響應面法優(yōu)化連翹總黃酮提取工藝研究

王潤梅，張永芳，劉麗敏，劉 瑞，郭曉鋒

（山西大同大學生命科學學院，山西大同037009）

響應面法優(yōu)化連翹總黃酮提取工藝研究

王潤梅，張永芳，劉麗敏，劉 瑞，郭曉鋒

（山西大同大學生命科學學院，山西大同037009）

利用響應面分析法優(yōu)化連翹總黃酮的提取工藝以得到最佳提取條件。以連翹為原料，采用超聲波輔助有機溶劑乙醇提取總黃酮，對提取溫度、超聲功率和乙醇濃度進行單因素試驗，按照Box-Benhnken的中心組合試驗原理，得出響應面實驗方案和結(jié)果，利用Design-Expert軟件分析結(jié)果，以確定最佳提取條件。最佳提取工藝為溫度57.2℃，超聲功率66.2%，乙醇濃度56.2%。在此條件下，理論提取率為15.08%，驗證值為14.77%。該結(jié)果對于更好地開發(fā)利用連翹總黃酮有重要的實踐意義。

連翹；總黃酮；響應面法；工藝優(yōu)化

連翹(Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl)，系木犀科連翹屬，其果可入藥，是國家三級藥用保護植物，化學成分豐富，如含有黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類等物質(zhì)[1]，具有清熱解毒、消腫散結(jié)等作用，且種植廣泛。其黃酮類物質(zhì)不僅可以清除自由基、抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化，治療高血壓、預防心臟病[2]，在化妝品、食品工業(yè)中也有很重要的價值。國內(nèi)外已有關于連翹葉總黃酮提取的研究，主要采用的方法有超聲波輔助提取、水酶法協(xié)同超聲提取、微波輔助提取等；提取工藝研究所用的方法主要為正交試驗設計[3-4]、均勻設計法[5]。正交法主要處理離散水平值，不能給出整個區(qū)域上的最優(yōu)值，過于理想，在實際應用中具有一定的局限性；均勻設計法只考慮試驗點在試驗范圍內(nèi)的均勻散布，主要針對多因素、多水平。響應面分析法可以對多因素通過多元二次回歸方程尋找最佳條件，試驗設計所得出的結(jié)果更貼合實際,目前已被廣泛的應用于各種生物化工過程的優(yōu)化研究中[6-7]。本實驗采用了超聲波輔助有機溶劑乙醇提取連翹果實總黃酮，通過紫外分光光度法測定其含量。首先對提取溫度、超聲功率和乙醇濃度進行單因素試驗，然后通過響應面法[8]來進行優(yōu)化，確定最佳提取條件，以為連翹總黃酮的研究與開發(fā)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

連翹采摘于山西省沁水縣十里鄉(xiāng)，蘆丁標準品購于上海永葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.1.2 主要儀器設備

SP-754型紫外可見分光光度計（上海博訊實業(yè)有限公司），F(xiàn)A1004萬分之一級電子天平（上海舜宇橫平有限公司），KQ-400KDE型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），XFB-500中藥粉碎機（吉首市中誠制藥機械廠），HC-2062型低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮的提取和測定

將曬干的連翹果實用中藥粉碎機粉碎→過35目篩→取一定量的粉末加乙醇作提取溶劑→在超聲波清洗器中提取一定時間→冷卻后在離心機上3 000 r/min離心10 min→取其上清液→加亞硝酸鈉，放置6 min→加硝酸鋁，放置6 min→加氫氧化鈉，再用乙醇定容至25 mL容量瓶中，放置10 min→在510 nm處用紫外分光光度計測吸光值。

1.2.2 黃酮提取率的計算

黃酮提取率=ncv/1 000 m

式中：c為從回歸方程求得的黃酮的含量(mg/L)，n為提取液稀釋的倍數(shù)，v為提取液的體積（mL），m為連翹的質(zhì)量（g），提取率的單位為mg/g。

1.2.3 蘆丁標準溶液的配制

稱取蘆丁標準品5 mg于100 mL燒杯中，用少量60%乙醇溶解后倒入25 mL容量瓶中，反復沖洗燒杯，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，即可得到0.2 mg/mL的蘆丁標準品溶液。量取蘆丁標準品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于25 mL容量瓶中，分別取5 mL 60%乙醇溶液、5%亞硝酸鈉0.3 mL分別于容量瓶中，混勻后靜置6 min，加入10%的硝酸鋁0.3 mL，混勻再靜置6 min，再加入4 mL 4%的氫氧化鈉，60%乙醇定容至25 mL，搖勻放置10 min，以蘆丁含量為0的相應溶液作空白對照，在510 nm處測定各溶液的吸光值。

1.2.4 單因素試驗設計

以連翹總黃酮提取率為指標，研究提取時間、超聲功率和乙醇濃度對連翹總黃酮提取率的影響。

1）提取溫度：稱取5份經(jīng)粉碎過35目篩的連翹粉末250 mg,于100 mL燒杯中用60%乙醇溶解后倒入15 mL刻度試管中，按料液比1∶30加入60%的乙醇，在60%超聲功率條件下，分別在溫度為40、50、60、70、80℃的超聲波清洗儀中，提取40 min。

