胃癌相關(guān)纖維母細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)及對癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

閆 玉，王瑞芬，喬 萌，王立峰

胃癌相關(guān)纖維母細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)及對癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

閆 玉，王瑞芬，喬 萌，王立峰

目的 觀察胃癌相關(guān)纖維母細(xì)胞(cancer associated fibroblasts, CAFs)中多種微小RNAs(microRNAs, miRNAs)的表達(dá)水平，并探討CAFs中miRNA-214的表達(dá)對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。方法 原代培養(yǎng)人胃黏膜正常纖維母細(xì)胞(normal fibroblasts, NFs)和胃CAFs，采用RT-PCR檢測NFs和CAFs中多種miRNAs表達(dá)水平；利用Transwell小室建立CAFs與胃癌細(xì)胞MGC-803相互作用的體外模型，分析CAFs中miRNA-214對MGC-803遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果 與NFs相比，18種miRNAs在CAFs中的表達(dá)均有差異。其中miRNA-214在NFs和CAFs中的表達(dá)差異最顯著，且在CAFs中低表達(dá)。Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示，上調(diào)CAFs中miRNA-214的表達(dá)水平明顯抑制胃癌細(xì)胞MGC-803遷移和侵襲能力(P<0.01)。結(jié)論 人胃癌微環(huán)境中CAFs和NFs的miRNAs表達(dá)差異有顯著性，其中miRNA-214在CAFs中的表達(dá)明顯降低；過表達(dá)CAFs中的miRNA-214可以顯著降低胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮抑制作用。

胃腫瘤；癌相關(guān)纖維母細(xì)胞；miRNA-214；遷移；侵襲

癌相關(guān)纖維母細(xì)胞(cancer associated fibroblasts, CAFs)是腫瘤微環(huán)境中最為豐富的間質(zhì)細(xì)胞成分，在腫瘤演進(jìn)過程中扮演重要角色[1]。研究表明，CAFs中微小RNAs(microRNAs, miRNAs)的異常表達(dá)可參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為[2-3]。目前，關(guān)于胃CAFs中miRNAs的生物學(xué)功能及作用機制研究尚不多見。本文利用RT-PCR技術(shù)檢測了原代培養(yǎng)的胃CAFs和正常纖維母細(xì)胞(normal fibroblasts, NFs)中18種miRNAs的相對表達(dá)水平，根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)一步觀察在CAFs和NFs中表達(dá)差異最顯著的miRNA-214對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，探討其在胃癌進(jìn)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌MGC-803細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命研究院細(xì)胞資源中心。兔抗人FAP單克隆抗體購自Abcam公司，鼠抗人Cytokeratin單克隆抗體和兔抗人vimentin單克隆抗體購自Dako公司；細(xì)胞RNA提取試劑Trizol、PrimeScript RT試劑盒及SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自大連寶生物公司(Takara公司)，miRNA引物購自上海生工公司；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Oligofectamine購自GenePharma公司，Lipofeetamine 2000購自Invitrogen公司；用于細(xì)胞培養(yǎng)的試劑購自Hyclone公司，Tanswell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 NFs和CAFs的原代培養(yǎng)及純化 自手術(shù)室取胃癌組織新鮮標(biāo)本，同時選取相應(yīng)的正常胃黏膜作為對照。在無菌操作臺內(nèi)剪成碎末狀后加入0.1%膠原酶，置于37 ℃溫箱中孵育消化，直至消化液中有大量懸浮的單個細(xì)胞或細(xì)胞團，然后用200目濾網(wǎng)過濾離心，加入含20%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)皿中，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。48 h后第1次換液，以后每2～3天換液，直至細(xì)胞長滿瓶底。然后進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞傳代，第3代可做細(xì)胞鑒定。4～10代的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 條件培養(yǎng)基的制備 將細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待其細(xì)胞密度達(dá)70%～90%時換用無血清的DMEM培養(yǎng)基8～10 mL繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心20 min，吸取上清-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 常規(guī)細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，設(shè)立陰性對照和陽性對照，應(yīng)用SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，一抗為兔抗人FAP單克隆抗體, 鼠抗人Cytokeratin單克隆抗體，兔抗人vimentin單克隆抗體，實驗過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。以胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒視為陽性染色。

1.2.4 miRNAs的篩選 查閱大量文獻(xiàn)，選擇18個與CAFs相關(guān)的miRNAs：miRNA-31、miRNA-155、miRNA-483-3p、miRNA-26a、miRNA-148a、miRNA-93、let-7g、miRNA-106b、miRNA-424、miRNA-149、miRNA-199a、miRNA-21、miRNA-34b、miRNA-101、miRNA-301a、miRNA-145、miRNA-143、miRNA-214。

