產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化

張博文,陳可泉,曹偉佳,王 昕

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 211816)

?

產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化

張博文,陳可泉,曹偉佳,王 昕*

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 211816)

順式-4-羥脯氨酸(CHOP)是一種重要的手性結(jié)構(gòu)物質(zhì),可廣泛用于藥物以及香料制造。本研究為開(kāi)發(fā)CHOP的生物合成方法,將來(lái)源于中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)的L-脯氨酸-4-羥化酶在枯草芽孢桿菌WB800N中實(shí)現(xiàn)了成功表達(dá),構(gòu)建獲得了能夠以L-脯氨酸為底物合成CHOP的工程菌株,進(jìn)而對(duì)該菌株的發(fā)酵條件以及發(fā)酵組分進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果表明:工程菌株的最適發(fā)酵溫度為25 ℃,最適誘導(dǎo)劑濃度為1 mmol/L,最適發(fā)酵pH為5;在發(fā)酵體系中加入5 mmol/L硫酸亞鐵和2.5 g/L L-脯氨酸時(shí)最有利于合成CHOP。在最優(yōu)發(fā)酵體系下發(fā)酵60 h后,順式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量可以達(dá)到120.2 mg/L。本文成功的構(gòu)建了羥脯氨酸生產(chǎn)菌株枯草桿菌WB800 pHT-P4H,而研究結(jié)果為枯草桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)順式-4-羥鋪氨酸提供了基礎(chǔ)。

L-脯氨酸順式-4-羥化酶,枯草桿菌WB800N,發(fā)酵,順式-4-羥脯氨酸

L-羥脯氨酸(L-hydroxyproline)不屬于20種常見(jiàn)的氨基酸,作為膠原蛋白的主要組成成分,羥脯氨酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、動(dòng)物飼料和美容業(yè)等方面[1]。在醫(yī)藥方面,羥脯氨酸作為原料可用于合成消炎藥、碳青霉烯類抗生素等藥物。在化工方面,羥脯氨酸可作為手性原料合成多種聚合物[2]。順式-4-羥脯氨酸(CHOP)是羥脯氨酸四種立體異構(gòu)體中的一種,該物質(zhì)作為一種重要的手性結(jié)構(gòu)物質(zhì),可以用于藥物以及香料制造,具有很高的藥用價(jià)值,用于治療各種癌癥[3]。另外,羥脯氨酸具有獨(dú)特的風(fēng)味,苦中帶著甜味,能改善果汁飲料風(fēng)味,而且還具有皮膚修復(fù)功能[2],常作為飲料添加劑。

圖1 順式-4-羥脯氨酸生物合成的路線圖Fig.1 Scheme of the biochemical reaction involved in cis-4-hydroproline production

目前,順式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn)主要以酸水解膠原蛋白得到反式-4-羥脯氨酸為原料,通過(guò)化學(xué)法差向異構(gòu)合成[4-5]。但該方法存在工藝繁瑣、污染嚴(yán)重、生產(chǎn)成本高,產(chǎn)量較低和分離純化困難等缺點(diǎn)[6]。近幾年,隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,人類改造微生物作為細(xì)胞工廠進(jìn)行生物制造的能力顯著提高[7],生物合成以其操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、無(wú)環(huán)境污染、成本低等多種優(yōu)點(diǎn)受到人們的廣泛關(guān)注[8]。因此開(kāi)發(fā)順式-4-羥脯氨酸的生物合成法具有重要意義。

