食用合成色素胭脂紅對胰蛋白酶光譜性質(zhì)的影響

張東霞

(西京學(xué)院 應(yīng)用統(tǒng)計與理學(xué)系,陜西西安 710123)

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食用合成色素胭脂紅對胰蛋白酶光譜性質(zhì)的影響

張東霞

(西京學(xué)院 應(yīng)用統(tǒng)計與理學(xué)系,陜西西安 710123)

應(yīng)用熒光光譜法、紫外可見吸收光譜法、傅立葉變換紅外光譜和圓二色光譜法,研究了食用合成色素胭脂紅與胰蛋白酶的結(jié)合性質(zhì),明確胭脂紅與胰蛋白酶之間的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)(n)、作用力類型、結(jié)合距離(r)等信息。結(jié)果表明,胭脂紅對胰蛋白酶內(nèi)源熒光強度有較強的猝滅能力,熒光猝滅機制屬于形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅,由實驗計算得出的熱力學(xué)參數(shù)熵變和焓變均為負值,表明氫鍵和范德華力是驅(qū)動胭脂紅-胰蛋白酶復(fù)合物形成的主要作用力,胭脂紅與胰蛋白酶的結(jié)合常數(shù)達到104mol/L數(shù)量級,存在中等強度的親和力。光譜分析表明胭脂紅與胰蛋白酶結(jié)合引起胰蛋白酶的氨基酸殘基微環(huán)境發(fā)生改變,胰蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量增加,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的含量降低,多肽鏈有所收縮。

胭脂紅,胰蛋白酶,熒光猝滅,結(jié)合性質(zhì)

在食品生產(chǎn)中,為了改善食品的品質(zhì)、外觀而加入著色劑、護色劑等物質(zhì)。為了全面了解著色劑對生物體的作用和反應(yīng)機理,開展著色劑分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的研究就非常有必要。

胭脂紅(Ponceau 4R),又名麗春紅4R,結(jié)構(gòu)見圖1,是一種常見的人工合成著色劑,在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用,然而,如果過量食用,會誘發(fā)中毒,損害人體健康,也會對環(huán)境造成一定的污染[1]。有研究表明,胭脂紅不經(jīng)過還原而直接被氧化,氧化產(chǎn)物可造成DNA損傷[2]。

胰蛋白酶(trypsin),是人和動物腸道中一種重要的消化酶。在食品、紡織、化妝品、醫(yī)療等中有廣泛應(yīng)用[3],臨床上主要用于抗炎癥和消化類藥物的制備。當(dāng)小分子進入人體胃腸道,消化蛋白酶可能會成為小分子間接的結(jié)合靶標(biāo)。胭脂紅被攝入后,將不可避免的與其內(nèi)體的消化酶發(fā)生作用,目前,已有相關(guān)文獻研究了胭脂紅與大分子的相互作用,劉志棟等[4]采用紫外-可見光吸收光譜法、熒光發(fā)射光譜法研究了 BSA 與檸檬黃、日落黃、胭脂紅之間的相互作用機理,馬明明等[5]采用熒光發(fā)射光譜研究了牛血清白蛋白與胭脂紅的相互作用,但關(guān)于胭脂紅進入胃腸道,對胃腸道消化酶結(jié)構(gòu)及生物功能影響的測定研究很少,因此,本文在模擬人體生理酸度下(pH7.4),以胰蛋白酶為蛋白模型,聯(lián)合應(yīng)用熒光光譜法、紫外-可見吸收光譜法、圓二色光譜法及紅外光譜法,研究了食用著色劑胭脂紅在不同濃度、不同溫度對胰蛋白酶光譜性質(zhì)的影響,本文在生理pH條件下研究胭脂紅與胰蛋白酶的相互作用,有助于深入了解胭脂紅在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運、代謝過程及其對胰蛋白酶結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響,為進一步研究人工合成食品添加劑潛在的毒性建立理論基礎(chǔ)。為從分子水平上理解胭脂紅與胰蛋白酶相互作用機制提供了非常有價值的信息,對于開發(fā)更安全的食用著色劑有重要價值。