1.2.5 RT-PCR Ttizol試劑提取細(xì)胞總RNA 以500 ng總RNA為模板，用PrimeScript RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，并以2 μL cDNA進(jìn)行擴增，以U6作為內(nèi)參。所有反應(yīng)設(shè)3個復(fù)孔。采用2-△△Ct法計算各組 miRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.6 miRNA模擬物的轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的CAFs細(xì)胞每孔1×105個接種于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待其細(xì)胞密度達(dá)70%～90%時，以轉(zhuǎn)染試劑Lipofeetamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染miR-214 mimic及陰性對照加入6孔板中，然后用無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.7 Transwell遷移和侵襲實驗 將收集的條件培養(yǎng)基加入下室中，每孔加500 μL。向上室加入200 μL無血清的胃癌細(xì)胞MGC-803懸液(細(xì)胞數(shù)為2×105個)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后取出小室，用棉簽輕輕擦去上室殘留的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色15 min后，置于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，選取上、下、左、右和中心5個視野計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)并拍照，取其平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NFs和CAFs的鑒定 已純化的NFs細(xì)胞形態(tài)比較規(guī)則，細(xì)胞較小，呈長梭形；CAFs雖呈長梭形，但形態(tài)差異較大，大小不等，排列紊亂。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果表明，原代培養(yǎng)的NFs和CAFs均表達(dá)間葉細(xì)胞標(biāo)志vimentin(圖1A、B)，但均不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志Cytokeratin(圖1C、D)。纖維母細(xì)胞激活蛋白(fibroblast activation protein, FAP)是CAFs的重要細(xì)胞標(biāo)志物之一，在CAFs中高表達(dá)。本組免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，CAFs中FAP的蛋白表達(dá)量明顯高于NFs(圖1E、F)。以上結(jié)果證明實驗成功分離純化了NFs和CAFs。

ABCDEF

圖1 正常纖維母細(xì)胞與癌相關(guān)纖維母細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定：A.正常纖維母細(xì)胞中vimentin陽性；B.癌相關(guān)纖維母細(xì)胞中vimentin陽性；C.正常纖維母細(xì)胞中Cytokeratin陰性；D.癌相關(guān)纖維母細(xì)胞中Cytokeratin陰性；E.正常纖維母細(xì)胞中FAP弱陽性；F.癌相關(guān)纖維母細(xì)胞中FAP強陽性，SP法

2.2 NFs和CAFs中多種miRNAs的表達(dá)差異 在所檢測的18種miRNAs中，miRNA-31在CAFs中的表達(dá)明顯增多，約是NFs中的1.7倍；miRNA-214、143和145在CAFs中的表達(dá)明顯減少。其中miRNA-214在NFs和CAFs中的表達(dá)差異最顯著，其在CAFs中的表達(dá)含量約是NFs中的1/4(圖2)，因此選取該miRNA為研究對象進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖2 RT-PCR檢測18種miRNAs在正常纖維母細(xì)胞和癌相關(guān)纖維母細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 miRNA-214轉(zhuǎn)染效率的驗證 RT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，上調(diào)miRNA-214組的CAFs細(xì)胞中miRNA-214表達(dá)水平是陰性對照組的91.1倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)，表明轉(zhuǎn)染成功。

圖3 RT-PCR檢測癌相關(guān)纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)染后陰性對照組和上調(diào)miRNA-214組中miRNA-214的表達(dá)，**P<0.01

2.4 CAFs中miRNA-214上調(diào)對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 Transwell小室遷移實驗結(jié)果顯示，用收集的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)癌細(xì)胞48 h后，上調(diào)miRNA-214組穿過濾膜的MGC-803細(xì)胞數(shù)為(48.7±3.2)，明顯低于陰性對照組(96.3±4.2)(圖4)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明miRNA-214具有抑制胃癌細(xì)胞遷移的功能。在Transwell小室侵襲實驗中，上調(diào)miRNA-214組穿過基質(zhì)膠和濾膜的MGC-803細(xì)胞數(shù)為(35.7±3.1)，明顯低于陰性對照組(69.3±5.1)(圖5)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明miRNA-214具有抑制胃癌細(xì)胞侵襲的功能。

④A④B⑤A⑤B

圖4 癌相關(guān)纖維母細(xì)胞中miRNA-214表達(dá)水平改變對胃癌細(xì)胞MGC-803遷移能力的影響：A.陰性對照組；B.上調(diào)miRNA-214組 圖5 癌相關(guān)纖維母細(xì)胞中miRNA-214表達(dá)水平改變對胃癌細(xì)胞MGC-803侵襲能力的影響：A.陰性對照組；B.上調(diào)miRNA-214組

