PD-1/PD-L1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的生物學(xué)作用及臨床意義

彭苗，莫?jiǎng)P嵐，王希成，丁穎

（廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤科，廣東 廣州 510080）

PD-1/PD-L1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的生物學(xué)作用及臨床意義

彭苗，莫?jiǎng)P嵐，王希成，丁穎*

（廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤科，廣東 廣州 510080）

目的研究PD－1／PD－L1及EGFR在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)和相關(guān)性。方法收集我院96例非小細(xì)胞肺癌患者的病理標(biāo)本和臨床資料，使用免疫組化檢測(cè)PD－1／PD－L1的表達(dá)情況，PCR檢測(cè)EGFR的表達(dá)情況。使用Logistic回歸分析評(píng)價(jià)PD－1／PD－L1和EGFR的相關(guān)性。結(jié)果吸煙患者的PD－1陽(yáng)性率為76.7% （23例），顯著高于不吸煙患者的21.2% （14例） （P＜0.05）。女性患者的PD－L1陽(yáng)性率為82.0% （41例），顯著高于男性的45.7% （21例） （P＜0.05）。腺癌患者的PD－L1陽(yáng)性率為78.3% （47例），顯著高于鱗癌的41.7% （15例） （P＜0.05）。EGFR突變型患者的PD－L1陽(yáng)性率為91.9% （34例），顯著高于野生型的47.5% （28例） （P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)D－1在吸煙患者中高表達(dá)；PD－L1與EGFR呈正相關(guān)，且在女性、腺癌患者中高表達(dá)，PD－L1與EGFR基因表達(dá)的關(guān)系可能為個(gè)體化免疫治療聯(lián)合靶向治療提供新的依據(jù)。

非小細(xì)胞肺癌；PD-1；PD-L1；EGFR

肺癌是我國(guó)常見的高發(fā)腫瘤之一，常規(guī)治療手段為手術(shù)、放療、化療。近年出現(xiàn)的靶向免疫治療和靶向藥物治療也是肺癌的治療方式，均高效低毒，但能否聯(lián)合使用并提高療效尚未明確。本研究分析靶向免疫治療和靶向藥物治療常見的靶點(diǎn)：程序性死亡受體－1（programmed cell death－1，PD－1）及其配體PD－L1，與表皮生長(zhǎng)因子 （epidermal growth factor receptor，EGFR）的相關(guān)性，為兩者的聯(lián)合使用探索方向，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集我院2011年1月至2013年12月收治的96例經(jīng)病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌 （non－small cell lung cancer，NSCLC）患者的病理標(biāo)本和臨床資料，標(biāo)本取材均避開了腫瘤壞死區(qū)域，用福爾馬林溶液浸泡，固定后石蠟包埋、切片。

1.2 主要試劑和設(shè)備免疫組織化學(xué)的一抗：PD－L1單抗（SP142）購(gòu)于美國(guó)的R＆D Systems公司，PD－1單抗 （SP269）購(gòu)自美國(guó)的Spring Bioscience公司；免疫組織化學(xué)的二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠／兔通用型二抗 （DAKO，Glostrup公司，丹麥）。主要設(shè)備：熒光定量PCR儀 （ABI公司，美國(guó)），全自動(dòng)免疫組化染色儀 （Roche公司，美國(guó)），倒置顯微鏡 （Olym pus公司，日本），酶標(biāo)檢測(cè)儀 （Themo公司，美國(guó)），Strata gene Mx3000P熒光定量PCR儀等。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PD－L1／PD－1的免疫組織化學(xué)染色 脫蠟和水化：將標(biāo)本切片、烤片、脫蠟 （二甲苯），并進(jìn)行乙醇水化處理（分別用無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇浸泡）。抗原修復(fù)：用自來水沖洗切片 8 min、蒸餾水浸洗 5 min、水浴加熱 25 min后進(jìn)行EDTA緩沖液抗原修復(fù)，冷卻。過氧化物酶阻斷：修復(fù)結(jié)束后再用自來水沖洗10 min、蒸餾水浸洗5 min，3%H2O2溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15 min，蒸餾水洗滌后，5% BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫孵育15 min。加入一抗、二抗：PBS沖洗3次，3 min／次，甩去PBS，加入一抗，切片放于4℃冰箱過夜。第二日切片再次用PBS沖洗3次，3 min／次，甩去PBS，加入二抗，室溫孵育 30 min。顯色、復(fù)染、封片：PBS沖洗3次，3 min／次，甩去PBS液并洗去多余二抗，用DAB顯色顯色5 min，自來水沖洗。經(jīng)蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化后予自來水沖洗10 min，梯度乙醇脫水干燥，適當(dāng)吹風(fēng)機(jī)吹干，中性樹脂封固。然后讀片。