圖1 胭脂紅的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of ponceau 4R

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

UV-2550型紫外-可見分光光度計 日本SHIMADZU公司;F-4500型熒光光度計 日本Hitachi公司;J-810型圓二色譜儀 日本JASCO公司;Nicolet 380傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;pH211型精密pH計 意大利HANNA公司;胭脂紅[1-(4-磺酸-1-萘偶氮)-2-羥基-6,8-萘二磺酸三鈉鹽],純度≥85%，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2.0×10-3mol/L(用超純水配制)、胰蛋白酶 Aladdin Chemistry公司:用pH7.4的標(biāo)準(zhǔn)Tris-HCl緩沖溶液(0.10 mol/L Tris,0.10 mol/L HCl和0. 1 mol/L的NaCl)配制成濃度為1.0×10-4mol/L的儲備液,使用前稀釋到最佳濃度;N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)標(biāo)準(zhǔn)品 阿拉丁試劑公司,用上述緩沖溶液配制成濃度為5.0×10-3mol/L的貯備液;保存于4 ℃冰箱中備用;實驗用水為二次蒸餾水,其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光光譜測定 在熒光測量皿中加入3 mL 2.0×10-6mol/L的胰蛋白酶工作液,先掃描其熒光光譜,隨后再逐次加入相同體積濃度為2.0×10-4mol/L的胭脂紅溶液,混合均勻并靜置3 min,測量(292,298,304 K)三個溫度下,290～500 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜(激發(fā)波長為280 nm)。隨后取波長差Δλ=15 nm和60 nm進行同步熒光掃描,熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)置為2.5 nm。

1.2.2 紫外-可見吸收光譜測定 室溫條件下,在石英比色皿中準(zhǔn)確加入2.0×10-6mol/L的胰蛋白酶溶液3 mL,掃描190～350 nm范圍的吸收光譜,然后用移液槍依次加入相同體積的胭脂紅溶液(2.0×10-4mol/L),混合均勻并靜置3 min后掃描190～350 nm范圍的吸收光譜,并掃描對應(yīng)游離濃度的胭脂紅的吸收光譜。

1.2.3 圓二色(CD)光譜測定 在室溫條件下,配制不同濃度比([胭脂紅]∶[胰蛋白酶])分別為5∶1和10∶1的胭脂紅-胰蛋白酶混合溶液,掃描190～250 nm波長范圍內(nèi)混合溶液的CD光譜。通過在線Dichroweb軟件中SELCON3程序計算與胭脂紅作用前后的胰蛋白酶各二級結(jié)構(gòu)的含量。

1.2.4 紅外光譜法(FT-IR)測定 在一定條件下,分別測定濃度為2.0×10-5mol/L游離胰蛋白酶和摩爾比為5∶1 的胭脂紅-胰蛋白酶混合物在1800～1400 cm-1紅外光譜,并扣除背景峰。

1.2.5 胰蛋白酶活力的測定 胰蛋白酶在催化底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)后,生成了產(chǎn)物N-苯甲酰-L-精氨酸(BA),BA在253 nm處的紫外吸收能力大大超越了底物BAEE,通過測定胰蛋白酶加入前后253 nm處吸收峰值的波動值從而測定胰蛋白酶的活性[6]。利用抑制動力學(xué)方法,在pH7.4的Tris-HCl緩沖體系中,胰蛋白酶(2.0×10-6mol·L-1)和不同濃度的胭脂紅在37 ℃孵化2 h后,加入BAEE(5.0×10-3mol L-1),每隔20 s測定體系在253 nm處的吸光值,并通過關(guān)系式(1),計算不同濃度胭脂紅存在時胰蛋白酶的相對活性[7]。

相對活性(%)=(R/R0)×100

式(1)

