氣相色譜-質(zhì)譜用于2型糖尿病患者血清代謝特征研究

谷 艷，臧 鵬，李 吉，呂海珍

（1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同037009；2.大同市第三人民醫(yī)院，山西大同037009）

氣相色譜-質(zhì)譜用于2型糖尿病患者血清代謝特征研究

谷 艷1，臧 鵬2，李 吉1，呂海珍1

（1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同037009；2.大同市第三人民醫(yī)院，山西大同037009）

目的研究2型糖尿病患者的血清代謝特征。方法采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）聯(lián)用技術(shù)對健康人及2型糖尿病患者的血清代謝物譜進(jìn)行分析測定。對采集的圖譜進(jìn)行峰提取、峰匹配和過濾后，采用SIMCA-P 11.0軟件及SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果2型糖尿病患者與健康人的血清代謝物譜之間存在明顯差異,偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）得分散點(diǎn)圖中疾病組與健康對照組得到了良好區(qū)分；單元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病組與健康對照組間共有22個(gè)變量存在著顯著性差異，主要涉及糖代謝、脂代謝及氨基酸代謝。在糖類代謝物中，葡萄糖、半乳糖含量在糖尿病患者血清中明顯高于正常對照組；在脂類代謝物中，甘油和游離脂肪酸（FFA C16：0、FFA C18：1、FFA C18：2）含量高于正常對照組；氨基酸類代謝物中，纈氨酸及其代謝物2-酮戊二酸、亮氨酸、異亮氨酸以及代謝物2-酮異己酸的濃度較正常組顯著升高，而甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺的濃度顯著降低。結(jié)論2型糖尿病患者的血清代謝譜發(fā)生了明顯改變，差異代謝物的紊亂反映了糖尿病狀態(tài)下糖、脂、氨基酸代謝途徑的改變，這些代謝物在2型糖尿病的發(fā)病過程中可能具有重要的病理意義，同時(shí)也為臨床診斷提供了依據(jù)。

2型糖尿??；氣相色譜；質(zhì)譜；代謝組學(xué)

糖尿病是一組由遺傳和環(huán)境等多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，主要有1型糖尿病、2型糖尿病、其他特殊類型糖尿病及妊娠型糖尿病4種類型。其中，2型糖尿病占糖尿病患者總數(shù)的90%以上。目前，我國的糖尿病發(fā)病率進(jìn)入快速增長階段[1]，長期高血糖可導(dǎo)致全身組織器官出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，極大地影響患者的生活質(zhì)量。因此，對于2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制及其藥物治療一直是醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)[2-7]。本研究利用GC/MS技術(shù)對2型糖尿病患者血清樣本進(jìn)行代謝指紋分析，采用多元統(tǒng)計(jì)分析對樣本進(jìn)行模式識別，分析健康對照組及2型糖尿病組的血清代謝譜差異；找到影響2型糖尿病患者體內(nèi)代謝改變的差異代謝物及其相關(guān)代謝途徑，為今后深入研究2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程及病理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 研究對象與材料儀器

研究對象：初診2型糖尿病病人36例，正常人40例血清樣本來自大同市第三人民醫(yī)院。根據(jù)世界衛(wèi)生組織對糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn),2型糖尿病空腹血糖≥7.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L,而正常糖耐量為空腹血糖＜5.6 mmol/L。

甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）；甲氧胺鹽酸鹽、吡啶、N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）（美國Sigma公司）。

Agilent 7890A氣相色譜儀（美國Agilent公司）；Agilent 5975C質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；Biofuge Stratos低溫高速離心機(jī)（德國Thermo公司）；Labconco 4.5 L臺式真空冷凍干燥機(jī)（美國Labconco公司）。

1.2 GC/MS實(shí)驗(yàn)

1.2.1 血清樣品處理

血清樣品于4°C下解凍。取100 μL血清，加入300 μL甲醇，渦旋混合30 s，15 000 r/min離心 20 min。取上清液350 μL，10 °C下真空冷凍干燥。殘?jiān)?5 μL甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液（20 mg/mL），40°C水浴反應(yīng)1.5 h，再加入65 μL MSTFA，混勻后40°C水浴反應(yīng)1 h。反應(yīng)后的溶液直接進(jìn)行GC/MS分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：HP-5熔融石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm i.d.，0.25 μm，J＆W Scientific,美國），氦氣作載氣,流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為300°C，分流比為10∶1，進(jìn)樣量為1 μL。程序升溫：起始溫度為60 °C，保持3 min，以3°C/min的速度升至200 °C，最后以15°C/min的速度升至320°C，保持5 min。

1.2.3 質(zhì)譜條件

用電子轟擊離子源（EI），傳輸線溫度280°，離子源溫度230°，檢測器電壓1.46 kV，四級桿溫度150°，掃描范圍33～500 amu。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用XCMS軟件進(jìn)行色譜峰的匹配和識別，得到由保留時(shí)間、質(zhì)荷比以及峰面積構(gòu)成的峰表。采用80%規(guī)則對峰表進(jìn)行信號過濾，經(jīng)過預(yù)處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 11.0軟件進(jìn)行模式識別。單變量分析使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2.5 差異代謝物鑒定

將實(shí)驗(yàn)得到的差異代謝物的質(zhì)譜圖與NIST標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫進(jìn)行比對，定性過程由儀器工作站完成。相似度大于75%的代謝物被認(rèn)為定性結(jié)果可靠。