2009年,Kino課題組首次在百脈根中慢生根瘤菌以及苜蓿中華根瘤菌發(fā)現(xiàn)了L-脯氨酸順式-4-羥化酶(P4H)[9],該酶以L-脯氨酸、α-酮戊二酸為底物生成丁二酸和順式-4-羥脯氨酸[7](圖1)。研究發(fā)現(xiàn)P4H具有較高的立體選擇性[10],可有效生成順式-4-羥脯氨酸,不需要化學(xué)差向異構(gòu)[6]。P4H 屬于α-酮戊二酸依賴型的雙加氧酶家族,酶催化反應(yīng)需要非血紅素亞鐵離子以及O2的參與[8]?，F(xiàn)有研究中主要以大腸桿菌為宿主細(xì)胞,通過(guò)構(gòu)建表達(dá)P4H的工程大腸桿菌,進(jìn)而通過(guò)全細(xì)胞催化方法或發(fā)酵法合成順式-4-羥脯氨酸[8]。如Francesco等人在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)(pLysS)過(guò)表達(dá)P4H羥化酶基因,發(fā)酵生產(chǎn)了89.33 mg/L順式-4-羥脯氨酸[11]。趙利維等人構(gòu)建過(guò)表達(dá)P4H的工程大腸桿菌,全細(xì)胞轉(zhuǎn)化60 h后,L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到83.33%[12]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)同樣是當(dāng)今工業(yè)酶的主要生產(chǎn)菌種之一,由于其營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、產(chǎn)酶量高、種類多、安全性好等優(yōu)點(diǎn),在現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[13]。本研究選源于中華根瘤菌的L-脯氨酸順式-4-羥化酶P4H作為生產(chǎn)酶,優(yōu)化基因序列后將該基因首次在枯草芽孢桿菌中表達(dá),得到工程菌株。進(jìn)而通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件,確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳培養(yǎng)基組成和濃度以及發(fā)酵條件,為以后的工業(yè)化生產(chǎn)提供了初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株及質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)使用發(fā)酵菌株為枯草芽孢桿菌WB800N，本實(shí)驗(yàn)室提供;大腸桿菌TransT1 全式金生物技術(shù)有限公司,用于質(zhì)粒構(gòu)建和克隆;克隆表達(dá)載體為pHT-01 本實(shí)驗(yàn)室提供;限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、HindIII、XbaI以及DNA Marker、T4連接酶 Takara公司;DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒銷量抽提試劑盒 北京全式金生物技術(shù)公司；順式-4-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 色譜級(jí)，Sigma;L-脯氨酸 食品級(jí)，鄭州天順食品添加劑有限公司;其它常用試劑 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三氟丁酸及七氟乙酸 色譜級(jí)，阿拉丁試劑上海有限公司;酵母粉和蛋白胨 OXOID公司;氯霉素 上海生工生物工程有限公司。

M9液體培養(yǎng)基 葡萄糖10 g/L,NH4Cl 10 g/L,NaCl 0.5 g/L,Na2HPO4·12H2O 17.1 g/L,KH2PO43 g/L,MgSO40.12 g/L,CaCl21.1×10-2g/L,(NH4)6Mo7O243.71×10-3g/L,H3BO32.47×10-2g/L,CoCl2·6H2O 7.14×10-3g/L,CuSO4·5H2O 2.51×10-3g/L,MnCl2·4H2O 1.60×10-2g/L,ZnSO4·7H2O 2.8×10-3g/L；LB液體培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈉5 g/L,12l ℃高壓蒸汽滅菌15 min;使用前加入合適濃度的抗生素；LB固體培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L,氯化鈉5 g/L,瓊脂糖25 g/L,121 ℃,15 min高壓蒸汽保溫滅菌;使用前加入合適濃度的抗生素。