式(1)中R0、R分別為不加抑制劑和添加不同濃度抑制劑時反應(yīng)體系的吸光度隨時間的變化率。

2 結(jié)果與討論

2.1 胭脂紅對胰蛋白酶的熒光猝滅及機理

熒光光譜法是一種非常有效的光譜分析手段,常被用在小分子與大分子相互作用研究中。圖2是胭脂紅-胰蛋白酶體系在25 ℃時的熒光猝滅光譜,從圖中可以明顯看出,胭脂紅的加入導(dǎo)致了胰蛋白酶在350 nm處的熒光發(fā)射峰的強度呈現(xiàn)有規(guī)律的降低,且峰位發(fā)生明顯紅移(移動到358 nm),表明胭脂紅可以和胰蛋白酶發(fā)生相互作用猝滅其內(nèi)源熒光且胰蛋白酶的熒光發(fā)色團(色氨酸和酪氨酸)周圍的微環(huán)境受到胭脂紅的影響而改變,極性增大,疏水性減小[8]。

圖2 胭脂紅對胰蛋白酶的 熒光猝滅光譜(A)及Stern-Volmer圖(B)Fig.2 Fluorescence quenching spectra of trypsin in the presence of ponceau 4R(A) and the Stern-Volmer plots for the trypsin-ponceau 4R system(B)注：Ctrypsin=2.0×10-6 mol/L;cponceau 4R/(×10-6 mol/L), 1～8:0,0.26,0.86,1.29,1.72,2.15,3。

一般情況下,小分子物質(zhì)猝滅蛋白質(zhì)熒光的主要機理大致分為以下兩種:一種是小分子與蛋白質(zhì)之間形成復(fù)合物導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)源性熒光值降低的靜態(tài)猝滅[9];第二種是小分子物質(zhì)撞擊蛋白質(zhì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光值降低的動態(tài)猝滅[10]。一般遵從Stern-Volmer方程[11]:

式(2)

式(2)中F0和F分別代表加入胭脂紅前后胰蛋白酶的熒光強度,Kq為猝滅速率常數(shù),Ksv為猝滅常數(shù),τ0為不含有猝滅物時熒光分子的平均壽命且生物大分子熒光壽命約為2.80×10-9s[12],[Q]為胭脂紅的濃度,通過F0/F對[Q]線性方程可以計算出Ksv值。觀察圖2可以發(fā)現(xiàn),隨著溫度的升高Ksv值明顯的減小,說明胭脂紅對胰蛋白酶的猝滅屬于形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅[13],具體詳見表1。

2.2 作用力類型的確定

一般情況下,小分子化合物和生物大分子之間的相互作用力主要為氫鍵、范德華力、疏水作用以及靜電引力等[14]。實驗測定了292,298,304K三個溫度下的熒光數(shù)據(jù),胭脂紅與胰蛋白酶結(jié)合反應(yīng)的驅(qū)動力可通過反應(yīng)的焓變ΔH°和熵變ΔS°的大小進行判斷。

表1 不同溫度下胭脂紅與胰蛋白酶作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及各熱力學(xué)參數(shù)Table 1 The quenching constants(KSV), association constants(Ka), number of binding sites(n) and relativethermodynamic parameters for the interaction of ponceau 4R with trypsin at different temperatures

式(3)

ΔG°=ΔH°-TΔS°

式(4)

式(3)中R為氣體常數(shù),由式(3)和式(4)可計算出ΔH°、ΔS°和ΔG°(表1)。從表1可以看出,ΔG°<0,說明該反應(yīng)在實驗條件下是自發(fā)進行的,同時,ΔS°<0、ΔH°<0,說明胭脂紅與胰蛋白酶之間的作用力主要是氫鍵和范德華力。

2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點的確定

為了進一步獲得胭脂素與胰蛋白酶相互作用的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù),可假設(shè)蛋白質(zhì)與藥物之間有n個相同并且獨立的結(jié)合位點,由式(5)[15]來確定:

lg(F0-F)/F=lgKa+nlg[Q]