2 結(jié)果與討論

2.1 2型糖尿病組及健康對照組血清GC/MS分析的總離子流色譜圖

對血清樣本進(jìn)行代謝特征分析時(shí)，每隔10個(gè)樣本隨行制備分析1個(gè)QC樣品（QC是將所有血清樣品，取等體積混合后得到的溶液），通過檢測QC樣本的偏差來檢測整個(gè)分析過程的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，保留時(shí)間及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于20%，表明在樣品分析的整個(gè)過程中系統(tǒng)的穩(wěn)定性良好，所得數(shù)據(jù)可信。

采用GC/MS平臺分別采集健康對照組和2型糖尿病組的血清代謝物譜信息，血清樣品的典型總離子流色譜圖見圖1。

圖1 血清樣品的典型GC/MS總離子流色譜圖

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

多元統(tǒng)計(jì)分析是在最大程度保留原始信息的基礎(chǔ)上將多維數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化和降維，通過建立可靠的數(shù)學(xué)模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行概括與圖示化表征[8]。本實(shí)驗(yàn)利用多元統(tǒng)計(jì)分析中的偏最小二乘法-判別分析（PLD-SA）進(jìn)行多變量模式識別，通過去除與樣本分類無關(guān)的信息，從而對2組樣品的代謝物譜進(jìn)行區(qū)分。由PLS-DA得分圖（圖2）可知，2型糖尿病組與正常對照組在第一主成分方向上得到了顯著的區(qū)分，模型參數(shù)R2Y=0.76，Q2=0.69，證實(shí)了模型的可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2型糖尿病組與正常對照組的血清代謝物譜存在著差異，患者的代謝物水平發(fā)生了變化。

2.3 單變量分析

將2組獲得的代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行Student t檢驗(yàn)，在正常組與2型糖尿病組間共有22個(gè)變量存在著顯著性差異，經(jīng)譜庫檢索，共有19個(gè)變量被鑒定（表1）。由表1可知，2型糖尿病患者體內(nèi)的糖、脂、氨基酸代謝均發(fā)生了紊亂，表現(xiàn)為在糖類代謝物中，葡萄糖、半乳糖的含量顯著高于正常對照組；在脂代謝中，甘油和游離脂肪酸（FFA C16：0、FFA C18：1、FFA C18：2）的含量明顯高于正常對照組；在氨基酸代謝中，纈氨酸及其代謝物2-酮戊二酸、亮氨酸、異亮氨酸以及代謝物2-酮異己酸的濃度較正常組顯著升高，而甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和天冬酰胺的濃度較正常組顯著降低。這些代謝物的改變說明2型糖尿病患者在糖、脂和氨基酸代謝途徑上存在著顯著的代謝紊亂，因此，三羧酸循環(huán)這一代謝中心的的動(dòng)態(tài)平衡也被打破，表現(xiàn)為2-酮戊二酸的濃度異常增高。

圖2 基于2型糖尿病與健康人血清代謝譜的PLS-DA得分圖

表1 2型糖尿病患者血清中的差異代謝物

3 結(jié)論

本研究采用基于GC/MS平臺的代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析，探討了2型糖尿病患者血清的代謝指紋圖譜變化情況。結(jié)果表明，2型糖尿病患者的血清代謝譜與正常對照組相比發(fā)生了顯著變化，多種代謝物水平發(fā)生了明顯改變。本文以代謝組學(xué)平臺研究了2型糖尿病的代謝狀況，發(fā)現(xiàn)了多種紊亂的代謝途徑，從而可為深入研究2型糖尿病的發(fā)病原因提供參考，也為疾病研究提供了一種新的有效平臺。

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Serum Metabonomics Study on Type 2 Diabetes by Using Gas Chromatography/Mass Spectrometry

GU Yan1，ZANG Peng2，LI Ji1，LU Hai-zhen1
(1.School of Medicine,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009；2.Datong Third People’s Hospital,Datong Shanxi,037009)

ObjectiveTo investigate the serum metabolic characteristics of type 2 diabetes patients.MethodsThe serum metabolic profiles of healthy controls and type 2 diabetes patients were determined by using gas chromatography coupled with mass spectrometry(GC/MS).Firstly,obtained raw chromatograms were processed by peak extraction,peak match and filtration.Secondly,the data were analyzed through the SIMCA-P 11.0 software and SPSS13.0 software.ResultsThere were obvious metabolic differences between type 2 diabetes and healthy controls.The scores plot by PLS-DA showed that the type 2 diabetes group was distinctly differentiated with the healthy controls.By using univariate data analysis,22 variables had significant differences between the two groups,and these metabolites variations are related to the dysfunctions in glucose metabolism,lipid metabolism and amino acid metabolism.Compared with the healthy controls,the type 2 diabetes group showed elevated serum concentrations of valine,2-ketoisovalerate,2-ketoisocaproate,leucine,isoleucine,2-hydroxybutyrate,2-ketoglutarate,galactose,glucose,FFA C16：0,FFA C18：2,FFA C18：1 and glycerol,but decreased levels of glycine,tryptophan,serine,threonine,phenylalanine and asparagine.ConclusionsThe results revealed that type 2 diabetes patients presented perturbations in glucose metabolism,lipid metabolism and amino acid metabolism.This study was helpful for revealing the complex pathological mechanism in type 2 diabetes and providing a basis for clinical diagnosis.

type 2 diabetes；gas chromatography；mass spectrometry；metabonomics

R587.1

A

1674-0874(2017)02-0033-03

〔責(zé)任編輯 楊德兵〕

2017-02-23

山西大同大學(xué)博士基金項(xiàng)目[2013-25]

谷艷（1981-），女，山西大同人，博士，講師，研究方向：代謝組學(xué)技術(shù)用于疾病治療藥性的機(jī)理研究。