SW-CJ-1FD生物凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;BS124S電子天平 Sartourius公司;Eporator電轉(zhuǎn)化儀 Eppendorf;HVE-85高壓蒸汽鍋 HIRAYAMA公司;H2050R-1離心機(jī) 湘儀離心機(jī)有限公司;THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;721B1210792凝膠成像儀 BIO-RAD;GO-1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 Thermo;ALLtech Series1500 ELSD2000液相 Alltech。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株構(gòu)建 根據(jù)已公布的苜蓿中華根瘤菌中的P4H 基因序列(NCBI Gene ID:14808181)以枯草芽孢桿菌為宿主進(jìn)行密碼子優(yōu)化,并由Genscript(金唯智)公司進(jìn)行基因合成。將合成的基因(見(jiàn)下文)兩端加入BamH I和Xba I酶切位點(diǎn),酶切連接至載體pHT-01中,轉(zhuǎn)化連接后的連接液進(jìn)入全式金公司大腸桿菌Trans-T1中,并在含有氯霉素(Cm)的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證后,驗(yàn)證并得到質(zhì)粒pHT-P4H,隨后將pHT-01-P4H電轉(zhuǎn)化進(jìn)WB800N菌種中[14],并在含有氯霉素(Cm)的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,菌落測(cè)序驗(yàn)證正確后,得到工程菌株WB800N-P4H。同時(shí)將空質(zhì)粒pHT-01轉(zhuǎn)入菌株WB800N中,得到的菌株作為對(duì)照菌株。

脯氨酸羥化酶的基因序列:

GGATCC為BamH I的酶切位點(diǎn)，TCTAGA為XbaI的酶切位點(diǎn)。

1.2.2 菌株培養(yǎng) 種子培養(yǎng):將10 μL的工程菌WB800N-P4H甘油凍存菌接種于含有5 mL的LB液體培養(yǎng)基的50 mL搖管中,加入終濃度為25 mg/L的Cm抗生素。置于37 ℃搖床中,200 r/min過(guò)夜培養(yǎng);

發(fā)酵培養(yǎng):將1 mL上述種子液接種于含有50 mL M9液體培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中,加入36.7 μL的34 g/L Cm抗生素使其濃度為25 mg/L,37 ℃,200 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)OD600值達(dá)到0.3～0.6時(shí)加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),使其終濃度為1 mmol/L,于30 ℃發(fā)酵36 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.3.1 發(fā)酵溫度的影響 初始發(fā)酵溫度37 ℃,細(xì)胞OD600生長(zhǎng)到0.3～0.5時(shí)加入IPTG,使其終濃度達(dá)到1 mmol/L,將細(xì)胞分別在20、25、28、30、34 ℃下培養(yǎng)36 h。

1.2.3.2 IPTG的影響 細(xì)胞OD600生長(zhǎng)到0.3～0.5時(shí)加入IPTG,使其終濃度分別為0.50、0.75、1.00、2.00 mmol/L,之后在25 ℃條件下培養(yǎng)36 h。

1.2.3.3 pH的優(yōu)化 通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀的配比配制不同pH(4、5、6、7、8)的緩沖液,磷酸鹽終濃度為100 mmol/L,細(xì)胞量生長(zhǎng)到0.3～0.5 g/L時(shí)加入終濃度為1 mmol/L IPTG,25 ℃條件下培養(yǎng)36 h。

1.2.4 發(fā)酵組分優(yōu)化

1.2.4.1 鐵離子類型的影響 細(xì)胞OD600生長(zhǎng)到0.3～0.5時(shí)加入IPTG,使其終濃度達(dá)到1 mmol/L,之后分別加入硫酸亞鐵(FeSO4)、三氯化鐵(FeCl3)使得加入鐵離子終濃度為5 mmol/L,25 ℃條件下培養(yǎng)36 h。

1.2.4.2 鐵離子濃度的優(yōu)化 細(xì)胞OD600生長(zhǎng)到0.3～0.5時(shí)加入IPTG,使其終濃度達(dá)到1 mmol/L,同時(shí)分別加入不同濃度的硫酸亞鐵使加入鐵離子終濃度分別為1.25、2.5、5、7.5、10 mmol/L,25 ℃條件下培養(yǎng)36 h。

