前多糖溶液濃度,C2為脫蛋白后多糖溶液濃度。

1.2.5 Sevage法 取1 g/100 mL粗多糖溶液50 mL,加入其體積1/4的Sevage試劑(V正丁醇∶V氯仿=1∶4),劇烈振搖20 min,4000 r/min離心,取上清液,得1 次脫蛋白多糖溶液,按上述步驟分別處理2～6次,測定不同處理次數(shù)蛋白去除率和多糖損失率[8]。

1.2.6 木瓜蛋白酶法單因素及正交實驗 木瓜蛋白酶酶法的單因素條件為:固定酶解溫度為50 ℃,酶解時間為3 h,木瓜蛋白酶的添加量分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%;固定木瓜蛋白酶的添加量為2%,酶解時間為3 h,當解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃;固定木瓜蛋白酶的添加量為2%,酶解溫度為50 ℃,酶解時間分別為1、2、3、4、5 h。

在單因素實驗的基礎上,以A蛋白酶用量、B酶解時間、C酶解溫度為主要因素,以蛋白質脫除率和多糖損失率為指標,采用L9(34)表進行正交實驗,對聯(lián)合脫蛋白法的條件進行優(yōu)化,具體因素及水平見表1。

表1 酶法脫蛋白的正交設計Table 1 Orthogonal design for enzyme method deproteinization

1.2.7 酶法-Sevage法 按照酶法脫蛋白質的最佳條件,對巢脾粗多糖進行除蛋白,將多糖溶液90 ℃水浴4 min,滅酶后按“1.2.5”進行Sevage法處理。

1.2.8 HCP對食用油脂抗氧化作用的測定 油脂氧化實驗采用Schaal烘箱法[9],按照食用油脂質量的0.02%、0.04%、0.08%分別加入HCP到50 g油脂中,0.02%的茶多酚(PG)及0.02%叔丁基對苯二酚(TBHQ)做陽性對照,純油樣作為空白對照,置于65 ℃烘箱中,定時(0、4、8、12、16 d)檢測每份油樣中的過氧化值(POV)。油脂POV測定具體方法參照GB/T 5009.37-2003[10]。

2 結果與分析

2.1 Sevage法脫蛋白次數(shù)對巢脾多糖脫蛋白效果的影響

由圖1可知,隨著操作次數(shù)的增加,蛋白質脫除率也逐漸上升,4次后,蛋白質脫除率即可達到70%以上,但操作次數(shù)的增加也會導致多糖的損失,在4次脫蛋白后蛋白質的去除呈上升趨緩,但多糖損失率逐漸上升,綜合考慮,Sevage處理4次脫蛋白時效果最佳,此時蛋白脫除率為70.84%,多糖損失率為33.52%。

圖1 Sevage法脫蛋白次數(shù)對巢脾多糖脫蛋白的影響Fig.1 Effect of Sevage deproteinization times on protein removal and polysaccharide loss

表2 酶法脫蛋白正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test for enzyme method deproteinization

2.2 酶解法脫蛋白的單因素實驗結果

2.2.1 酶解溫度對巢脾多糖中脫蛋白效果的影響 由圖2可知,酶解溫度范圍在 50～60 ℃時蛋白質脫除率比較高;溫度高于50 ℃時,蛋白去除率下降,當溫度為50 ℃時對巢脾多糖中脫蛋白去除率最佳。此時蛋白脫除率為76.96%,多糖損失率為24.96%。

圖2 酶解溫度對巢脾多糖蛋白脫除的影響Fig.2 Effect of different enzymolysis temperature on protein removal and polysaccharide loss

2.2.2 酶解時間對巢脾多糖中脫蛋白的影響 由圖3可知,酶解3 h后蛋白去除率出現(xiàn)下降趨勢,多糖損失率也同時趨緩。可能源于底物濃度的降低導致了酶解效率的降低。綜合去除率和多糖損失率考慮,酶解時間在3 h去蛋白效果最好,此時蛋白去除率為77.39%,多糖損失率為24.31%。

圖3 酶解時間對巢脾多糖蛋白脫除的影響Fig.3 Effect of different enzymolysis time on protein removal and polysaccharide loss

2.2.3 木瓜蛋白酶添加量對巢脾多糖中脫蛋白的影響 由圖4可知,蛋白質脫除率隨酶添加量的增加而不斷增大,多糖損失率也隨木瓜蛋白酶添加量增加略微上升,酶的添加量在2%時蛋白去除效果最好,此時蛋白去除率為79.11%,多糖損失率為19.13%。

圖4 酶添加量對巢脾多糖蛋白脫除的影響Fig.4 Effect of different enzymolysis addition on protein removal and polysaccharide loss