1.3.2 PD－1／PD－L1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評(píng)估 采用immuno histochemical scores（IHS）評(píng)估PD-1／PD-L1免疫組織化學(xué)染色，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片。每張切片選取5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)鏡 （×200）下的高倍視野，根據(jù)陽(yáng)性著色細(xì)胞的百分比、陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。①陽(yáng)性著色細(xì)胞百分比：無陽(yáng)性細(xì)胞為0分，1%～10%陽(yáng)性細(xì)胞為1分，11%～50%陽(yáng)性細(xì)胞為2分，51%～80%陽(yáng)性細(xì)胞為3分，81%～100%陽(yáng)性細(xì)胞為4分。②陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度：無色0分，弱陽(yáng)性1分，中度陽(yáng)性2分，強(qiáng)陽(yáng)性3分。兩項(xiàng)的乘積即為免疫組化陽(yáng)性等級(jí)評(píng)分：0分為-，1～4分為＋，5～8分為＋＋，9～12分為＋＋＋。腫瘤細(xì)胞中、強(qiáng)度染色達(dá)到5%以上標(biāo)記為PD-1／PD-L1過度表達(dá)陽(yáng)性 （其中5%～20%過表達(dá)為1＋，21%～50%過表達(dá)為2＋，50%～100%過表達(dá)為3＋）。

1.3.3 熒光定量PCR檢測(cè)EGFR基因 ①提取病理切片的石蠟包埋組織樣本DNA。②取PCR管加入Taqman DNA聚合酶 （3 μL／管），放置于冰上，混勻后并短暫離心。向PCR管中分別加入27 μL待檢肺癌的DNA樣品、陰性對(duì)照品及陽(yáng)性對(duì)照品，混勻并短暫離心。③將步驟②中與Taqman DNA聚合酶混勻的各個(gè)待檢樣品、陰性對(duì)照品及陽(yáng)性對(duì)照品，按3 μL／孔，分別加入檢測(cè)試劑的不同反應(yīng)孔中 （每檢測(cè)1個(gè)樣品配備1～8號(hào)反應(yīng)液），混勻并短暫離心。④熒光PCR儀檢測(cè)通道設(shè)定：熒光定量PCR儀同時(shí)選擇FAM、HEX通道，反應(yīng)程序設(shè)置如下：95℃，10 s，循環(huán) 1次；95℃，15 s；60℃，60 s，循環(huán) 40次。結(jié)束后采集熒光并判讀結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，采用Logistic回歸分析評(píng)價(jià)PD-1、PD-L1和EGFR及其他臨床特征的相關(guān)性。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的一般資料患者男女比例約0.9∶1，平均年齡（51.4 ±6.5）歲，60例腺癌，患者基線特征見表1。PD-1陽(yáng)性 37例，PD-L1陽(yáng)性62例，PD-1、PD-L1陽(yáng)性病理圖見圖1。

2.2 PD－1／PD－L1表達(dá)情況及與EGFR的關(guān)系使用Logistic回歸分析評(píng)價(jià)PD-1，PD-L1和EGFR及其他臨床特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示，PD-1在吸煙患者中高表達(dá)，與EGFR無相關(guān)性；PD-L1和EGFR正相關(guān)，且在女性、腺癌患者中高表達(dá)。見表2、圖2。

表1 患者的一般資料

圖1 NSCLC病理圖

表2 PD－1／PD－L1表達(dá)情況與其他因素的關(guān)系 （n）

3 討論

PD-1及其配體PD-L1均屬于CD28／B7超家族［1］。處于腫瘤的微環(huán)境中，PD-1能夠在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及被抑制的淋巴細(xì)胞的表面表達(dá)，同時(shí)也是參與活化T淋巴細(xì)胞后期調(diào)控的負(fù)協(xié)同刺激受體之一［2］；當(dāng)它在活化的T細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，在調(diào)節(jié)免疫抑制的過程中具有重要作用［3］，可幫助腫瘤細(xì)胞逃避PD-1陽(yáng)性T細(xì)胞的攻擊。PD-L1是PD-1的配體之一，多表達(dá)在多種免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。Forde等［4］的研究顯示，PD-L1能夠結(jié)合T細(xì)胞表面的PD-1，并抑制腫瘤抗原特異性T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)并維持T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受。

