采用定量參數(shù)校正因子法測定5種喹諾酮藥物的含量

李 偉，李慧敏

（1.湖南師范大學附屬岳陽醫(yī)院，岳陽 414000；2.岳陽市食品藥品檢驗所，岳陽 414000）

采用定量參數(shù)校正因子法測定5種喹諾酮藥物的含量

李 偉1，李慧敏2

（1.湖南師范大學附屬岳陽醫(yī)院，岳陽 414000；2.岳陽市食品藥品檢驗所，岳陽 414000）

目的：建立定量參數(shù)校正因子用于五種喹諾酮藥物含量測定的方法。方法：采用HPLC法測定，用Phenomenex C18（150mm×4.6mm，5μm）、DIKMA C18（150mm×4.6mm，5μm）和Alltima（150mm×4.6mm，5μm）三根色譜柱，柱溫25℃；流動相為0.2mol·L-1枸櫞酸溶液-甲醇-乙腈（84：12：4）；流速為1.0m L·min-1；檢測波長為319nm。以氟羅沙星或洛美沙星為參比物的定量參數(shù)校正因子法計算樣品含量。結果：在三根不同的C18柱上相鄰峰間的分離度均大于2.9，五種藥物在25～250μg·mL-1線性關系良好，定量參數(shù)校正因子計算含量與法定方法測定的含量結果比較，經(jīng)t檢驗，無顯著性差異。結論：本方法快速、準確，只需采用氟羅沙星或洛美沙星為對照品即可同時測定五種喹諾酮藥物的含量。

定量參數(shù)校正因子；喹諾酮；高效液相色譜法

依諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氟羅沙星和洛美沙星是常見的喹諾酮類藥物，均被中國藥典2015年版［1］收載。其制劑均采用HPLC法進行含量測定，但分別采用不同的流動相系統(tǒng)。為了檢測方便，我們考慮采用同一流動相和檢測波長，以某一種物質(zhì)為參比物的參數(shù)校正因子法［1-4］來測定5種喹諾酮藥物的含量。經(jīng)參考相關文獻［5-8］并改進，我們發(fā)現(xiàn)可以只需氟羅沙星對照品或洛美沙星為對照品，采用一種流動相即可進行五種喹諾酮藥物的含量測定，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試藥Waters高效液相色譜儀，含1525泵系統(tǒng)、2996 DAD檢測器（美國Waters公司）；METTLER AE240型電子天平（德國梅特勒公司，精密度十萬分之一）；氟羅沙星對照品編號為130458-200301，含量99.1%；洛美沙星對照品編號為0452-200001，含量90.0%；依諾沙星對照品編號為0452-9901，含量91.1%；諾氟沙星對照品編號為130450-200304，含量97.8%；環(huán)丙沙星對照品編號為30451-200302，含量84.9%，以上對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。試驗樣品為市售的不同廠家批號的喹諾酮藥物31批；甲醇、乙腈均為色譜純；其余試劑均為分析純；水為去離子水。

1.2 定量參數(shù)校正因子的建立

1.2.1 色譜條件色譜柱：（1）Phenomenex C18柱（150mm ×4.6mm，5μm）；（2）DIKMA C18（150mm×4.6mm，5μm）；（3）Alltima（150mm×4.6mm，5μm）；柱溫：25℃；流動相：0.2mol·L-1枸櫞酸溶液-甲醇-乙腈（84：12：4）；流速：1.0m L·min-1；檢測波長：DAD檢測器掃描范圍220～400nm；進樣量：10μL。各品種理論板數(shù)均大于6000，各蜂之間的分離度均大于2.9。

1.2.2 測定波長的選擇提取各對照品溶液的光譜圖，見圖1?？芍_沙星、依諾沙星、諾氟沙星、洛美沙星均在315～325間有次最大吸收且吸收峰較最大吸收峰曲線更平緩，依諾沙星在此區(qū)間吸收曲線也較平緩，波長變化帶來的誤差更小些，兼顧5個品種A/C值（單位濃度的峰面積）變化最小的波長區(qū)域，最后選擇319nm作為測定波長。

