俄色葉提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用

曾 俊,楊瑞山,蔡曉洋,周海玉,黃 珍,王 盼,李 敏

(成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點實驗室,四川成都 611137)

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俄色葉提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用

曾 俊,楊瑞山,蔡曉洋,周海玉,黃 珍,王 盼,李 敏*

(成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點實驗室,四川成都 611137)

目的:研究俄色葉提取物對小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用。方法:采用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇一次性灌胃造成小鼠急性肝損傷,檢測各組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)的水平,及肝組織勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平的變化,同時HE染色觀察肝臟組織學(xué)改變。結(jié)果:俄色葉提取物能不同程度地降低小鼠血清中ALT、AST、TG、LDL-C水平,減少肝勻漿MDA含量,升高肝勻漿SOD、GSH-Px的活性。病理切片顯示各給藥組小鼠肝組織損傷均有不同程度的減輕。結(jié)論:俄色葉提取物對小鼠急性酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

藏藥,俄色葉,酒精性肝損傷,保護(hù)作用

酒精性肝病(ALD)是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致急慢性肝病的主要原因[1],ALD及其并發(fā)癥也是最常見的死因之一[2]。酒精的濫用和依賴導(dǎo)致的ALD病譜包括脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化,甚至可發(fā)展至肝癌。ALD發(fā)病機制復(fù)雜,首先肝臟是機體乙醇代謝的主要場所,在乙醇代謝過程中,產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷肝臟,氧化應(yīng)激損傷有可能誘發(fā)脂質(zhì)過氧化,進(jìn)一步損傷肝臟;氧化應(yīng)激亦可能引起肝細(xì)胞凋亡與再生,長期飲酒不僅會導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡,還可抑制患者的肝細(xì)胞增殖,導(dǎo)致ALD發(fā)生發(fā)展[3]。隨著現(xiàn)代人們生活方式的變化,ALD對人類健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅,但目前尚無FDA 批準(zhǔn)的有效藥物療法。而大量非傳統(tǒng)藥物也有可能被證明為有效藥物,因此開發(fā)安全有效的能夠預(yù)防ALD的食品或保健品意義重大[4]。

“俄色葉”來源于薔薇科蘋果屬植物變?nèi)~海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.和花葉海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid. 的干燥葉及葉芽[5]。在甘孜州藏區(qū),俄色葉雖為藏族民間習(xí)用藥材,但俄色葉的食用歷史較長,其食品標(biāo)準(zhǔn)已在四川省衛(wèi)生廳備案。近年來俄色葉在食品、保健食品及藥品方面的使用量逐年增加,爐霍縣林業(yè)局已將其開發(fā)成保健茶“雪域俄色茶”,并已成為國家地理標(biāo)志性產(chǎn)品。主要有攻堅化積、除膩滌滯、保肝利膽等功效,主治消化不良、高血壓、高血糖、高血脂及一些肝臟疾病[6-7]。現(xiàn)代研究表明俄色葉對CCl4引起的小鼠急性肝損傷具有很好的保護(hù)作用[8],其果實“俄色果”對急性酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用[9]。目前主要將俄色葉應(yīng)用于降血壓、降血脂和降血糖等方面,對于保肝方面的研究較少。本實驗建立小鼠急性酒精性肝損傷的模型,通過觀察給予俄色葉提取物后小鼠生化、病理的改變,探討俄色葉提取物對小鼠急性酒精性肝損傷有無保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性昆明種小鼠 117只,體重(22±2) g,由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供,動物質(zhì)量合格證號:SCXK(川)2013-24；俄色葉 四川省爐霍縣雪域俄色有限公司提供,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為薔薇科蘋果屬植物變?nèi)~海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes或花葉海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid的干燥葉及葉芽;聯(lián)苯雙酯滴丸(DDB) 浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司,批號:A02140302;低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測試劑盒 南京建成工程研究所,批號分別為:20150420、20150420、20150521、20150417;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒 Abcam公司,批號分別為:Rm0739XL、Rm1377XL、Rm0149XL。

Mk3多功能酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾儀器有限公司;DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;X-22R冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司;圖像分析軟件Motic Images Advanced。

1.2 實驗方法

1.2.1 受試樣品的制備 稱取花葉海棠葉、變?nèi)~海棠葉干燥粉末(過三號篩),加入20倍體積蒸餾水,加熱回流提取2 h,紗布慮過,重復(fù)提取3次,合并濾液,濃縮成含生藥0.5 g/mL的藥液,生理鹽水溶解,得到不同濃度的提取液。