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多步驟、多因素參與的極其復(fù)雜的過程，涉及腫瘤細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用。而腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用是促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素[4]。CAFs是一種活化的纖維母細(xì)胞，其作為腫瘤微環(huán)境中最重要的一種間質(zhì)細(xì)胞，在腫瘤的惡性進(jìn)展過程中扮演著重要角色[5]。越來越多的證據(jù)表明，CAFs可分泌多種生長因子和細(xì)胞因子，通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖、血管生成和細(xì)胞基質(zhì)降解等作用促進(jìn)腫瘤生長和侵襲轉(zhuǎn)移[6-8]。

miRNAs是一類長度約22個核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)(3′untranslated region, UTR)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種基因的表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要功能[9-11]。但以往關(guān)于miRNAs的研究主要集中在癌細(xì)胞本身。最近研究發(fā)現(xiàn)，CAFs中也存在某些miRNAs的異常表達(dá)，并通過調(diào)控其下游多種靶基因的表達(dá)影響腫瘤的進(jìn)展[12]。如在口腔鱗狀細(xì)胞癌CAFs中，miRNA-148a可通過下調(diào)Wnt10b降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，在一定程度上抑制了腫瘤的進(jìn)展[13]。Tang等[14]在乳腺癌CAFs中研究顯示，miRNA-200s的低表達(dá)可增強CAFs的活性，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本組實驗發(fā)現(xiàn)，在所挑選的18個與CAFs相關(guān)的miRNAs中，miRNA-214、143和145在CAFs中的表達(dá)明顯低于NFs，其中miRNA-214在NFs和CAFs中的表達(dá)差異最顯著，說明CAFs中的miRNA-214可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

現(xiàn)有研究表明，miRNA-214在CAFs中的表達(dá)異常與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)[15]。而胃CAFs中miRNA-214的異常表達(dá)對胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為是否有影響，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。為證實胃CAFs中miRNA-214對癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本實驗將miRNA-214的模擬物及陰性對照分別瞬時轉(zhuǎn)染至原代分離純化的CAFs中，RT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，上調(diào)miRNA-214組的CAFs細(xì)胞中miRNA-214表達(dá)水平顯著提高，表明轉(zhuǎn)染成功。然后我們用轉(zhuǎn)染后的CAFs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌細(xì)胞MGC-803，并利用Transwell小室觀察胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-214上調(diào)組的CAFs條件培養(yǎng)基能夠有效地降低胃癌細(xì)胞MGC-803的遷移和侵襲能力，這說明CAFs中的miRNA-214可能抑制胃癌的進(jìn)展。

既然胃CAFs中的miRNA-214有抑制癌癥進(jìn)展的作用，那么胃癌細(xì)胞中的miRNA-214又發(fā)揮怎樣的功能呢？目前關(guān)于miRNA-214在胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用存在不同觀點。Wang等[16]檢測了80對正常胃黏膜和癌組織中miRNA-214的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miRNA-214的表達(dá)含量低于正常胃黏膜組織，而且該研究還發(fā)現(xiàn)miRNA-214可通過靶向抑制集落刺激因子1(colony stimulating factor 1, CSF1)的表達(dá)降低癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。然而Yang等[17]的研究結(jié)果則不同，他們發(fā)現(xiàn)miRNA-214可通過靶向抑制PTEN的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲，發(fā)揮著促癌作用。這可能由于miRNA-214可以靶向調(diào)節(jié)多個靶基因，通過調(diào)控不同的信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。但在胃癌細(xì)胞中miRNA-214的哪個靶基因發(fā)揮主要作用，還需更多的分析。

綜上所述，本實驗初步證實miRNAs在胃CAFs與NFs中的表達(dá)具有差異性，其中miRNA-214在CAFs中的表達(dá)顯著低于NFs。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，miRNA-214在胃CAFs中的過表達(dá)能夠降低胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力，可能發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展的作用。我們后續(xù)將對miRNA-214在胃CAFs中的具體作用機制進(jìn)行深入探討。

[1] Ishii G, Ochiai A, Neri S. Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2016,99(Pt B):186-196.

[2] Suzuki H I, Katsura A, Matsuyama H,etal. MicroRNA regulons in tumor microenvironment[J]. Oncogene, 2015,34(24):3085-3094.

[3] Rupaimoole R, Calin G A, Lopez-Berestein G,etal. miRNA deregulation in cancer cells and the tumor microenvironment[J]. Cancer Discov, 2016,6(3):235-246.

[4] Quail D F, Joyce J A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis[J]. Nat Med, 2013,19(11):1423-1437.