1.2.4.3 底物濃度對(duì)順式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響 細(xì)胞OD600生長(zhǎng)到0.3～0.5時(shí)加入IPTG使其終濃度達(dá)到1 mmol/L,同時(shí)向培養(yǎng)基中加入不同濃度的脯氨酸使其終濃度分別為1、2.5、5、10、20 g/L,并加入終濃度為5 mmol/L的硫酸亞鐵,25 ℃條件下培養(yǎng)36 h。

1.2.5 最優(yōu)底物濃度及最優(yōu)發(fā)酵條件下順式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn) 在M9培養(yǎng)基中接種1 mL種子液,在pH為5 的條件下培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞OD600值達(dá)到0.3～0.5 時(shí),加入2.5 g/L脯氨酸,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,并加入終濃度為5 mmol/L的硫酸亞鐵,在25 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.6 分析方法 順式-4-羥脯氨酸和L-脯氨酸的測(cè)定采用液相色譜法(ALTECH ELSD 2000)進(jìn)行。色譜柱為C18分析柱(5 μm,250 mm×4.6 mm,GRACE),流動(dòng)相為0.7%的三氟乙酸和0.0653%七氟丁酸,流速 1 mL/min,進(jìn)樣體積10 μL,柱溫28.5 ℃,所使用的蒸發(fā)光測(cè)器檢測(cè)漂移管溫度為115 ℃,氣體流速為3.2 L/min。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:取15～500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸樣品,然后分別進(jìn)樣10 μL。通過(guò)液相測(cè)定相應(yīng)峰高峰面積,制作出的標(biāo)曲線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.998以上,該方法重復(fù)率較高,穩(wěn)定性好。

樣品測(cè)定:樣品羥脯氨酸,當(dāng)樣品含量高時(shí),可用蒸餾水稀釋至標(biāo)曲氨基酸標(biāo)曲范圍內(nèi)。當(dāng)樣品濃度高于15 mg/L且低于500 mg/L時(shí)樣品濃度檢測(cè)線性較好。不同的蒸發(fā)光檢測(cè)器靈敏度不同,對(duì)于檢測(cè)值也有一定的影響。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)都至少進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用Excel 2007對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,比較實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的標(biāo)準(zhǔn)誤差,采用Excel 2007做圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建和驗(yàn)證

為構(gòu)建獲得生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的工程枯草芽孢桿菌,本研究將來(lái)源于中華根瘤菌的編碼L-脯氨酸順式-4-羥化酶基因的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,酶切連接到枯草芽孢桿菌胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒pHT01中得到質(zhì)粒pHT01-P4H(圖2A),轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800N獲得工程菌株WB800N-P4H。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中(圖2B)。為了驗(yàn)證該菌株中的重組羥化酶是否具有活性,對(duì)工程菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),如圖2C所示,對(duì)照菌株沒(méi)有產(chǎn)物生成,而工程菌株WB800N-P4H可以生產(chǎn)19.28 mg/L的CHOP,表明了L-脯氨酸順式-4-羥化酶能夠在枯草芽孢桿菌中獲得表達(dá),所構(gòu)建的工程菌株可用于后續(xù)CHOP的生產(chǎn)。

圖2 產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸枯草芽孢桿菌 工程菌的構(gòu)建和驗(yàn)證Fig.2 The construction and identification of engineered Bacillus subtilis producing CHOP注:(A)質(zhì)粒pHT01-P4H的圖譜; (B)WB800N-P4H菌落PCR驗(yàn)證圖譜; (C)重組枯草芽孢桿菌WB800N-P4H的活性檢測(cè)。

圖3 發(fā)酵條件對(duì)工程菌株WB800N-P4H生產(chǎn)CHOP的影響Fig.3 The effect of fermentation conditions on the CHOP production by the recombinant strain WB800N-P4H注:(A)溫度對(duì)工程菌株生產(chǎn)CHOP的影響; (B)誘導(dǎo)劑IPTG添加對(duì)工程菌株生產(chǎn)CHOP的影響; (C)發(fā)酵pH對(duì)工程菌株生產(chǎn)CHOP的影響。