圖2 PD－L1表達(dá)與EGFR表達(dá)的關(guān)系

EGFR是表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員之一，是原癌基因cerbB1的表達(dá)產(chǎn)物，也是一種跨膜受體酪氨酸激酶，其中第18～21外顯子可編碼酪氨酸激酶區(qū)，在NSCLC中可發(fā)生過表達(dá)和 （或）突變。EGFR的第19、21外顯子的L858R突變是最常見的突變類型［5-7］，可擾亂正常的EGFR信號(hào)通路，與細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)［8］，也是針對(duì)EGFR突變的酪氨酸激酶抑制劑 （TKI）［9］最主要作用靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，在NSCLC中，PD-1在吸煙患者中高表達(dá)，PD-L1在女性、腺癌中高表達(dá)，PD-L1表達(dá)和EGFR突變呈正相關(guān) （P＜0.05），PD-1和EGFR突變無相關(guān)性。突變型EGFR基因的信號(hào)可能為上調(diào)NSCLC中PD-L1表達(dá)的途徑之一，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。Rech等［10］使用鼠的肺腫瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)突變型EGFR基因的信號(hào)可直接上調(diào)腫瘤中PD-L1的表達(dá)，并且在基因治療中阻斷突變的EGFR信號(hào)通路可改善預(yù)后，增加腫瘤靶向治療聯(lián)合免疫治療的機(jī)會(huì)。Azuma等［11］指出在164例NSCLC術(shù)后標(biāo)本中，PD-L1在女性、不吸煙、腺癌、EGFR突變患者中高表達(dá)，且PD-L1高表達(dá)患者的生存期較短；EGFR-TKI可下調(diào)EGFR突變型肺癌細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)，而野生型EGFR肺癌細(xì)胞中，EGFRTKI無此作用，提示PD-L1表達(dá)上調(diào)可能是通過EGFR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，而EGFR信號(hào)通路則是由EGFR基因的突變介導(dǎo)。但D'Incecco等［12］的研究表明，54名EGFR突變患者中，PDL1陽(yáng)性患者的預(yù)后更好。因此在NSCLC中，PD-L1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

在NSCLC中，針對(duì)EGFR基因突變的藥物EGFR-TKI的治療有效率為50%～80%，中位無疾病進(jìn)展時(shí)間為10～14個(gè)月［13-14］。而針對(duì)PD-L1的藥物在NSCLC中也取得了一定療效，Gulley等［15］于 2013～2014年選取 184例既往化療失敗的NSCLC患者進(jìn)行抗PD-L1抗體（avelumab）Ⅰ期臨床試驗(yàn)，客觀緩解率為22%，PD-L1陽(yáng)性可能是抗PD-L1的抗體治療的靶點(diǎn)。因此，靶向治療聯(lián)合免疫治療可能更有利于EGFR和PD-L1均高表達(dá)的患者存活。NSCLC中，PD-L1和EGFR基因的相關(guān)性可能為NSCLC免疫治療聯(lián)合靶向治療提供新的依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：常海慶）

Biological Effect and Clinical Significance of PD-1/PD-L1 Expression in Non-Small Cell Lung Cancer

PENG Miao,MO Kailan,WANG Xicheng,DING Ying*
(Department of Oncology,the First Affiliated Hospital/School of Clinical Medicine of Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510080,China;*

DING Ying,E-mail:dy61321157@163.com)

ObjectiveTo study the PD-1/PD-L1 expression in non-small cell lung cancer and the correlation with EGFR expression.MethodsPathologic specimens of 96 cases of patients with non-small cell lung cancer were selected and their clinical datas were collected. PD-1/PD-L1 expression were detected by immunohistochemical and PCR for EGFR expression.Logistic regression analysis was used to evaluated the correlation between PD-1/PD-L1 and EGFR.ResultsThe positive rate of PD-1 of smoking patients was 76.7%(23 cases), significantly higher than 21.2%(14 cases)of non-smoking patients(P＜0.05).The positive rate of PD-L1 of female patients was 82.0%(41 cases),significantly higher than 45.7%(21 cases)of male patients(P＜0.05).The positive rate of PD-L1 of adenocarcinoma was 78.3%(47 cases),significantly higher than 41.7%(15 cases)of squamous cell carcinomas(P＜0.05).The positive rate of PD-L1 of EGFR mutation type was 91.9%(34 cases),significantly higher than 47.5%(28 cases)of wild type(P＜0.05).ConclusionsSmoking patients have higher PD-1 expression.PD-L1 is positively correlated with EGFR.Female patients and adenocarcinoma patients have high PD-L1 expression.The correlation between PD-L1 and EGFR may provide new evidence for individual immunotherapy combined with targeted therapy.

Non-small cell lung cancer;PD-1;PD-L1;EGFR

R734.2

A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.07.0915

2017－03－30

2017-06-02

廣州市越秀區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目 （2014－WS－033）

彭苗 （1982－），女，湖南湘潭人，碩士學(xué)位，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤的放射治療。

*通訊作者：丁穎，E－mail：dy61321157＠163.com。