1.2.3 定量參數(shù)校正因子的計算精密稱取5種對照品適量加流動相配制成每種對照品濃度約為0.1mg·m L-1的混合溶液，平行做2份。吸取對照品溶液10μL，照“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖2。提取315、317、319、321、323及325nm六個通道的色譜圖，計算5個品種在6個波長處單位濃度的峰面積（E），E=A/C，并以其中RSD最小的連續(xù)3個波長處（如317 nm、319nm、321nm）的E值的平均值作為該品種的E值（折中各品種選擇的RSD最小的連續(xù)3個波長，選出一致的連續(xù)3個波長）。分別計算各品種相對于兩種參比物的校正因子（f），f=E待測/E參比。

圖1 各對照品溶液紫外光譜圖

圖2 混合對照品溶液色譜

圖3 樣品溶液色譜圖

通過考察三根不同色譜柱，均得出最佳波長段選為317 nm、319nm、321nm。以選定的三個連續(xù)波長的平均E值計算，分別以氟羅沙星、洛美沙星為參比物，計算各品種相對于參比物的校正因子f，結果見表1。

2 結果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗色譜柱：DIKMA C18（150mm×4.6mm，5μm）；柱溫：25℃；流動相：0.2mol·L-1枸櫞酸溶液-甲醇-乙腈（84：12：4）；流速：1.0m L．min-1；檢測波長：319nm；進樣量：10μL。

2.2 線性關系的考察精密稱取氟羅沙星對照品12.31mg，依諾沙星對照品 13.85mg，諾氟沙星對照品12.42mg，環(huán)丙沙星對照品14.06mg，洛美沙星對照品14.69mg置50m L容量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液5m L和流動相5mL超聲溶解，用流動相稀釋至刻度，再分別精密量取10mL置25mL量瓶中，15mL、10mL、5mL置50m L量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取10uL注入色譜儀，以峰面積A對濃度C（μg·mL-1）進行線性回歸，回歸方程分別為：

A=2.1517×104C-3.1061×104r=1.000（n=5），線性范圍為24.4～244μg·mL-1氟羅沙星

A=1.9692×104C-2.9125×104r=0.9999（n=5），線性范圍為25.2～252μg·mL-1依諾沙星

A=2.0124×104C-9.0741×103r=0.9999（n=5），線性范圍為24.3～243μg·mL-1諾氟沙星

A=2.1048×104C-7.2909×104r=0.9999（n=5），線性范圍為23.9～239μg·mL-1環(huán)丙沙星

表1 各品種f值計算結果

A=2.2322×104C-4.0878×104r=1.000（n=5），線性范圍為26.4～264μg·mL-1洛美沙星

2.3 精密度試驗照樣品含量測定項下方法配置的溶液，重復進樣6次，測定峰面積，結果（n=6）氟羅沙星RSD=0.26%，依諾沙星RSD=1.18%，諾氟沙星RSD=0.77%，環(huán)丙沙星RSD=0.49%，洛美沙星RSD=0.18%。

2.4 穩(wěn)定性考察取同一樣品溶液于0，2，4，6，8，12，24h測定峰面積，結果氟羅沙星RSD=0.54%，依諾沙星RSD=0.71%，諾氟沙星RSD=1.01%，環(huán)丙沙星RSD=0.62%，洛美沙星RSD=0.38%，表明在24h內(nèi)被測物溶液穩(wěn)定。

2.5 重復性試驗取同一樣品6份，按含量測定項下的方法測定，結果RSD=1.1%，結果表明，該方法重復性好。

2.6 回收試驗分別取研細的洛美沙星膠囊#1號樣品各6份，每份約0.5粒（約含洛美沙星50mg），精密稱定，相應加入約含50mg的洛美沙星對照品，按4.2項下的樣品提取方法測定，分別用f1（氟羅沙星）和f2（洛美沙星）計算，回收率結果見表2。