2.2 順式-4-羥脯氨酸的發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵的培養(yǎng)條件作為發(fā)酵過(guò)程的重要因素之一,影響著菌株的生長(zhǎng)代謝,從而調(diào)節(jié)微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成[15]。因此優(yōu)化工程菌株的發(fā)酵條件,選擇最優(yōu)的培養(yǎng)環(huán)境,對(duì)于提高工程菌株WB800N-P4H的順式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量具有重要作用。

2.2.1 溫度對(duì)工程菌株WB800N-P4H合成順式-4-羥脯氨酸的影響 各種微生物都有其最適宜的生長(zhǎng)溫度,發(fā)酵本身就是微生物生長(zhǎng)代謝及物質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程,因此溫度控制是發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵[16]。本文研究了不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的影響[17]。如圖3A所示,當(dāng)溫度為25 ℃時(shí),CHOP的產(chǎn)量達(dá)到了最大值，隨著溫度的進(jìn)一步提高,CHOP的產(chǎn)量有所下降。溫度不僅影響重組基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的折疊[11],也影響菌株本身的代謝途徑。因此從圖中可以看出，當(dāng)工程菌株在25 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí),最有利于CHOP的生成。

2.2.2 IPTG濃度對(duì)工程菌株生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的影響 誘導(dǎo)劑IPTG的濃度對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平具有顯著的影響作用[18]。為了研究IPTG濃度對(duì)發(fā)酵合成順式-4-羥脯氨酸的影響。如圖3B所示,隨著IPTG濃度有所增加,CHOP的生成量有所增加。IPTG濃度達(dá)到1 mmol/L時(shí),CHOP的產(chǎn)量達(dá)到最高值,隨著IPTG濃度的繼續(xù)提高,CHOP的產(chǎn)量有所下降。這可能是由于IPTG濃度過(guò)高時(shí),將會(huì)作為毒性物質(zhì),影響細(xì)胞的繁殖和生長(zhǎng)[19]。上述結(jié)果表明,工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)CHOP的最適IPTG濃度為1 mmol/L。

2.2.3 pH對(duì)工程菌株生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的影響 為了研究發(fā)酵pH對(duì)順式-4-羥脯氨酸合成的影響,將培養(yǎng)基的pH分別調(diào)節(jié)在4～8。如圖3C所示,隨著發(fā)酵液中pH的增加到5時(shí),CHOP產(chǎn)量達(dá)到最大值,隨著發(fā)酵液pH的進(jìn)一步提高,CHOP的產(chǎn)量開(kāi)始下降,在pH為8時(shí),在發(fā)酵液中無(wú)法檢測(cè)到CHOP的生成。這些結(jié)果表明工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)CHOP的最適pH為5,在偏堿性的條件下工程菌株的CHOP生產(chǎn)能力受到顯著抑制。

2.3 順式-4-羥脯氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

在工業(yè)化生產(chǎn)中,發(fā)酵培養(yǎng)基組分很大程度上影響著目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量。培養(yǎng)基組分的優(yōu)化有利于降低大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的成本[20]。本研究通過(guò)優(yōu)化CHOP發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的培養(yǎng)基組分,探索影響CHOP發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵因素等,以提高發(fā)酵水平,為CHOP的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

2.3.1 鐵離子對(duì)菌體合成順式-4-羥脯氨酸的影響 研究表明,L-脯氨酸順式-4-羥化酶屬于α-酮戊二酸雙加氧酶家族,二價(jià)鐵離子能夠促進(jìn)該酶所催化的羥化反應(yīng)效率[21]。為了研究不同鐵離子對(duì)工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)CHOP的影響,在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同種類的5 mmol/L的鐵離子。如圖4所示,加入硫酸亞鐵時(shí),順式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量最高,是對(duì)照的1.25倍。加入三氯化鐵時(shí),順式-4-羥脯氨酸和對(duì)照相比并沒(méi)有提高,說(shuō)明在工程菌株發(fā)酵過(guò)程中加入硫酸亞鐵能促進(jìn)CHOP生產(chǎn)。