1.2.2 動物分組、給藥與模型制備 將117只雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后隨機分為9組,每組13只:正常對照組,模型組,陽性對照組(DDB組,150 mg/kg),花葉海棠、變?nèi)~海棠各劑量組(0.6、1.2、2.4 g/kg)。受試樣品用生理鹽水配制,各組小鼠按0.2 mL/10 g體重灌胃容量來計算,正常對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水,按順序每天灌胃一次受試樣品,連續(xù)30 d,灌胃后自由飲食。實驗至第31 d,除正常對照組給予等體積蒸餾水外,陽性對照組、實驗組及模型組以12 mL/kg的量,用50%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液按順序灌胃,建立小鼠急性肝損傷模型。

1.2.3 一般情況觀察 實驗期間觀察小鼠的精神狀態(tài)、行為、毛發(fā)光澤度及死亡等情況,并記錄進(jìn)食量和飲水情況。

1.2.4 指標(biāo)測定 末次灌胃后,小鼠禁食不禁水16 h,去除死亡小鼠,按原先給藥順序各組取8只小鼠摘眼球采血,分離血漿,取血清,按照試劑盒說明書分別測定血清中的ALT、AST、TG和LDL-C水平;準(zhǔn)確稱取肝臟相同部位0.2 g,以1∶9(m/V)的生理鹽水制成肝勻漿,按照試劑盒說明書分別測定肝組織中MDA、SOD和GSH-Px水平。

1.2.5 肝臟病理組織學(xué)檢查 取小鼠肝臟左葉,4 ℃生理鹽水沖盡殘血,濾紙拭干,4%多聚甲醛固定液固定,石蠟包埋切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般情況觀察及死亡率

給予50%的乙醇染毒后,小鼠多先表現(xiàn)出興奮狀態(tài),繼而行走不穩(wěn),四肢癱軟,重者嗜睡、醉倒、呼吸急促、抽搐,此狀態(tài)持續(xù)2 h左右。12 h后觀察死亡情況,死亡率結(jié)果見表1。由表1可知,各給藥組均能明顯降低乙醇染毒后小鼠的死亡率。結(jié)果表明俄色葉提取物具有良好的保肝作用。

表1 俄色葉提取物對急性酒精性肝 損傷小鼠死亡率的影響(n=13)Table 1 Effects of Eseye extracts on mortality of mice with acute alcoholic liver damage(n=13)

2.2 對急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST、TG、LDL-C水平的影響

與正常對照組相比,模型組小鼠的ALT、AST、TG、LDL-C均顯著升高(p<0.01)。與模型組相比,除花葉海棠高劑量組小鼠的AST和變?nèi)~海棠低劑量組小鼠的TG無顯著差異外,其余各給藥組血清中ALT、AST、TG、LDL-C均顯著降低(p<0.05或p<0.01)。見表2。

表2 俄色葉提取物對急性酒精性肝損傷小鼠血清中 ALT、AST、TG、LDL-C 水平的影響Table 2 Effects of Eseye extracts on the level of ALT,AST,TG,LDL-C in mice serum with acute alcoholic liver ±s,n=8)

注:與正常對照組比較:**p<0.01,*p<0.05;與模型組比較:##p<0.01,#p<0.05。

表3 俄色葉提取物對急性酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中MDA、SOD、GSH-Px水平的影響±s,n=8)Table 3 Effects of Eseye extracts on the level of MDA,SOD,GSH-Px in mice liver homogenate with acute alcoholic liver ±s,n=8)

注:與正常對照組比較:**p<0.01,*p<0.05;與模型組比較:##p<0.01,#p<0.05。2.3 對急性酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中MDA、SOD、GSH-Px水平的影響

與正常對照組相比,模型組小鼠的MDA含量顯著升高(p<0.01),SOD、GSH-Px活性顯著降低(p<0.01);與模型組相比,花葉海棠低劑量組對MDA含量影響不顯著,變?nèi)~海棠低劑量組對SOD活性影響不顯著,花葉海棠高劑量組對GSH-Px活性影響不顯著,其余各給藥組MDA含量顯著降低(p<0.05或p<0.01),SOD、GSH-Px活性顯著升高(p<0.05或p<0.01)。見表3。

