層粘連蛋白α2亞鏈在膜性腎病腎小球基膜的異常分布

楊曉青，黃巖杰，呂偉剛，李 靜，畢亮亮，梅曉峰，李金剛

層粘連蛋白α2亞鏈在膜性腎病腎小球基膜的異常分布

楊曉青，黃巖杰，呂偉剛，李 靜，畢亮亮，梅曉峰，李金剛

目的 觀察Ⅳ型膠原和層粘連蛋白(laminin)亞鏈在膜性腎病(membranous nephropathy, MN)腎小球基膜(glomerular basement membrane, GBM)中的異常分布。方法 收集52例MN腎組織，按照Ehrenreich和Churg提出的基于電鏡形態(tài)特征的分期方法進(jìn)行分期，同時(shí)收集10例微小病變腎組織作為正常GBM的對(duì)照。采用間接免疫熒光法檢測(cè)不同分期MN腎組織GBM正常存在的代表性α5(Ⅳ)鏈及l(fā)aminin α5、β2鏈的分布形態(tài)，以及可能異常存在的laminin α2、β1鏈的表達(dá)。結(jié)果 在微小病變腎組織中α5(Ⅳ)鏈、laminin α5和β2鏈均沿GBM呈連續(xù)線狀陽(yáng)性；laminin α2、β1鏈在GBM中無(wú)表達(dá)。在Ⅰ期MN腎組織中α5(Ⅳ)鏈、laminin α5和β2鏈均呈連續(xù)線狀表達(dá)。Ⅱ期MN腎組織中α5(Ⅳ)鏈在連續(xù)線狀表達(dá)基礎(chǔ)上形成大量釘突；laminin α5、β2鏈表達(dá)不規(guī)則增多，節(jié)段在連續(xù)線狀表達(dá)基礎(chǔ)上形成釘突。在Ⅲ期MN腎組織中α5(Ⅳ)鏈表達(dá)不規(guī)則增多，節(jié)段雙軌狀表達(dá)；laminin α5、β2鏈表達(dá)不規(guī)則增多，節(jié)段雙軌、鏈環(huán)狀表達(dá)。laminin α2鏈在Ⅰ期MN腎組織GBM未見(jiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)；在Ⅱ期和Ⅲ期MN腎組織GBM呈顆粒狀陽(yáng)性。laminin β1鏈在各期MN腎組織GBM均未見(jiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論 MN患者GBM增厚不僅源自GBM固有Ⅳ型膠原亞鏈和laminin同種型的表達(dá)增多，還有正常僅表達(dá)于腎小球系膜區(qū)的laminin α2鏈的參與。

膜性腎病；層粘連蛋白α2；腎小球基膜

膜性腎病(membranous nephropathy, MN)是最常見(jiàn)的腎小球疾病，占我國(guó)成人原發(fā)性腎小球疾病的29.35%[1]、兒童腎活檢總數(shù)的7.27%[2]，并逐年增高，在過(guò)去的10年中發(fā)病率增加了一倍。MN主要病變是腎小球上皮細(xì)胞下、基膜外側(cè)有免疫復(fù)合物沉積，腎小球毛細(xì)血管基膜(glomerular basement membrane, GBM)高度均勻一致性增厚，可形成釘突、雙軌、鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)。MN GBM增厚源于基膜樣物質(zhì)在上皮下免疫沉積物之間或周圍沉積，多年來(lái)，研究者一直在對(duì)沉積的基膜樣物質(zhì)的成分進(jìn)行研究，但是隨著人們對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分，尤其是Ⅳ型膠原亞鏈和層粘連蛋白(laminin)同種型認(rèn)識(shí)的深入，目前尚無(wú)明確的定論。Ⅳ型膠原和laminin是構(gòu)成GBM的主要支架，各自形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Ⅳ型膠原至少包括6條α亞鏈，分別命名為α1(Ⅳ)～α6(Ⅳ)鏈[3]。laminin包括15種不同的同種型，由α、β、γ三種不同的多肽鏈亞型組合成三聚體[4]。Ⅳ型膠原和laminin亞鏈在腎小球的分布存在位置特異性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)不同分期MN腎組織GBM正常存在的代表性α5(Ⅳ)鏈及l(fā)aminin α5、β2鏈的表達(dá)，以及可能異常存在的laminin α2、β1鏈的表達(dá)，以明確MN腎小球基膜增厚形成釘突和鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的組分。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2016年1月～6月河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎臟病理實(shí)驗(yàn)室經(jīng)腎活檢明確診斷的特發(fā)性MN 52例。按照Ehrenreich和Churg提出的基于電鏡形態(tài)特征的分期方法[5]進(jìn)行分期，其中：Ⅰ期MN 32例，Ⅱ期MN 15例，Ⅲ期MN 5例。同時(shí)收集10例腎小球微小病變腎組織作為正常對(duì)照GBM。

