DFOG對(duì)卵巢癌OVCAR3源性球細(xì)胞遷移和Tw ist1/FoxM 1表達(dá)的影響

寧映霞，董巍檑，陳 阿，許 暢，崔迎紅，李 翔

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510120；2. 南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院，衡陽 421001；3. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013）

DFOG對(duì)卵巢癌OVCAR3源性球細(xì)胞遷移和Tw ist1/FoxM 1表達(dá)的影響

寧映霞1，董巍檑2，陳 阿3，許 暢3，崔迎紅3，李 翔3

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510120；2. 南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院，衡陽 421001；3. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013）

目的：檢查金雀異黃素（genistein，GEN）及其新型合成類似物7-二氟甲氧基-5，4’-二-正辛烷氧基金雀異黃素（7-difluoromethoxyl-5，4'-di-n-octyl genistein，DFOG）對(duì)人卵巢癌OVCAR3源性球細(xì)胞遷移和Twist1/ FoxM1蛋白表達(dá)的作用。方法：Transwell小室細(xì)胞遷移試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率。蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與OVCAR3細(xì)胞相比，OVCAR3源性球細(xì)胞遷移率更高。GEN（40μM）或DFOG（5μM和10μM）抑制OVCAR3源性球細(xì)胞遷移。此外，GEN（40μM）或DFOG（5μM和10μM）平行地下調(diào)Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)。結(jié)論：GEN及其類似物DFOG抑制OVCAR3源性球細(xì)胞體外遷移與其抑制Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)相關(guān)。

金雀異黃素；7-二氟甲氧基-5，4’-二-正辛烷氧基金雀異黃素；卵巢癌；卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞；細(xì)胞遷移

越來越多的證據(jù)表明腫瘤干細(xì)胞是惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因，而現(xiàn)有的治療手段無法針對(duì)腫瘤干細(xì)胞這一導(dǎo)致腫瘤治療失敗、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因性細(xì)胞［1］。我們先前的研究表明，5，4’-二-正辛烷氧基-7-二氟甲氧基金雀異黃素（7-difluoromethyl-5，4’-di-n-octylgenistein，DFOG）抑制具卵巢干細(xì)胞樣細(xì)胞特性的SKOV 3和A 2780源性球細(xì)胞自我更新能力［2，3］。本文的研究目的在于確定金雀異黃素（genistein，GEN）及其新型合成類似物DFOG能否抑制人卵巢癌OVCAR3源性球細(xì)胞遷移和調(diào)控Twist1及FoxM1蛋白表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑DFOG（分子量：544，性狀：黃色粉末，純度：98%）參照文獻(xiàn)［4］方法合成和結(jié)構(gòu)確證，由湖南師范大學(xué)曹建國教授惠贈(zèng)。金雀異黃素（Sigma-Aldrich公司）。鼠抗人β-actin單克隆抗體源自美國Santa Cruz Biotechnology，Inc.公司；兔抗人Twist1多克隆抗體源自美國Abcam，Inc. 公司；鼠抗人FOXM1抗體（K-19）（美國Santa Cruz Biotechnology 公司）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑購自美國Amersham Pharmacia Biotech公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與球培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3購自中國科學(xué)院細(xì)胞中心（中國上海市）。參照文獻(xiàn)［2，3］描述的方法和步驟，完成細(xì)胞培養(yǎng)和腫瘤球培養(yǎng)，取OVCAR3細(xì)胞系第2代球細(xì)胞作為OVCAR3源性球細(xì)胞。

1.3 Transwell小室遷移試驗(yàn)取帶Transwell嵌合小室（8 μm孔徑聚碳酸酯膜）6孔培養(yǎng)板（美國corning公司），每孔加入1.0mL完全干細(xì)胞條件培養(yǎng)基作為趨化試劑（下室）；然后，放置嵌合小室，用無生長(zhǎng)因子干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，每嵌合小室（上室）接種5000個(gè)細(xì)胞；培養(yǎng)24 h，用棉簽清除未遷移的細(xì)胞；用甲醇固定下室面膜上的遷移細(xì)胞，并進(jìn)行HE染色。在光學(xué)顯微鏡下，計(jì)數(shù)每孔通過膜遷移的細(xì)胞數(shù)，以O(shè)VCAR3細(xì)胞或溶媒（0.1% DMSO）處理OVCAR3源性球細(xì)胞為100%標(biāo)化細(xì)胞遷移率。