2.3 正交設計實驗結果與分析

根據(jù)單因素實驗確定的實驗因素及水平,以蛋白去除率及多糖損失率平均值作為評分標準,以蛋白酶的用量(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)為3個因素,選取3個適宜的水平,選L9(34)表進行正交實驗,實驗結果如表2所示。

由表2可知,3個因素對蜜蜂巢脾多糖木瓜蛋白酶脫蛋白效果影響程度大小為A>B>C,即木瓜蛋白酶的添加量對脫蛋白效果影響最大,其次是酶解溫度然后是酶解時間。最佳除蛋白工藝為:A2B3C3,即木瓜蛋白酶添加量為2%,酶解溫度為60 ℃,酶解時間為3 h,經(jīng)驗證,此條件下的蛋白去除率和多糖損失率分別為85.10%和28.16%。

2.4 酶法-Sevage法脫蛋白

由圖5可知,使用上述酶法最優(yōu)條件處理粗多糖溶液后,接著Sevage法脫蛋白 2 次,蛋白脫除率達到最高,但再增加處理次數(shù)脫蛋白率沒有明顯的增加,多糖損失率卻明顯增高。故確定酶-Sevage聯(lián)合法的最佳工藝為酶用量2%,時間3 h,溫度60 ℃,聯(lián)用Sevage法處理2次,蛋白脫除率可達到90.60%,多糖損失率20.36%。與Sevage的蛋白去除率和多糖損失率70.84%和33.52%、酶法的蛋白去除率和多糖損失率85.10%和28.16%對比,木瓜蛋白酶-Sevage法脫除巢脾多糖蛋白效果明顯優(yōu)于單一的脫蛋白方法。

圖5 Sevage脫蛋白次數(shù)對酶-Sevage法脫蛋白的效果的影響Fig.5 Effect of Sevage deproteinization times on protein removal and polysaccharide loss by enzyme-Sevage method

2.5 HCP對食用油脂的抗氧化作用

2.5.1 HCP對菜籽油過氧化值(POV)的影響 HCP對菜籽油過氧化值(POV)影響的測定結果如圖6所示?？傮w而言,HCP對于菜籽油的POV影響較小,在第16 d時,HCP組的菜籽油PVO略低于空白組,而遠高于PG及TBHQ組。說明HCP對于菜籽油的抗氧化作用較小。

圖6 HCP對菜籽油過氧化值(POV)的影響Fig.6 Effect of different doses of HCP on POV value of rapeseed oil

2.5.2 HCP對大豆油過氧化值(POV)的影響 HCP對大豆油過氧化值(POV)影響的測定結果如圖7所示。HCP對于大豆油的POV影響呈現(xiàn)出一定的量效關系,隨著添加量的增加,其POV越小,但總體而言,影響較小,在第16 d時,HCP組的大豆油PVO顯著低于空白組,但同樣遠高于PG組及TBHQ組。說明HCP對于大豆油的抗氧化效果不明顯。

圖7 HCP對大豆油過氧化值(POV)的影響Fig.7 Effect of different doses of HCP on POV value of soybean oil

2.5.3 HCP對豬油過氧化值(POV)的影響 HCP對豬油過氧化值(POV)影響的測定結果如圖8所示。第8 d時,各組豬油POV基本接近,8 d后空白組POV隨時間增加明顯且高于其它各組的試樣,對于HCP組,隨著HCP添加量的增加,對豬油的氧化抑制效果越顯著,添加量達到0.08%時,其抗氧化效果與PG接近,POV比空白對照組降低了17.14 meg/g,但弱于TBHQ,說明HCP對動物油脂具有良好的抗氧化效果。

圖8 HCP對豬油過氧化值(POV)的影響Fig.8 Effect of different doses of HCP on POV value of lard oil