1.2 方法

1.2.1 腎臟病理檢查 腎穿刺標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，2 μm厚切片，行常規(guī)染色(HE、PAS、Masson及PASM-Masson)觀察，間接免疫熒光法檢測(cè)PLA2R表達(dá)。腎組織冷凍切片厚3 μm，采用直接免疫熒光法檢測(cè)常規(guī)免疫標(biāo)記(IgA、IgG、IgM、C3、C4、CIq及纖維蛋白原)及IgG亞型表達(dá)。戊二醛固定腎組織常規(guī)透射電鏡檢查。

1.2.2 石蠟切片間接免疫熒光法檢測(cè)腎組織α5(Ⅳ)鏈及l(fā)aminin β2鏈表達(dá) 腎穿刺組織石蠟切片3 μm厚，常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)(pH 6.0枸櫞酸高溫高壓修復(fù)5 min，然后滴加胃蛋白酶消化10 min)，分別滴加鼠抗人單克隆α5(Ⅳ)抗體(瑞典Wieslab公司，稀釋度為1 ∶50)和鼠抗人單克隆laminin β2鏈抗體(美國(guó)Hybridoma Bank公司，稀釋度為1 ∶100)，37 ℃孵育2 h，PBS清洗；滴加FITC標(biāo)記羊抗鼠二抗37 ℃孵育30 min；甘油封片；顯微鏡觀察。每例標(biāo)本采集10個(gè)連續(xù)的腎小球，用Image Pro-Plus Software軟件計(jì)算平均積分光密度(integrated optical density, IOD)值。

1.2.3 冷凍切片間接免疫熒光法檢測(cè)腎組織laminin α2、a5、β1鏈表達(dá) 腎穿刺組織5 μm厚切片，常規(guī)冷丙酮固定10 min，分別滴加鼠抗人單克隆laminin α2、α5、β1鏈抗體(稀釋度為1 ∶100，美國(guó)Chemicon公司)，37 ℃孵育2 h，PBS清洗；滴加FITC標(biāo)記羊抗鼠二抗37 ℃孵育30 min；甘油封片；顯微鏡觀察。采集每例標(biāo)本冷凍切片上所有腎小球，用Image Pro-Plus Software 軟件計(jì)算IOD值。

2 結(jié)果

2.1 α5(Ⅳ)鏈在腎組織GBM中的表達(dá) α5(Ⅳ)鏈在腎小球微小病變腎組織GBM上呈連續(xù)線狀陽(yáng)性。α5(Ⅳ)鏈在Ⅰ～Ⅲ期MN腎組織GBM中的表達(dá)分別對(duì)應(yīng)于光鏡下GBM的形態(tài)變化，Ⅰ期MN呈連續(xù)線狀表達(dá)；Ⅱ期MN呈連續(xù)線狀表達(dá)基礎(chǔ)上形成大量釘突；Ⅲ期MN表達(dá)不規(guī)則，節(jié)段雙軌狀表達(dá)(圖1)。半定量分析顯示α5(Ⅳ)鏈在Ⅱ期和Ⅲ期MN腎組織中的表達(dá)比微小病變和Ⅰ期MN腎組織明顯增加，差異有顯著性(P<0.01，表1)。

2.2 laminin亞鏈在腎組織GBM中的表達(dá) laminin α5、β2鏈在腎小球微小病變腎組織GBM中均呈連續(xù)線狀表達(dá)；laminin α2、β1鏈在腎小球微小病變腎組織GBM中無(wú)表達(dá)。laminin α5、β2鏈在Ⅰ期MN中均呈連續(xù)線狀表達(dá)；在Ⅱ期MN表達(dá)不規(guī)則增多，節(jié)段在連續(xù)線狀表達(dá)基礎(chǔ)上形成釘突；在Ⅲ期MN表達(dá)亦不規(guī)則增多，節(jié)段呈雙軌、鏈環(huán)狀表達(dá)。laminin α2鏈在Ⅰ期MN腎組織GBM未見(jiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)，laminin α2鏈在Ⅱ期和Ⅲ期MN腎組織GBM呈顆粒狀陽(yáng)性表達(dá)。laminin β1鏈在各期MN腎組織GBM中均未見(jiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。半定量分析顯示laminin α5、β2鏈在Ⅱ期和Ⅲ期MN腎組織中的表達(dá)比微小病變和Ⅰ期MN腎組織明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