1.4 蛋白質(zhì)印跡參照先前發(fā)表文獻(xiàn)［5，6］的方法和步驟完成蛋白質(zhì)印跡分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Spss 20.0 for windows evaluation 軟件建立數(shù)據(jù)庫，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±sD）表示，采用One Way ANOVA方差分析；方差齊性檢驗(yàn)，在方差齊性時(shí)，多組均數(shù)間比較采用LSD法，在方差不齊時(shí)，多組均數(shù)間采用Tukey's檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OVCAR3細(xì)胞與OVCAR3源性球細(xì)胞體外遷移能力的比較與OVCAR3細(xì)胞相比，OVCAR3源性球細(xì)胞遷移率顯著地增高（P＜0.05；圖1）。

2.2 OVCAR3細(xì)胞與OVCAR3源性球細(xì)胞Tw ist1和FoxM 1蛋白表達(dá)的比較與OVCAR3細(xì)胞相比，OVCAR3源性球細(xì)胞Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（圖2）。

2.3 DFOG對(duì)OVCAR3源性球細(xì)胞遷移的影響與溶媒（0.1% DMSO）處理OVCAR3源性球細(xì)胞比較，GEN（40μM）或DFOG（5μM和10μM）抑制OVCAR3源性球細(xì)胞遷移（P＜0.05；圖3）。

圖1 OVCAR3源性球細(xì)胞展示出更高細(xì)胞遷移率（Mean±SD，n=3）OVCAR3：OVCAR3細(xì)胞；OCSLC：OVCAR3源性球細(xì)胞。OVCAR3細(xì)胞與OVCAR3細(xì)胞源性球細(xì)胞比較：*P＜0.05。

圖2 OVCAR3源性球細(xì)胞高表達(dá)Twist1和FoxM1蛋白OVCAR3：OVCAR3細(xì)胞；OCSLC：OVCAR3源性球細(xì)胞。

圖3 DFOG抑制OVCAR3源性球細(xì)胞遷移（Mean±SD，n=3）GEN（40.0 μM）或DFOG（5.0 μM和10.0 μM）處理OVCAR3源性球細(xì)胞與溶媒（0.1% DMSO）處理OVCAR3源性球細(xì)胞比較：*P＜0.05；DFOG（10.0 μM）處理OVCAR3源性球細(xì)胞與GEN（40.0 μM）或DFOG（5.0 μM）處理OVCAR3源性球細(xì)胞比較：#P＜0.05。

2.4 DFOG對(duì)OVCAR3源性球細(xì)胞Tw ist1和FoxM 1蛋白表達(dá)的影響圖4可見，GEN（40.0 μM）能有效地抑制OVCAR3源性球細(xì)胞Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)；DFOG（5.0 μM和10.0 μM）處理顯著地下調(diào)OVCAR3源性球細(xì)胞Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)。

圖4 DFOG下調(diào)OVCAR3源性球細(xì)胞Twsit1和FoxM1蛋白表達(dá)

3 討論

先前的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證明，從建立人卵巢癌細(xì)胞系得到的球細(xì)胞具有自我更新能力和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化表型［2，3，5，6］。本文采用Transwell小室細(xì)胞遷移試驗(yàn)檢測(cè)的結(jié)果表明，與OVCAR3細(xì)胞相比，OVCAR3源性球細(xì)胞具有更高體外細(xì)胞遷移能力。從而說明更強(qiáng)體外細(xì)胞遷移能力是一種卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的功能特性。

我們?cè)鴪?bào)道金雀異黃素類似物DFOG抑制從建立人卵巢癌細(xì)胞系得到的卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞腫瘤球形成［2，5，6］。本文實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與溶媒（0.1% DMSO）處理OVCAR3源性球細(xì)胞比較，GEN（40μM）或DFOG（5μM和10μM）抑制OVCAR3源性球細(xì)胞遷移。

Twist是一種高度保守的堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育中促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方面起重要作用［7］。腫瘤細(xì)胞中，Twist被視為癌基因，因?yàn)槠浔磉_(dá)增加可通過誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）而促進(jìn)疾病進(jìn)程和轉(zhuǎn)移［8］。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OVCAR3源性球細(xì)胞展示出更高Twist1蛋白表達(dá)水平。

我們先前發(fā)表文章指出，DFOG抑制SKOV3源性卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新與下調(diào)FoxM1蛋白表達(dá)相關(guān)［5］。Chen PM等研究建議FoxM1-MMP2信號(hào)軸活化促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲［9］。Qian J等的研究表明Twist1上調(diào)FoxM1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖［10］。在本文的研究中，我們發(fā)現(xiàn)OVCAR3源性球細(xì)胞過表達(dá)FoxM1蛋白。

值得注意的是，在本文的研究中，我們證實(shí)GEN及其新型合成類似物DFOG明顯下調(diào)OVCAR3源性球細(xì)胞Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)。 總結(jié)上述實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，我們有理由提出如下建議：（1）OVCAR3源性球細(xì)胞更強(qiáng)細(xì)胞遷移能力可能與Twist1和FoxM1蛋白過表達(dá)有關(guān)；（2）GEN及其新型合成類似物DFOG抑制OVCAR3源性球細(xì)胞作用與其下調(diào)Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)相關(guān)。

［1］ Lele SB, Morrison CD, Odunsi K. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism［J］. PLoS One.2014, 9(1): e84941.