圖4 不同鐵離子添加對(duì)工程菌發(fā)酵生產(chǎn)CHOP的影響Fig.4 The effect of different iron ions on CHOP production

2.3.2 二價(jià)鐵離子濃度對(duì)菌體合成順式-4-羥脯氨酸的影響 不同的二價(jià)鐵離子濃度對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)有著不同的影響[22]。因此,通過(guò)在培養(yǎng)基中添加不同濃度的二價(jià)鐵離子來(lái)研究鐵離子濃度對(duì)CHOP生產(chǎn)的影響。結(jié)果如圖5所示,隨著Fe2+濃度的增加,CHOP的產(chǎn)量也不斷地增加,當(dāng)添加5 mmol/L的鐵離子,CHOP的產(chǎn)量達(dá)到了最大值。繼續(xù)增加Fe2+濃度,隨著Fe2+濃度的提高,CHOP的產(chǎn)量隨著Fe2+的增加而減少。

圖5 二價(jià)鐵離子濃度對(duì)工程菌發(fā)酵生產(chǎn)CHOP的影響Fig.5 The effect of Fe2+ concentration on the CHOP production

2.3.3 底物濃度對(duì)工程菌株生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的影響 發(fā)酵初始時(shí)不同的底物濃度對(duì)于CHOP的生產(chǎn)有著不同的影響[22]。為了研究底物濃度對(duì)工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)CHOP的影響,在不同的底物濃度下將工程菌株發(fā)酵36 h,檢測(cè)CHOP的生成。結(jié)果如圖6所示,隨著底物濃度的增加,CHOP的產(chǎn)量也有所提高。當(dāng)添加2.5 g/L的脯氨酸時(shí),CHOP的產(chǎn)量達(dá)到最高為103.3 mg/L。當(dāng)繼續(xù)增加底物濃度時(shí),羥脯氨酸產(chǎn)量有所下降。這可能是由于過(guò)高的底物濃度抑制了CHOP的生產(chǎn),該反應(yīng)存在底物抑制現(xiàn)象[23]。所以底物濃度為2.5 g/L,最有利于羥脯氨酸的生成,并且后期可以通過(guò)分批補(bǔ)料的方式提高CHOP的生成。

圖6 底物濃度對(duì)工程菌發(fā)酵生產(chǎn)CHOP的影響Fig.6 Effect of substrate concentration on CHOP production

2.4 最優(yōu)培養(yǎng)基組分和最優(yōu)發(fā)酵條件下的發(fā)酵結(jié)果

根據(jù)上述研究,我們確定了工程菌株WB800N-P4H發(fā)酵生產(chǎn)CHOP的最優(yōu)反應(yīng)條件以及培養(yǎng)基組分濃度。因此我們將菌株WB800-P4H在最優(yōu)條件下進(jìn)行發(fā)酵,每隔12 h取樣觀察CHOP的產(chǎn)量。結(jié)果如圖7所示,同未優(yōu)化的發(fā)酵條件相比,CHOP的產(chǎn)量明顯提高。同時(shí)在最優(yōu)發(fā)酵條件下,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,CHOP的產(chǎn)量也不斷地增加,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí),CHOP的產(chǎn)量達(dá)到了最大值。當(dāng)發(fā)酵60 h后CHOP的產(chǎn)量并沒(méi)有提高反而有所下降,這表明枯草芽孢桿菌WB800N中可能存在CHOP的降解途徑,使得發(fā)酵后期菌體開(kāi)始降解產(chǎn)物CHOP。所以枯草發(fā)酵合成羥脯氨酸最適時(shí)間為60 h,羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)120.2 mg/L,相比對(duì)照提高了約6.3倍。在后續(xù)的研究工作中,如果能夠解析細(xì)胞中的CHOP降解途徑,并進(jìn)一步對(duì)該途徑進(jìn)行敲除,則有利于提高脯氨酸生成CHOP的轉(zhuǎn)化率。