2.4 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

由圖1可得光鏡下觀察各組小鼠肝組織切片,正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰,肝細(xì)胞索放射狀排列,肝細(xì)胞核清晰、胞質(zhì)均勻,未見增生及假小葉形成,肝細(xì)胞未見變性、壞死,及各類細(xì)胞浸潤;模型組小鼠大部分肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整,但肝細(xì)胞出現(xiàn)中重度水腫變性,肝細(xì)胞間隙不清,胞漿淡染、偶見細(xì)胞壞死,肝竇間及匯管區(qū)周圍可見炎細(xì)胞浸潤,未見脂肪變性。DDB組和俄色葉提取物各劑量組小鼠肝細(xì)胞索放射狀排列,肝細(xì)胞正常,無明顯變性,肝細(xì)胞胞漿著色較均勻,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰。其中俄色葉提取物各組偶見少許細(xì)胞水腫及炎細(xì)胞浸潤(圖1D-1、D-3、E-1),未見脂肪變性。病理圖片見圖1。

圖1 俄色葉提取物對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織病理學(xué)影響(HE,×100)Fig.1 Effects of Eseye extracts on Histopathological of liver in mice with acute alcoholic liver damage(HE,×100)

3 討論

乙醇誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷實驗結(jié)果表明:模型組小鼠血清ALT、AST、TG、HDL-C顯著升高,肝組織SOD、GSH-Px活性顯著降低,MDA含量顯著升高,病理切片觀察到肝組織細(xì)胞中重度水腫變性、可見少許炎性細(xì)胞浸潤,偶見細(xì)胞壞死,說明乙醇在代謝中對肝細(xì)胞產(chǎn)生了脂質(zhì)過氧化、對肝細(xì)胞膜、細(xì)胞微粒體的損害作用,并導(dǎo)致肝功能、血脂的異常。而提取物各劑量組均能明顯降低血清中ALT、LDL-C水平,能不同程度降低AST、TG;同時能不同程度降低肝組織中MDA,不同程度增加SOD、GSH-Px活性,減少病理組織切片中細(xì)胞的水腫、炎性細(xì)胞的產(chǎn)生和細(xì)胞壞死,表明俄色葉提取物具有一定的保護(hù)肝臟的作用。俄色葉提取物中主要含黃酮類成分,其中含量最高的成分為根皮苷[17-18]。馮天艷[19]等研究表明,根皮苷對CCl4致小鼠急性肝損傷具有明顯保護(hù)作用。

4 結(jié)論

俄色葉提取物對酒精性急性肝損傷有一定的保護(hù)作用,其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)肝功能、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化以及增強抗氧化能力來完成的,該機制有待進(jìn)一步研究。俄色葉中含有多糖類、鞣質(zhì)類、黃酮類等多種化學(xué)成分,其中黃酮類化合物含量最大并具有抗氧化活性,且根皮苷已被發(fā)現(xiàn)具有保肝作用,但其他成分是否具有保肝作用,需要進(jìn)一步研究。

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Hepatoprotective effects of Eseye extracton acute alcoholic liver damage in mice

ZENG Jun,YANG Rui-shan,CAI Xiao-yang,ZHOU Hai-yu,HUANG Zhen,WANG Pan,LI Min*

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,The Ministry of Education Key Laboratory for Standardization ofChinese Medicines,State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research Development and Utilization of ChineseMedicines Resources Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Science and Technology,Chengdu 611137,China)

Objective:To investigate the hepatoprotective effects of Eseye extracts against alcohol-induced acute liver injury in mice. Method:The acute liver injury animal model was established in mice by alcohol gavage(50%). The serum levels of ALT,AST,LDL-C and TG were determined. MDA,SOD and GSH-Px were detected in the liver homogenate,as well as the histopathological changes of the liver were observed by HE staining. Result:Eseye extract decreased the levels of ALT,AST,TG and LDL-C in serum. Meanwhile,the MDA content in liver homogenate was reduced whereas the activity of SOD and GSH-Px were increased by Eseye extract. According to the liver histopathological observation,all of treatment groups showed alleviation in mice liver injury to varying degrees. Conclusion:Eseye extract has protective effects on acute liver injury induced by alcohol in mice.

Tibetan medicine;Eseye;alcoholic liver injury;preventive effect

2016-12-06

曾俊(1992-),女,碩士研究生,研究方向:中藥品種、質(zhì)量與資源研究,E-mail:z_zengj@163.com。

*通訊作者:李敏(1962-),女,本科,教授,研究方向:中藥品種、質(zhì)量及資源研究,E-mail:028limin@163.com。

全國第四次中藥資源普查(2012-H-100)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)13-0311-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.058