［2］ 寧映霞, 曹建國.7-二氟甲氧基-5, 4'-二正辛烷氧基金雀異黃素對(duì)卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新和FoxM1表達(dá)的影響［J］. 湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版), 2014, (01): 10-13.

［3］ 寧映霞, 鄧宇傲, 曹建國. DFOG抑制卵巢癌A2780細(xì)胞系球形成細(xì)胞自我更新與活化FoxO3a相關(guān)［J］. 湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版), 2014, (02): 1-4.

［4］ Xiang HL, Liu F, Quan MF, Cao JG, Lv Y.7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein inhibits growth of gastric cancer cells through down-regulating forkhead box M1［J］. World J Gastroenterol.2012, 18(33): 4618-4626.

［5］ Ning Y, Luo C, Ren K, Quan M, Cao J. FOXO3a-mediated suppression of the self-renewal capacity of sphere-forming cells derived from the ovarian cancer SKOV3 cell line by 7-difluoromethoxyl-5, 4'-di-n-octyl genistein［J］. Mol Med Rep.2014, 9(5): 1982-1988.

［6］ Ning YX, Li QX, Ren KQ, Quan MF, Cao JG.7-difluoromethoxyl-5, 4'-di-n-octyl genistein inhibits ovarian cancer stem cell characteristics through the downregulation of FOXM1［J］. Oncol Lett.2014, 8(1): 295-300.

［7］ Li J, Zhou BP. Activation of β-catenin and Akt pathways by Twist are critical for the maintenance of EMT associated cancer stem cell-like characters［J］. BMC Cancer.2011, 11: 49.

［8］ Su YW, Xie TX, Sano D, Myers JN. IL-6 stabilizes Twist and enhances tumor cell motility in head and neck cancer cells through activation of casein kinase 2［J］. PLoS One.2011, 6(4): e19412.

［9］ Chen PM, Wu TC, Shieh SH, Wu YH, Li MC, Sheu GT, Cheng YW, Chen CY, Lee H. MnSOD promotes tumor invasion via upregulation of FoxM1-MMP2 axis and related with poor survival and relapse in lung adenocarcinomas［J］. Mol Cancer Res.2013, 11(3): 261-71.

［10］ Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X. Twist1 Promotes Gastric Cancer Cell Proliferation through Up-Regulation of FoxM1［J］. PLoS One.2013, 8(10): e77625.

Effects of DFOG on M igration and Expression of Tw ist1/FoxM 1 in Human Ovarian Cancer OVCAR3-derived Spheroids

Ning Ying-Xia1, Dong Wei-Lei2, Chen A3, Xu Chang3, Cui Ying-Hong3, Li Xiang3
(1. Department of Gynaecology and Obstetrics, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China; 2. Department of Gynaecology and Obstetrics, University of South China, Hengyang 421001, China; 3. Pharmaceutical Science, Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410013, China)

Objective To investigate the effects of genistein (GEN) and its novel synthetic analogue 7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein (DFOG) on the cell migration and the expression of Twist1/FoxM1 in human ovarian cancer OVCAR3-derived spheroids. M ethods Cell migration ratio was detected using Transwell cell migration assay. The expression of Twist1 and FoxM1 was analyzed using western blot. Results Compared with OVCAR3 parent cells, cell migration ratio was higher in OVCAR3-derived spheroids. Moreover, both GEN (40μM) and DFOG (5μM and10μM) could inhibited the cell migration ratio in OVCAR3-derived spheroids. And they could also parallelly down-regulate the protein expression of Twist1 and FoxM1. Conclusion Cell migration inhibited by GEN and its analogue DFOG is associated with inhibiting the expression of Twsit1 and FoxM1 in OVCAR3-derived spheroids.

genistein; 7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein; ovarian cancer; ovarian cancer stem-like cells; cell migration

R737.31

A

1673-016X（2017）04-0001-03

2017-01-03

國家自然青年基金 (No.81301894)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目 (No.2014A020211028)；廣州市教育系統(tǒng)科研項(xiàng)目(No.1201410508)

董巍檑，E-mail：540325366@qq. com