2）超聲功率：稱取5份經(jīng)粉碎過35目篩的連翹粉末250 mg，于100 mL燒杯中用60%乙醇溶解后倒入15 mL刻度試管中，按料液比1∶30加入60%乙醇，在溫度40℃的條件下，分別在30%、40%、50%、60%、70%的超聲功率下超聲提取40 min。

3）乙醇濃度：稱取5份經(jīng)粉碎過35目篩的連翹粉末250 mg，于100 mL燒杯中用乙醇溶解后倒入15 mL刻度試管中，在料液比1∶30及溫度40℃的條件下，分別加入40%、50%、60%、70%、80%濃度的乙醇，60%功率超聲提取40 min。

1.2.5 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取3個對黃酮提取率有影響的因素為自變量，分別為提取溫度（A）、超聲功率（B）、和乙醇濃度（C），每個變量各取3個水平，分別為低、中、高，以-1、0、1進行編碼，以黃酮提取率為考察目標，運用Design-Expert軟件進行響應面實驗設計，設計出響應面實驗方案，并對實驗結(jié)果進行數(shù)模分析和優(yōu)化以確定連翹總黃酮的最佳提取工藝條件。根據(jù)中心組合試驗設計原理（Box-Behnken），確定響應面試驗方案，試驗設計因素及水平見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

用x軸表示蘆丁濃度C（mg/mL），y軸表示吸光度（A），制作兩者關系曲線，結(jié)果見圖1。回歸方程A=7.464 3 C-0.002 3，r=0.999 8。圖中顯示標準品蘆丁在0.008～0.04 mg/mL呈很好的線性對應關系。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 溫度對連翹中黃酮提取率的影響

考查提取溫度對樣品黃酮提取率的影響見圖4。可知當溫度低于50℃時，隨著溫度的升高和反應的進行，使更多的黃酮類物質(zhì)及其分解物滲透到試劑中，從而提取率呈上升趨勢；但是當溫度高于50℃后，乙醇就會蒸發(fā)，濃度相對升高，使得細胞壁中纖維素成分以及細胞中抗氧化活性物質(zhì)成分易被破壞，多糖、淀粉、脂肪酸、纖維素等雜質(zhì)的溶出量增加，而黃酮類化合物因發(fā)生了水解或其他反應，其溶出也會減少，從而使得提取率下降。見圖2。

圖2 提取溫度對黃酮提取率的影響

2.2.2 超聲功率對連翹中黃酮提取率的影響

考查超聲功率對樣品黃酮提取率的影響見圖3。可知當超聲功率小于60%時，隨著超聲功率的增加，黃酮類物質(zhì)的提取率也隨之增加，但超聲功率大于60%之后，一方面，植物細胞因震動過速而受到破壞，使得一些物質(zhì)如多糖、淀粉、脂肪酸、纖維素等的溶解率增加；另一方面，超聲功率的增加，儀器內(nèi)部溫度會升高，黃酮類物質(zhì)可能因與其它物質(zhì)發(fā)生了反應析出減少，提取率下降。

圖3 超聲功率對黃酮提取率的影響

2.2.3 乙醇濃度對連翹中黃酮提取率的影響

考查乙醇濃度對樣品黃酮提取率的影響見圖4?？芍顑?yōu)水平為60%，而在其兩側(cè)的濃度范圍內(nèi)都是呈單向上升或下降的。這可能是因為乙醇濃度越大，極性越小，黃酮類物質(zhì)極性越大析出越多，在一定乙醇濃度范圍內(nèi)使其提取率越上升；但是當乙醇濃度超出一定范圍時，一方面，多余的乙醇會和黃酮類物質(zhì)發(fā)生一定的反應，另一方面，乙醇極性也會增大，不利于黃酮類物質(zhì)的溶解析出，故提取率呈下降趨勢。

圖4 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

2.3 響應面法優(yōu)化實驗結(jié)果與分析

2.3.1 響應面分析因素水平的確立

依單因素的試驗結(jié)果，對黃酮提取率進行考察，運用Design expert7.0軟件程序，采用3因素3水平的響應面分析方法，按照1.2.5試驗方案，根據(jù)中心組合試驗設計原理（Box-Behnken），最終獲得響應面試驗方案，試驗設計因素及水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平

2.3.2 響應面分析實驗設計方案及結(jié)果

以提取溫度（A）、超聲功率（B）和乙醇濃度（C）為自變量，以黃酮提取率為響應值（Y），應用Design-Expert軟件對試驗結(jié)果進行分析，試驗方案及數(shù)模分析結(jié)果見表2。

表2 響應面分析方案及試驗結(jié)果

2.3.3 多元二次響應面回歸模型的建立和分析

利用Design-Expert軟件對表2的結(jié)果進行響應面分析，擬合3個因子最終構建多元二次響應面回歸模型：

Y=15.07+0.095A+0.26+0.13C+0.44AB+0.047AC+0.13BC-1.20A2-1.72B2-1.45C2。為檢驗模型的有效性，對該模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 二次響應面回歸模型方差分析