式(5)

式(5)中Ka為結(jié)合常數(shù),n代表結(jié)合位點數(shù)。以lg[(F0-F)/F]為縱坐標(biāo),lg[Q]為橫坐標(biāo)作圖,根據(jù)斜率和截距可分別求出n和Ka的值(表1)?？梢钥闯?隨著溫度的升高,Ka值不斷降低,說明溫度的升高會降低胭脂紅-胰蛋白酶復(fù)合物的穩(wěn)定性[16]。結(jié)合位點數(shù)分別為1.22,1.07,0.94,即n值近似等于1,表明胭脂紅在胰蛋白酶分子上只有一個結(jié)合位點。

2.4 非輻射能量轉(zhuǎn)移

F?ster能量轉(zhuǎn)移理論[17]指出:當(dāng)供體可以發(fā)射出熒光,它的熒光發(fā)射光譜和受體的紫外吸收光譜有充分的重疊,且二者最大距離不超過8 nm時,很可能會出現(xiàn)供體與受體發(fā)生非輻射能量的現(xiàn)象,導(dǎo)致熒光分子的熒光猝滅。本實驗中,供體(胰蛋白酶的色氨酸)的發(fā)射峰和受體(胭脂紅)的吸收峰有重疊(見圖3)。根據(jù)重疊圖的面積,胰蛋白酶與胭脂紅之間的結(jié)合距離(r)和臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0通過公式(6)～式(8)計算得到:

式(6)

式(7)

式(8)

式中,F0和F分別代表著無/有胭脂紅存在下胰蛋白酶的熒光強度,r是胭脂紅與胰蛋白酶的色氨酸的結(jié)合距離,R0是當(dāng)能量轉(zhuǎn)移效率達50%時的臨界距離,κ2為供體(胰蛋白酶)-受體(胭脂紅)各項隨機分布的取向因子,此處n為介質(zhì)的折射指數(shù),Φ為胰蛋白酶的熒光量子產(chǎn)率,J是胰蛋白酶的熒光發(fā)射光譜和胭脂紅的吸收光譜之間的重疊光譜積分,F(λ)為胰蛋白酶在波長λ處的熒光強度,ε(λ)為胭脂紅在波長λ處的摩爾吸光系數(shù)。在該實驗中,κ2=2/3,n=1.336,Φ=0.118[18],計算得到J=1.29×10-13cm3·L·mol-1,R0=3.91nm,E=0.399和r=4.18nm,可以看出r<8nm,且0.5R0

圖3 胰蛋白酶的熒光發(fā)射光譜(a)與胭脂紅的 紫外可見吸收光譜(b)的重疊圖譜Fig.3 The spectral overlaps of the fluorescence spectrum of trypsin(a)with the absorption spectrum of ponceau 4R(b)注：ctrypsin=cPonceau=2.0×10-6 mol/L。

2.5 胭脂紅對胰蛋白酶構(gòu)象的影響

2.5.1 同步熒光光譜 固定激發(fā)波長與發(fā)射波長的間距Δλ,掃描同步熒光光譜,同步熒光光譜法具有簡化譜圖、干擾少、選擇性高等特點,可以分析在小分子存在下,蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。其中,Δλ=15nm 和60 nm時的同步熒光光譜分別代表的是蛋白質(zhì)中酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基的熒光光譜特征[20]。由圖4可以看出,在實驗條件下,隨著胭脂紅濃度的不斷增加,Tyr(圖4A)和Trp(圖4B)殘基的熒光強度均明顯降低,酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長沒有發(fā)生變化,但色氨酸的最大發(fā)射波長發(fā)生了紅移(284 nm移至286 nm),表明胭脂紅與胰蛋白酶結(jié)合后導(dǎo)致胰蛋白酶上色氨酸殘基所處微環(huán)境的疏水性減小,極性增大[21],引起胰蛋白酶的構(gòu)象變化。