ABCDEF

圖1 α5(Ⅳ)鏈在MN腎組織GBM中的表達(dá)：A.α5(Ⅳ)鏈在Ⅰ期MN腎組織GBM呈連續(xù)線狀表達(dá)；B.α5(Ⅳ)鏈在Ⅱ期MN腎組織GBM呈連續(xù)線狀表達(dá)基礎(chǔ)上形成大量釘突；C.α5(Ⅳ)鏈在Ⅲ期MN腎組織GBM表達(dá)不規(guī)則，節(jié)段雙軌狀表達(dá)；D.Ⅰ期MN腎組織GBM呈連續(xù)線狀，未見(jiàn)明顯增厚；E.Ⅱ期MN腎組織GBM增厚，可見(jiàn)大量釘突形成；F.Ⅲ期MN腎組織GBM不規(guī)則增厚，可見(jiàn)雙軌、鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，免疫熒光和PASM-Masson染色

表1 α5(Ⅳ)鏈和laminin亞鏈在GBM中表達(dá)的半定量分析

3 討論

GBM有獨(dú)特的Ⅳ型膠原、laminin同種型組分，因而與其它基膜不同，有特征性的電荷和大小選擇特性。MN腎小球毛細(xì)血管基膜增厚源于基膜樣物質(zhì)在上皮下免疫沉積物之間或周圍沉積。本實(shí)驗(yàn)顯示，在MNⅠ期未見(jiàn)GBM固有成分α5(Ⅳ)鏈、laminin α5和β2鏈表達(dá)增多；隨著MN分期進(jìn)展到Ⅱ期、Ⅲ期，釘突、雙軌形成，固有的GBM成分α5(Ⅳ)鏈、laminin α5和β2鏈表達(dá)增多，參與釘突和雙軌的形成，與相關(guān)的α5(Ⅳ)鏈研究表達(dá)結(jié)果一致[6]。這些研究結(jié)果提示，早期MN免疫復(fù)合物在上皮側(cè)沉積未能刺激足細(xì)胞分泌多的α5(Ⅳ)鏈、laminin α5和β2鏈，隨著免疫復(fù)合物沉積的不斷增多，刺激足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原和laminin分割和包繞免疫復(fù)合物導(dǎo)致GBM增厚、釘突形成。作者長(zhǎng)期病理形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在所有MN病例光鏡下可見(jiàn)到足細(xì)胞肥大、電鏡下可見(jiàn)到足細(xì)胞足突廣泛融合。

此外，本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)展期MN檢測(cè)到正常情況下僅存在于腎小球系膜區(qū)的laminin α2鏈在GBM上顆粒狀表達(dá)。Setty等[7]的研究檢測(cè)了5例特發(fā)性MN腎組織laminin α2、α5和β2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GBM正常組分α5和β2鏈表達(dá)的增多，未檢測(cè)到laminin α2表達(dá)，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不一致，可能與兩項(xiàng)研究所用抗體生成廠家不同，針對(duì)的抗原表位不同有關(guān)。其他幾項(xiàng)有關(guān)MN laminin表達(dá)的研究[8-9]未做laminin α2表達(dá)檢測(cè)。Alport綜合征是另一以GBM不規(guī)則增厚、撕裂為病理特征的腎臟疾病。Kashtan等[10]研究顯示不論人類，還是犬類、鼠類Alport綜合征均可見(jiàn)正常僅表達(dá)于腎小球系膜區(qū)的laminin α2鏈(與本研究所用抗體相同)在GBM中表達(dá)。

ABCDEF

圖2 laminin亞鏈在MN腎組織GBM中的表達(dá)：A.laminin α5鏈在Ⅰ期MN腎組織GBM呈連續(xù)線狀表達(dá)；B.laminin α5鏈在Ⅱ期MN腎組織GBM不規(guī)則顆粒狀表達(dá)增多；C.laminin β2鏈在Ⅱ期MN腎組織GBM不規(guī)則顆粒狀表達(dá)增多，節(jié)段在線狀基礎(chǔ)上形成釘突；D.laminin β2鏈在Ⅲ期MN腎組織GBM不規(guī)則顆粒狀表達(dá)增多，節(jié)段呈雙軌、鏈環(huán)狀；E.laminin α2鏈在Ⅱ期MN腎組織GBM呈顆粒狀表達(dá)；F.laminin β1在MN腎組織GBM陰性，免疫熒光