圖7 在優(yōu)化條件下工程菌WB800N-P4H 發(fā)酵生產(chǎn)CHOP的特性Fig.7 The CHOP production by the recombinant strain WB800N-P4H in the optimized fermentation conditions

3 結(jié)論

生物法生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸不僅大大降低了生產(chǎn)成本,也對(duì)于生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸具有重要意義。本研究從苜蓿中華根瘤菌中獲取L-脯氨酸順式-4-羥化酶基因,首次成功在枯草桿菌WB800N中表達(dá),并發(fā)酵合成順式-4-羥脯氨酸。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn),得到生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的最佳發(fā)酵條件:其中Fe2+的添加對(duì)于羥脯氨酸生產(chǎn)有促進(jìn)作用,Fe2+濃度為5 mmol/L,發(fā)酵溫度為25 ℃,發(fā)酵pH為5,IPTG濃度為1 mmol/L,脯氨酸底物濃度為2.5 g/L。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后,發(fā)酵60 h時(shí)，CHOP的產(chǎn)量達(dá)到120.2 mg/L。然而枯草桿菌發(fā)酵生產(chǎn)羥脯氨酸還有待提高,可能和枯草桿菌本身的代謝途徑及枯草桿菌對(duì)于脯氨酸及羥脯氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)也有一定的關(guān)系。在后續(xù)研究中計(jì)劃嘗試改變枯草桿菌的代謝途徑以進(jìn)一步提高底物脯氨酸轉(zhuǎn)化率,為CHOP的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

[1]張自強(qiáng),趙東旭,楊新林. 羥脯氨酸的研究與開(kāi)發(fā)[J]. 氨基酸和生物資源,2006,28(1):55-58.

[2]劉合棟,袁春偉,張震宇.高產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸重組大腸桿菌的構(gòu)建以及發(fā)酵條件優(yōu)化[EB/OL].[2013-01-23]

[3]Hara R,Kino K. Characterization of novel 2-oxoglutarate dependent dioxygenases converting L-proline to cis-4-hydroxy-L-proline[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications,2009,379:882-886.

[4]Theodosiou E,Frick O,Bühler B,et al. Metabolic network capacity of Escherichia coli,10for Krebs cycle-dependent proline hydroxylation[J]. Microbial Cell Factories,2014,14(1):1-12.

[5]Klein C,Hüttel W. A Simple Procedure for Selective Hydroxylation of L-Proline and L-Pipecolic Acid with Recombinantly Expressed Proline Hydroxylases[J]. Advanced Synthesis & Catalysis,2011,353(8):1375-1383.

[6]王付才,張震宇,孫付保,等. 1株產(chǎn)順式-4-羥基-L-脯氨酸基因工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵初步優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(2):7-12.

[7]李寅,曹竹安. 微生物代謝工程:繪制細(xì)胞工廠的藍(lán)圖[J].化工學(xué)報(bào),2004,55(10):1573-1580.

[8]劉偉偉. 高產(chǎn)乳鏈菌肽菌種選育及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[D]. 天津:天津大學(xué),2010.

[9]姚雪娜. 產(chǎn)順式-3-羥脯氨酸重組大腸桿菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2015.

[10]Smith J A,Savage G P,Hutt O E. Studies on the Synthesis of cis-4-Hydroxy-L-proline[J]. Australian Journal of Chemistry,2011,64(11):1509-1514.

[11]Falcioni F,Blank L M,Frick O,et al. Proline availability regulates proline-4-hydroxylase synthesis and substrate uptake in proline-hydroxylating recombinant Escherichia coli.[J]. Applied & Environmental Microbiology,2013,79(9):3091-3100.