圖4 胭脂紅存在下胰蛋白酶的同步熒光光譜 Fig.4 The synchronous fluorescence spectra of trypsin in the presence of ponceau 4R注：(A)Δλ=15 nm，(B)Δλ=60 nm， Ctrypsin=2.0×10-6 mol/L;cponceau 4R/(×10-6 mol/L), 1～8:0,0.26,0.86,1.29,1.72,2.15,3,圖5同。

2.5.2 胭脂紅對胰蛋白酶紫外吸收光譜的影響 圖5為T=298 K,胰蛋白酶與不同濃度的胭脂紅結(jié)合之后體系的紫外吸收光譜,一般情況下,蛋白質(zhì)分子中的色氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸殘基均有紫外吸收,但是蛋白質(zhì)的吸收波長一般在280 nm附近。由圖4可知,在205 nm附近胰蛋白酶有一個較強的吸收峰,代表的是蛋白質(zhì)中肽鍵的特征峰,能夠反映出蛋白質(zhì)多肽鏈的變化情況。當(dāng)向胰蛋白酶中不斷加入胭脂紅之后,肽鍵特征峰的強度逐漸降低同時產(chǎn)生微弱藍移現(xiàn)象,而且280 nm的吸收峰也出現(xiàn)微弱藍移,說明胭脂紅與胰蛋白酶之間發(fā)生了相互作用,改變了胰蛋白酶的構(gòu)象[22]。

圖5 胭脂紅-胰蛋白酶體系的紫外吸收光譜Fig.5 UV-vis spectra of the ponceau 4R-trypsin system

2.5.3 紅外光譜分析 紅外光譜技術(shù)是一種常用的研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的強有力手段[23]。蛋白質(zhì)紅外光譜的酰氨Ⅰ帶(1700～1600 cm-1)主要是氨基酸殘基的C=O伸縮振動吸收;酰氨Ⅱ帶(1600～1480 cm-1)包含了C-N伸縮振動和N-H變形振動的信息,但對二級結(jié)構(gòu)變化的敏感程度次于酰氨Ⅰ帶[24-25]。圖6為胰蛋白酶與胭脂素結(jié)合前后的紅外光譜圖。從圖中可以看到,胰蛋白酶酰氨Ⅰ帶、酰氨Ⅱ帶的吸收峰分別由1640 cm-1移至1642 cm-1,1550 cm-1移至1553 cm-1,表明胭脂紅與胰蛋白酶發(fā)生了結(jié)合反應(yīng),對胰蛋白酶二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響。

圖6 胭脂紅與胰蛋白酶的紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectra of the ponceau 4R-trypsin system注：ctrypsin=2.0×10-5 mol/L, 胭脂紅∶胰蛋白酶=0∶1(a),5∶1(b)。

2.5.4 圓二色譜分析 胰蛋白酶是光學(xué)活性物質(zhì),本實驗中通過掃描其圓二色譜圖,可以了解其構(gòu)象及各種二級結(jié)構(gòu)的含量。不同濃度的胭脂紅存在下胰蛋白酶的CD光譜如圖7所示,圖中出現(xiàn)一個負峰,位于220 nm,屬于β-sheet特征峰[26]。

表2 胭脂紅對胰蛋白酶二級結(jié)構(gòu)的影響(CD光譜)Table 2 Secondary structure of free trypsin and ponceau 4R-trypsin system(CD spectra)

圖7 不同胭脂紅濃度下胰蛋白酶的圓二色譜Fig.7 CD spectra of trypsin in the presence of increasing amounts of ponceau 4R注：Ctrypsin=2.0×10-6 mol/L, 胭脂紅∶胰蛋白酶=0∶1(1),5∶1(2)，10∶1(3)。