laminin α2鏈在增厚的GBM沉積的結(jié)構(gòu)和功能意義尚不清楚，但是其增加了MN GBM增厚的結(jié)構(gòu)成分譜。GBM的篩選特性取決于精確的laminin同種型組成，GBM新出現(xiàn)的laminin同種型可能通過(guò)改變GBM的孔徑屏障或GBM與足細(xì)胞的相互作用在蛋白尿的發(fā)生中起作用。Zallocchi等[11]通過(guò)對(duì)Alport綜合征患者、小鼠模型及CD151基因敲除小鼠的研究提示沉積在GBM的laminin α2鏈可能源自系膜侵入毛細(xì)血管袢的絲狀偽足。此外，該實(shí)驗(yàn)組的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示laminin α2鏈能激活位于GBM外側(cè)的足細(xì)胞表達(dá)局灶黏附激酶(focal adhesion kinase, FAK)[12]，以及下續(xù)的足細(xì)胞MMP-9、MMP-10和MMP-12表達(dá)增加導(dǎo)致GBM損傷。本組前期實(shí)驗(yàn)[13]顯示，以GBM病變?yōu)橹鞯腗N和Alport綜合征患者腎組織均見(jiàn)腎小球足細(xì)胞MMP-9表達(dá)增多，可能與異常沉積在GBM的laminin α2鏈刺激足細(xì)胞FAK表達(dá)有關(guān)。

Fischer等[9]的研究顯示MN GBM出現(xiàn)正常僅在胚胎期表達(dá)的laminin β1。本實(shí)驗(yàn)在各期MN腎組織中均未檢測(cè)到laminin β1在GBM表達(dá)。Kashtan等[10]的研究也未在人類Alport綜合征GBM看到laminin β1鏈表達(dá)，盡管在犬類、鼠類Alport綜合征GBM可看到局灶laminin β1鏈表達(dá)。

綜上所述，MN患者GBM增厚不僅源自GBM固有Ⅳ型膠原亞鏈和laminin同種型的表達(dá)增多，還有正常僅表達(dá)于腎小球系膜區(qū)的laminin α2鏈參與。laminin α2鏈的表達(dá)異常不僅豐富了MN患者GBM增厚的結(jié)構(gòu)成分，也可能進(jìn)一步參與GBM外側(cè)足細(xì)胞蛋白的表達(dá)異常，有待后續(xù)進(jìn)一步深入探討。

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Abnormal distribution of laminin α2 chain in glomerular basement membrane in membranous nephropathy

YANG Xiao-qing, HUANG Yan-jie, Lü Wei-gang, LI Jing, BI Liang-liang, MEI Xiao-feng, LI Jin-gang
(LaboratoryofRenalPathology,theFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000,China)

Purpose To study the abnormal distribution of type Ⅳ collagen and laminin chains in glomerular basement membrane (GBM) in membranous nephropathy (MN). Methods 52 cases of MN were collected and staged according to electron microscopic morphological characteristics，and 10 cases of kidney tissues of minimal change disease were used as normal GBM control. Distribution pattern of α5(Ⅳ) chain, laminin α5 and β2 chains, and laminin α2 and β1 chains were detected using immunofluorescence method. Results In minimal change disease, α5(Ⅳ) chain, laminin α5 and β2 chains all showed continuously linear positive expression along GBM, and laminin α2 and β1 chains were negatively expressed in GBM. In stage Ⅰ MN, α5(Ⅳ) chain, laminin α5 and β2 chains all showed continuous linear positive expression along GBM. In stage Ⅱ MN, the expression of α5(Ⅳ) chain was increased and showed abundant spikes on the basis of continuous linear positive staining along GBM, and the expression of laminin α5 and β2 chains was increased，and segmental spikes were seen on the basis of continuous linear positive staining along GBM. In stage Ⅲ MN, the expression of α5(Ⅳ), laminin α5 and β2 chains was also enhanced and segmental double tracks were seen. The expression of laminin α2 chain was negative in GBM in stage Ⅰ MN, but granular positive expression along GBM was seen in stage Ⅱ and stage Ⅲ MN. No positive expression of laminin β1 chain was seen in GBM in different stages in MN. Conclusion The GBM thickness in MN originates not only from intrinsic type Ⅳ collagen chains and laminin chains, but also from laminin α2 chain, which only exist in glomerulus mesangium in normal condition.

membranous nephropathy; laminin α2; glomerular basement membrane

河南省鄭州市普通科技攻關(guān)計(jì)劃(153PKJGG170)、河南省科技創(chuàng)新杰出青年科技計(jì)劃(144100510014)

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟病理實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450000

楊曉青，女，碩士，主治醫(yī)師。E-mail: yxqljy@163.com 黃巖杰，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。 E-mail: huangyanjie69@163.com

時(shí)間：2017-6-20 11:18 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.009.html

R 692

A

1001-7399(2017)06-0636-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.009

接受日期：2017-03-13