[5] Schauer I G, Sood A K, Mok S,etal. Cancer-associated fibroblasts and their putative role in potentiating the initiation and development of epithelial ovarian cancer[J]. Neoplasia, 2011,13(5):393-405.

[6] Cortez E, Roswall P, Pietras K. Functional subsets of mesenchymal cell types in the tumor microenvironment[J]. Semin Cancer Biol, 2014,25:3-9.

[7] Madar S, Goldstein I, Rotter V. ‘Cancer associated fibroblasts’-more than meets the eye[J]. Trends Mol Med, 2013,19(8):447-453.

[8] Valcz G, Sipos F, Tulassay Z,etal. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology[J]. J Clin Pathol, 2014,67(12):1026-1031.

[9] Liu H T, Gao P. The roles of microRNAs related with progression and metastasis in human cancers[J]. Tumour Biol, 2016 Oct 6. [Epub ahead of print].

[10] Hanahan D, Coussens L M. Accessories to the crime: functions of cell recruited to the tumor microenvironment[J]. Cancer Cell, 2012,21(3):309-322.

[11] Bouyssou J M, Manier S, Huynh D,etal. Regulation of microRNAs in cancer metastasis[J]. Biochim Biophys Acta, 2014,1845(2):255-265.

[12] Yan Y, Wang L F, Wang R F. Role of cancer-associated fibroblasts in invasion and metastasis of gastric cancer[J]. World J Gastroenterol, 2015,21(33):9717-9726.

[13] Min A, Zhu C, Peng S,etal. Downregulation of microrna-148a in cancer-associated fibroblasts from oral cancer promotes cancer cell migration and invasion by targeting Wnt10b[J]. J Biochem Mol Toxicol, 2016,30(4):186-191.

[14] Tang X, Hou Y, Yang G,etal. Stromal miR-200s contribute to breast cancer cell invasion through CAF activation and ECM remodeling[J]. Cell Death Differ, 2016,23(1):132-145.

[15] Mitra A K, Zillhardt M, Hua Y,etal. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer[J]. Cancer Discov, 2012,2(12):1100-1108.

[16] Wang Y W, Shi D B, Chen X,etal. Clinicopathological significance of microRNA-214 in gastric cancer and its effect on cell biological behaviour[J]. PLoS One, 2014,9(3):e91307.

[17] Yang T S, Yang X H, Wang X D,etal. MiR-214 regulate gastric cancer cell proliferation, migration and invasion by targeting PTEN[J]. Cancer Cell Int, 2013,13(1):68.

Expression miRNAs in cancer associated fibroblasts of gastric cancer and their effects on the migration and invasion

YAN Yu, WANG Rui-fen, QIAO Meng, WANG Li-feng
(DepartmentofPathology,XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China)

Purpose To investigate various microRNAs (miRNAs) expression levels in cancer associated fibroblasts (CAFs) of gastric cancer, and to explore the effects of miRNA-214 in CAFs on the invasion and migration of gastric cancer cells. Methods The primary CAFs were isolated from human gastric tumor tissues, while the normal fibroblasts (NFs) were from adjacent normal gastric mucosa tissues. Real-time quantitative PCR (RT-PCR) was performed to detect the expression level of miRNAs in CAFs and NFs. The interaction modelinvitrobetween CAFs and MGC-803 (a gastric cancer cell line) was established by Transwell chamber, and then the effects of miRNA-214 in CAFs on MGC-803 invasion and migration were analyzed. Results It was found that the expression level of 18 kinds of miRNAs in CAFs was different. Moreover, the expression level of miRNA-214 in CAFs was most observably decreased compared with NFs. Further studies indicated that over-expression of miRNA-214 in CAFs could markedly inhibit the migration and invasion ability of gastric cancer cellsinvitro. Conclusion The expression of miRNAs was different between CAFs and NFs, and the miRNA-214 expression in CAFs is markedly reduced compared with NFs. The over-expression of miRNA-214 in CAFs could significantly inhibit the migration and invasion ability of gastric cancer cells. Therefore, miRNA-214 in CAFs might act as a tumor suppressor in gastric cancer progression.

gastric neoplasms; cancer associated fibroblasts; miRNA-214; invasion; migration

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院院級課題(15YJ10)、上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會青年項目(20154Y0145)、上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉課題(YG2016QN72)

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院病理科，上海 200092

閆 玉，女，碩士，碩士研究生。Tel: (021)25077217，E-mail: 461529177@qq.com 王立峰，女，博士，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: wanglifeng@xinhuamed.com.cn

時間：2017-6-20 11:17 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.003.html

R 735.2

A

1001-7399(2017)06-0601-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.003

接受日期：2017-03-27