從表3可知，二次響應面模型為顯著模型（P＜0.001），且通過P值可知模型中變量C、A2、B2、C2對Y值的影響非常顯著，說明試驗因子與響應值不是簡單的線性關系，二次項對響應值也有很大關系，交互作用的影響相對較小，這和模型回歸中的線性和平方項影響顯著相對應。

從表3中還可以看出，影響連翹中黃酮提取率的各因素按影響大小排列順序依次為B（超聲功率）、C（乙醇濃度）、A（提取溫度）。該模型是顯著的（P ＜ 0.001），方程中C、A2、B2、C2對Y值的影響非常顯著，表明試驗因子對響應值不是簡單的線性關系，二次項對響應值也有很大關系，交互作用的影響相對較小，這和模型回歸中的線性和平方項影響顯著相對應。

從表3中還可以看出，影響連翹中黃酮提取率的各因素按影響大小排列順序依次為B（超聲功率）、C（乙醇濃度）、A（提取溫度）。

2.3.4 曲面圖和等高值線圖的分析

為了進一步探究提取溫度、超聲功率、乙醇濃度的交互作用對Y響應值的影響，利用Design-Expert軟件繪制等高值線圖和三維響應面曲面圖，見圖5～7。由圖可知，A、B、C對Y影響大小，由等高線圖得到最優(yōu)條件下各因子的取值決定。圖5表示在提取時間為40 min，超聲功率為60%情況下，提取溫度和超聲功率之間的交互作用響應面圖，圖6表示在提取時間為40 min，超聲功率為60%情況下，提取溫度和乙醇濃度之間的交互作用響應面圖，圖7表示在提取時間為40 min，超聲功率為60%情況下，超聲功率和乙醇濃度之間的交互作用響應面圖。

圖5 提取溫度和超聲功率對黃酮提取率影響的響應面圖

圖6 提取溫度和乙醇濃度對黃酮提取率的響應面圖

圖7 超聲功率和乙醇濃度對黃酮提取率的響應面圖

由于橢圓和線間疏密程度反映了2變量交互作用的大小，橢圓形和線間距離越密，則表示交互作用大，橢反之越??；同理，曲面傾斜程度越大，交互作用亦大，反之則小。結(jié)合圖及P值分析可知，A、B、C間對響應值均有交互作用，其中B（超聲功率）、C（乙醇濃度）的交互作用較為明顯。

2.3.5 最佳提取條件的確定

由響應面法分析數(shù)據(jù)可得出連翹中黃酮最佳提取工藝為：溫度57.2℃，超聲功率66.2%，乙醇濃度56.2%，理論最佳提取率為15.08%。通過3次驗證試驗，求得平均值為14.77%，該值與理論值相差0.3%，在誤差允許范圍內(nèi)，說明響應面法優(yōu)化連翹中黃酮提取工藝可在實際應用中應用。

3 結(jié)論

通過對提取時間、超聲功率和乙醇濃度的單因素實驗，篩選出對連翹總黃酮提取率影響較大的3個因素：溫度、超聲功率、乙醇濃度；在此基礎上，以連翹總黃酮提取率為響應值，選3個因素為自變量水平，用Design-Expert軟件處理并最終確定連翹中黃酮類成分最佳提取工藝為：溫度57.2℃，超聲功率66.2%，乙醇濃度56.2%。響應面分析法巧妙地規(guī)避了正交設計的缺陷，可以對各個因素進行更加全面、細致的分析，研究各個因素之間的相互關系，可以比較準確地分析出因素間的最佳組合，比正交設計更直觀、理想。

[1]段文娟,耿巖玲,祝賀,等.中藥連翹化學成分和分析方法的研究進展[J].山東科學,2010,23(2)：33-37.

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Optimization of Extraction for Total Flavonoids in Forsythia Suspensa by Response Surface Methodology

WANG Run-mei，ZHANG Yong-fang，LIU Li-min，LIU Rui，GUO Xiao-feng
(School of Life Science,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009)

Response surface analysis methodology was used to optimize the extraction technology of total flavonoids from Forsythia suspensa in order to get the best extraction conditions.The total flavonoids were extracted by organic solvents ethanol ultrasound-assisted method with Forsythia suspensa.Temperature,ultrasonic power and ethanol concentration were selectded to do the single factor,experiment.According to the principle of the Box-Benhnken,response surface methdology was employed to determine the response surface experimental program and make the response surface results.Finally the best extraction conditions were determined by the Design-Expert analysis software program.Optimal extraction conditions were as follows：temperature of 57.2 ℃,ultrasonic power of 66.2%,ethanol concentration of 56.2%,Under such conditions,the extraction rate was 15.08%and verifier of optimal extraction yield was 14.77%.The result was of important practical significance for the further development and application.

forsythia suspensa；total flavonoids；response surface methodology；optimization

R284.2

A

1674-0874(2017)02-0050-05

〔責任編輯 楊德兵〕

2016-10-23

山西大同大學青年研究項目[同大科字20138號]。

王潤梅（1963-），女，山西大同人，碩士,教授，研究方向：生物化學。