隨著胭脂紅濃度的增加,胰蛋白酶的CD強度減弱,但峰形和峰位均無明顯變化。利用在線Dichroweb軟件計算出胰蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)含量(表2),當(dāng)胭脂紅與胰蛋白酶的摩爾比分別為5∶1和10∶1時,胰蛋白酶的β-turn(β-轉(zhuǎn)角)、和β-sheet(β-折疊)含量減少,而α-helix 和random coil(無規(guī)則卷曲)的含量增加,表明胭脂紅與胰蛋白酶結(jié)合后會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,具體信息詳見表2。

2.5.5 胭脂紅對胰蛋白酶活性的影響 圖8分別顯示加入不同濃度胭脂紅對胰蛋白酶相對活性的影響。從圖中可以看出,隨著胭脂紅濃度的逐漸增加,胰蛋白酶的活性逐漸降低。求得胭脂紅對胰蛋白酶的半抑制濃度IC50為(4.73±0.02)×10-5mol/L(n=3),表明胭脂紅與胰蛋白酶結(jié)合會導(dǎo)致酶部分失活,從而影響其生理功能。

圖8 胭脂紅對胰蛋白酶的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of ponceau 4R on trypsin注：ctrypsin=2.0×10-6 mol/L;cBAEE=5.0×10-3 mol/L。

3 結(jié)論

胭脂紅對胰蛋白酶的熒光猝滅是形成基態(tài)復(fù)合物的靜態(tài)猝滅,氫鍵和范德華力是胭脂素與胰蛋白酶結(jié)合作用的主要驅(qū)動力。且胭脂紅與胰蛋白酶的結(jié)合距離為4.18 nm。胭脂紅降低了胰蛋白酶色氨酸殘基附近微環(huán)境的疏水性,誘導(dǎo)胰蛋白酶的二級構(gòu)象發(fā)生了變化。近年來,由于著色劑等的廣泛使用,對于此類添加劑毒性的研究也日益成為熱點問題。然而,對胭脂紅與人體胃腸道內(nèi)消化酶的研究信息很少,本文是在模擬人體生理酸度下,通過對胭脂紅與胰蛋白酶的結(jié)合作用的光譜學(xué)研究,為了解人工合成著色劑在人體內(nèi)的代謝情況提供了一定理論基礎(chǔ),本研究旨在提供一種體外快速評估著色劑對人體內(nèi)生物大分子結(jié)構(gòu)和功能影響的方法,從而為更好的利用這類著色劑及新著色劑的設(shè)計提供幫助。

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Effect of ponceau 4R on the spectral properties of trypsin

ZHANG Dong-xia

(Department of Applied Statistics and Science,Xijing University,Xi’an 710123,China)

The binding characteristics between ponceau 4R and trypsin was investigated by fluorescence,UV-vis absorption,Fourier transform infrared(FT-IR)and circular dichroism(CD)spectroscopy,to obtain the binding constant,binding sites(n),the types of forces,the binding distance(r)between ponceau 4R and trypsin,and other information. The results showed that ponceau 4R had a strong ability to quench the intrinsic fluorescence of trypsin,the quenching mechanism of trypsin by the ponceau 4R was a static process. The calculated thermodynamic parameters showed that the binding process was primarily driven by hydrogen bonds and van der Waals forces. The binding constant between them was 104orders of magnitude,revealing that ponceau 4R can bind to trypsin with moderate affinity. Moreover,analysis of synchronous fluorescence,UV-vis absorption,Fourier transform infrared(FT-IR)and CD spectra demonstrated that the binding interaction induced the microenvironment changes and conformational alteration of trypsin with increases inα-helix and random coil contents,and reduction ofβ-sheet andβ-turn structures,resulting in partial shrinkage of the polypeptides of protein.

ponceau 4R;trypsin;fluorescence quenching;binding characteristic

2016-04-08

張東霞(1981-),女，碩士,講師,研究方向:電化學(xué)分析,E-mail:zhangdongxia@xijing.edu.cn。

陜西省教育廳科研項目(15JK2184)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)13-0058-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.011