3 結論

在我國傳統(tǒng)醫(yī)學中,蜜蜂巢脾常被用來作為治療鼻炎、乙型肝炎、痛疽腫毒等許多種疾病的配伍之用[2]。我國是養(yǎng)蜂大國,蜂群飼養(yǎng)量已超過750萬群,每年淘汰的蜂巢數(shù)量十分可觀,但從目前來看,巢脾單一作為藥制品、生物制品、食品等的開發(fā)不多。蜂巢基本僅限于臨床配伍和提取蜂蠟之用,大多用于蜂蠟提取,大量的其它有效成分如生物堿、酶類、多糖、甙類等被丟棄。究其原因,蜂巢脾化學組成復雜、主要功效成分不明晰是限制蜜蜂巢脾開發(fā)利用的主要原因之一。本實驗對蜂巢有效成份之一巢脾多糖的純化及其對食用油脂的抗氧化活性進行了研究,為蜂巢的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)基礎。通過單因素和正交實驗確定了HCP除蛋白的木瓜蛋白酶-Sevage法最優(yōu)工藝條件:酶用量2%,時間3 h,溫度60 ℃,聯(lián)用Sevage法處理2次,蛋白脫除率可達到90.60%,多糖損失率20.36%。此法既充分發(fā)揮酶法可保持多糖活性的優(yōu)點,又可減少Sevage法的使用次數(shù),從而規(guī)避了傳統(tǒng)Sevage法多糖損失率高、化學試劑殘留高的缺點[9],同時大大提高了除蛋白的效率,對于蜜蜂巢脾多糖的純化較為適用。對食用油脂的抗氧化活性檢測結果顯示HCP對大豆油和菜籽油的抗氧化活性較低,而對豬油有較好的抗氧化活性,高劑量下抗氧化效果接近于茶多酚,而蜂巢原料成本遠低于茶多酚,提示HCP可作為一種新型天然食品抗氧化劑,在肉品保鮮應用上具有較好的開發(fā)前景。

[1]匡邦玉,匡海鷗. 蜜蜂生物學[M]. 昆明:云南科學技術出版社,2003:140-141.

[2]褚亞芳. 蜜蜂巢脾抗氧化、抑菌和抗炎活性以及抗生素殘留研究[D]. 杭州:浙江大學,2010.

[3]趙紅霞,黃文忠,陳華生,等. 蜜蜂巢脾提取物對小鼠免疫調節(jié)作用的影響[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2016,28(1):125-130.

[4]國家藥典委員會,中國藥典[M]. 北京:化學工業(yè)出版社,2005.

[5]Fang J,Wang Y,LV X,et al. Structure ofβ-glucan from Grifola frondosa and its antitumor effect by activating Dectin-1/Syk/NF-KB signaling[J]. Glycoconiugatce J,2012,29(5-6):365-377.

[6]張淑杰,康玉凡. 近5年天然活性多糖國內(nèi)外研究進展[J/OL]. 食品工業(yè)科技,http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20160926.0910.036.htm

[7]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. NY/T1676-2008食用菌中粗多糖的測定[S]. 北京:中國標準出版社,2008.

[8]伍善廣,賴泰君,孫建華,等. 蠶蛹多糖脫蛋白方法研究[J].食品科學,2011,32(14):21-24.

[9]American Oil Chemists’ Society. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society[M].4th ed. Chicago:AOCS,1989:8-53.

[10]中華人民共和國衛(wèi)生部,中國國家標準化管理委員會. GB/T 5009.37-2003食用植物油衛(wèi)生標準的分析方法[S]. 北京:中國標準出版社,2003.

Optimization of deproteinized technology and anti-lipidperoxidation activity of polysaccharide from honeybee comb

YIN Ling1,JI Ting2,ZHANG Huan-xin1,LI Guan-hua1,ZHAN Xu-mei1

(1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College,Taizhou 225300,China;2 College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)

In order to provide theory base for further development of honeybee comb polysaccharide(HCP),the process of deproteinization from HCP was optimized,and the antioxidant activity on edible fats was investigated. The efficiency of deproteinization with different methods such as Sevage,enzyme,and enzyme-Sevage method was evaluated in terms of the ratio of protein removal from HCP and polysaccharide loss,and the optimal conditions were determined by single factor experiment and orthogonal analysis. The result showed that enzyme-Sevage method with higher efficiency of deproteinization was better than others. The optimal conditions of deproteinization were:enzyme usage of 2%,temperature of 60 ℃,time of 3 h,after 2 times of Sevage deproteinization,the ratio of deproteinization and polysaccharide loss were 90.60% and 20.36%,respectively. Using peroxide value(POV)as evaluation index,the antioxidant effects of HCP on edible oils and fats were evaluated by Schaal oven method.The results showed that the antioxidant effect of HCP on rapeseed oil and soybean oil was not obvious,but showed better effect on lard oil. As the addition of HCP reached to 0.08%,the POV value decreased by 17.14 meg/g compared with the blank group.

honeybee comb;polysaccharides;deproteinization;edible oil;antioxidant activity

2016-12-23

殷玲(1983-), 女, 博士, 講師, 研究方向：蜂產(chǎn)品開發(fā)及深加工研究,E-mail:lingyin_txx@163.com。

江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術學院重點科研課題(NSFRC1401);江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術學院科研課題(NSFPT201521);校企合作課題(00010115004)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)13-0202-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.038