表2 加樣回收率實驗（n=6）

2.7 耐受性考察分別在柱溫25、30℃下測定同一批供試品（洛美沙星膠囊#1號）含量，平行測定2份，結果供試品含量無顯著性差異。另外分別提取318、319、320nm波長處的峰面積計算，結果含量無顯著差異。

2.8 樣品含量測定

2.8.1 對照品溶液的制備精密稱取氟羅沙星對照品25.26mg，洛美沙星對照品 28.30mg置50mL容量瓶中，加流動相超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取10mL置50mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。

2.8.2 供試品溶液的制備①片劑、膠囊劑：分別取各品種重量（裝量）差異項下的樣品，研細，精密稱取相當于1片（粒）重的樣品，置100mL容量瓶中，加流動相或0.1mol/L鹽酸溶液（依諾沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星制劑）適量溶解后，加流動相稀釋至刻度，搖勻。再用流動相稀釋至約0.1mg·m L-1，搖勻，即得。②滴眼液、注射液：精密量取注射液適量（滴眼液直接取1支），用流動相稀釋至約0.1mg·mL-1，搖勻，即得。

2.8.3 樣品測定照3.1項下色譜條件進樣，測定峰面積。用表1中相應的f值參與計算，并將結果與現(xiàn)行的法定方法測得的結果進行比較，以氟羅沙星校正因子計算的含量和以洛美沙星校正因子計算的含量分別與法定方法測定結果進行t檢驗，計算t值分別3.3406和4.1702（n=30），df=n-1=29，查t分布的雙側臨界（ta/2）值表為2.756（a=0.01），t ＞ ta/2，無顯著性差異（P＞0.01）。結果見表2。

3 討論

3.1 流動相的選擇喹諾酮類化合物多為兩性化合物，具胺基和羥基，能在酸性和堿性溶液中溶解。我們比較了文獻［4～6］報道的流動相有乙腈-0.05 mol·L-1檸檬酸溶液（20∶80），0.05 mol·L-1枸櫞酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH至4.0）-乙腈（87∶13）及三乙胺磷酸溶液（取三乙胺5ml與磷酸7ml，加水至1000ml）-乙腈（82∶18），經(jīng)摸索用0.2mol·L-1枸櫞酸溶液-甲醇-乙腈（84∶12∶4）作為流動相，可以同時分離以上5種喹諾酮化合物，且無須調(diào)pH值，操作更簡單、方便。

3.2 不同色譜柱的比較在選定的色譜條件下，我們盡量使用150mm的短柱，分別采用Phenomenex C18（150mm ×4.6mm，5μm）、DIKMA C18（150mm×4.6mm，5μm）和Alltima（150mm×4.6mm，5μm）均獲得了滿意的效果，在不同色譜柱上出峰順序一致，均為氟羅沙星、依諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星，最后一個組分洛美沙星的保留時間分別在26.932、26.409和37.778分鐘，分析時間較適中。且峰對稱因子均在1.17～1.50之間，各峰之間的分離度均大于2.9，理論板數(shù)均不低于6000。

3.3 與其他定性檢測方法的比較用于這5種喹諾酮藥物制劑的檢測方法現(xiàn)有高效液相色譜法［5～8］、紫外分光光度法［8～10］、化學熒光法［11］，但高效液相色譜法操作比化學熒光法相對比較簡便，而且比紫外分光光度法的檢出限低。本文采用的定量參數(shù)校正因子方法能迅速地同時進行5種喹諾酮化合物的定量分析，且只需氟羅沙星、洛美沙星兩種對照品，大大簡化了其含量測定的操作過程，本法準確、簡便，可同時用于依諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氟羅沙星和洛美沙星片劑、膠囊劑、滴眼液的含量測定。