[12]趙利維,燕瑾,韓蕊,等. 產(chǎn)順式-4-L-羥脯氨酸工程菌的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2016(9):1887-1894.

[13]張芙華. 重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)角質(zhì)酶發(fā)酵條件優(yōu)化[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2008.

[14]王晶. 枯草芽孢桿菌表達(dá)檢測(cè)載體的構(gòu)建與生物素合成酶(BioB)的表達(dá)檢測(cè)[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.

[15]周海巖. L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建、代謝調(diào)控和發(fā)酵條件優(yōu)化[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2011.

[16]劉中利. 白酒釀造發(fā)酵中基于智能策略的溫度優(yōu)化控制[J]. 重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2014(7):92-96.

[17]李恬. 蔗糖為底物雙酶法合成直鏈糊精的研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2013.

[18]宋建民. 乳酸片球菌素的表達(dá)純化與高密度發(fā)酵研究[D]. 上海：華東理工大學(xué),2011.

[19]王水興,李燕萍,許楊,等. 基因工程菌E.coli BL21/pET-DsbA-MalQ發(fā)酵產(chǎn)麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的研究[J]. 食品科學(xué),2007,28(8):285-289.

[20]曹丹玥. 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[D]. 上海：華東師范大學(xué),2006.

[21]張迎君,曾順德,眭順照,等. 柑桔皮發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸[C]. 中國(guó)海峽兩岸菌物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)，2004:96-99.

[22]袁林,左瑞雨,王朋朋,等. 乳酸菌富鐵的研究[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,31(2):241-244.

[23]趙紅英,張健,劉宏娟,等. 1,3-丙二醇發(fā)酵過(guò)程中底物抑制及其對(duì)策的研究[J]. 現(xiàn)代化工,2002,22(7):34-38.

Construction and optimization of fermentation ofBacillussubtiliscis-4-hydroxyproline engineering bacteria

ZHANG Bo-wen,CHEN Ke-quan,CAO Wei-jia,WANG Xin*

(Biotechnology and Pharmaceutical Engineering of Nanjing Tech University,Nanjing 211816,China)

Cis-4-hydroxyproline(CHOP)is an important chiral structure material,which can be widely used in pharmaceuticals and perfume manufacturing. In this study,in order to develop the new way to produce the cis-4-hydroxyproline by biological method,L-proline-4-hydroxylase gene derived fromSinorhizobiummelilotiwas first successfully expressed inBacillussubtilisWB800N,which converts L-proline to cis-4-hydroxyproline. The fermentation conditions and fermentation components of the strain were optimized. The results showed that adding 5 mmol/L sulfuric acid ferrous inBacillussubtilisfermentation were favourable for the formation of cis-4-hydroxyproline. The optimum fermentation temperature of cis-4-hydroxyproline was 25 ℃. The optimum concentration of inducing agent and pH were 1 mmol/L and 5,respectively. After induction,the optimum substrate L-proline concentration was 2.5 g/L. After 60 h ofBacillussubtilisferment cis-4-hydroxyproline,cis-4-hydroxyproline concentration of 120.2 mg/L was achieved. This study construct a strain ofBacillussubtilisWB800N pHT-P4H to produce CHOP,and microbial fermentation byBacillussubtilisWB800N is a potential approach for cis-4-hydroxy-L-proline production by fermentation.

L-proline-4-hydroxylase;BacillussubtilisWB800N;fermentation;cis-4-hydroxyproline

2016-12-08

張博文(1992-),男,碩士在讀,研究方向:系統(tǒng)代謝工程及酶催化,E-mail:1113071788@qq.com。

*通訊作者:王昕(1988),女,博士,中級(jí),研究方向：系統(tǒng)代謝工程及酶催化,E-mail:xinwang1988@njtech.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21576134)。

TS

A

1002-0306(2017)13-0101-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.019