表3 兩種方法測定結果的比較

3.4 方法建立的宗旨本文借鑒中藥“一測多評”思維采用定量參數(shù)校正因子測定性質(zhì)相似的同類化學藥物也是今后檢測趨勢的一種嘗試和探討，此外，對照品的生產(chǎn)和標化都是非常寶貴的而且有時斷貨買不到，減少對照品的使用有利于節(jié)能環(huán)保，但需要提出的是，出具公正性報告仍要采用權威標準收錄的法定方法。

［1］ 張坤, 徐瑾, 陳正收, 等. 高效液相色譜校正因子法測定苦碟子提取物中5種主要成分的含量［J］. 中南藥學, 2011, 8 (9) : 577-580.

［2］ 朱靜毅, 李靜, 聞琍毓, 等. 校正因子法同時測定非洛地平及其片劑中的三個雜質(zhì)［J］. 藥物分析雜志, 2014, 34 (2) : 281-286.

［3］ 王智民, 高慧敏, 付雪濤, 等. “一測多評”法中藥質(zhì)量評價模式方法學研究［J］. 中國中藥雜志, 1911, 31 (23) : 1925-1928.

［4］ 袁曉芳, 張舒. 校正因子法測定香蓮丸中生物堿的含量［J］. 今日藥學, 2014, 24 (12) : 875-878.

［5］ 中國藥典［S］. 二部, 2015: 892; 1097; 1292; 1763; 1902.

［6］ 國家食品藥品監(jiān)督管理局. 鹽酸洛美沙星膠囊標準［Z］. WS1-(X-490) -2003Z.

［7］ 黃榕珍, 修虹, 陳水專. 高效液相色譜法測定依諾沙星膠囊的含量［J］. 海峽藥學, 2000, 12 (4) : 26.

［8］ 陶玉龍, 敖登高娃, 劉惠民. 依諾沙星的鋁敏化紫外分光光度法［J］.藥物分析雜志, 2005, 25 (10) : 1241.

［9］ 李紅衛(wèi), 駱勤. 交點倍數(shù)法測定復方環(huán)丙沙星滴耳液中兩組分的含量［J］. 中國藥房, 2003 14 (5) : 302-303.

［10］ 李錦木焱. 雙波長分光光度法測定氟羅沙星地塞米松滴眼液的含量［J］. 中華中西醫(yī)雜志, 2004, 5 (12) : 1107.

［11］ 馮瑞琴, 丁芬, 劉昱等. 鋅 (Ⅱ) -氟羅沙星光化學熒光法測定藥物制劑中的氟羅沙星［J］. 光譜學與光譜分析2005 25 (9) : 1468-1470.

To determ ine the content of five quinolones by using rectifying factors of Quantity parameters

Li Wei1, Li Hui-min2
(1. Second People’s Hospital of Yueyang, Yueyang 414000, China; 2. Yueyang Institute of Drug Quality Control, Yueyang 414000, China)

Objective To establish the determination method of five quinolones by using rectify factors of quantity parameters. M ethod HPLC was used. columns are Phenomenex C18(150mm×4.6mm, 5μm) 、DIKMA C18(150mm×4.6mm, 5μm) and Alltima (150mm×4.6mm, 5μm); Column temperature was 25℃; the mobile phase was 0.2mol·L-1citrate–［methanolacetonitrile (3: 1) ］84: 16; flow velocity was 1.0 mL·min-1; detective wavelength was 319nm. fleroxacin or lomefloxacin was chosen as reference material to calculate the sample content by the method of rectifying factors of Quantity parameters. Results On the three C18 columns, the resolutions were beyond 2.9, The linear range of five quinolones were 25ug·mL-1～250ug·mL-1 . Conclusion This method is quick and accurate. just by chosing fleroxacin or lomefloxacin as reference material, It can be used to deterimine the content of the five quinolones at the same time,

rectify factor; quantity parameter; quinolones; HPLC

R927

A

1673-016X（2017）04-0189-04

2017-03-10

李偉，E-mail：178484526@qq.com