胃癌組織microRNA表達(dá)譜檢測(cè)及生物信息學(xué)分析

黃幼生，解 娜，張藝馨，羅志飛，薛逢貴

·論 著·

胃癌組織microRNA表達(dá)譜檢測(cè)及生物信息學(xué)分析

黃幼生，解 娜，張藝馨，羅志飛，薛逢貴

目的 探討微小RNA(microRNA, miRNA)在胃癌組織中的表達(dá)特征。方法 采用Exiqon miRNA芯片檢測(cè)3對(duì)胃癌組織及其配對(duì)正常胃黏膜組織中miRNA差異表達(dá)情況，隨機(jī)選取10個(gè)上調(diào)或下調(diào)差異表達(dá)的miRNA應(yīng)用qPCR技術(shù)驗(yàn)證；應(yīng)用生物信息學(xué)分析差異表達(dá)的miRNA及其靶向基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。結(jié)果 芯片結(jié)果顯示，在3對(duì)胃癌組織中有111個(gè)miRNA出現(xiàn)差異表達(dá)(差異倍數(shù)>2，P<0.05)，其中上調(diào)表達(dá)95個(gè)，下調(diào)表達(dá)16個(gè)。進(jìn)一步行qPCR驗(yàn)證的10個(gè)miRNA的表達(dá)情況與miRNA芯片結(jié)果一致(P=0.040)。聚類分析顯示胃癌組織與癌旁組織存在明顯的差異表達(dá)，基因本體(gene ontology, GO)及pathway分析顯示差異表達(dá)的miRNA涉及胃癌的凋亡、周期轉(zhuǎn)換、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移及各種腫瘤通路的激活等。結(jié)論 胃癌組織中miRNA存在異常表達(dá)，可能涉及胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

胃腫瘤；miRNA；差異表達(dá)；生物信息學(xué)；miRNA芯片

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)發(fā)病率及病死率均位居惡性腫瘤的第2位[1-2]。胃癌組織學(xué)上存在高度的異質(zhì)性，闡明胃癌發(fā)病的分子機(jī)制是改善治療、提高患者預(yù)后的關(guān)鍵。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類大小21～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA(noncoding RNAs, ncRNAs)，一般來源于染色體的非編碼區(qū)域，由約70 nt大小的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體加工而來，其作用是在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生抑制性作用[3]。越來越多的資料顯示，miRNA具有表達(dá)的特異性，能夠準(zhǔn)確區(qū)分組織的來源，其結(jié)構(gòu)或表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，涉及腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、分期及預(yù)后等[3-6]。這些研究表明，miRNA在腫瘤組織中的異常表達(dá)具有輔助診斷及靶向開發(fā)治療藥物的潛力。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Exiqon miRNA寡核苷酸芯片檢測(cè)3對(duì)胃癌及其配對(duì)正常胃黏膜組織中的miRNA表達(dá)特征，行qPCR驗(yàn)證。應(yīng)用生物信息學(xué)分析差異表達(dá)的miRNA生物學(xué)功能及其對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展中所起的作用，為進(jìn)一步闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制及探索開發(fā)胃癌分子靶標(biāo)奠定分子理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2014年1月新鮮切除的標(biāo)本，切除后立即液氮保存，選擇3對(duì)胃癌及其配對(duì)正常胃黏膜組織(距離腫瘤邊緣5 cm)?；颊咝畔挲g、性別、發(fā)生部位等均從臨床病例信息中心獲取，患者術(shù)前均未接受化療或放療，病例診斷、分期、分型由兩位高級(jí)職稱病理專家根據(jù)石蠟組織HE切片確診。標(biāo)本使用已獲得患者知情同意并經(jīng)過海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過。

1.2 主要試劑 TRIzol Reagent為Invitrogen Life Technologies產(chǎn)品；RNasey Mini試劑盒購自QIAGEN公司；miRCURYTM Array Power標(biāo)記試劑盒(Cat #208032-A)、miRCURYTM LNA芯片(v.18.0)為Exiqon公司產(chǎn)品。miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒購自北京天根生物公司。

1.3 組織總RNA提取及純化 對(duì)胃癌及其配對(duì)組織中加入適量TRIzol(1 mL/20 mg)，使用BioPulverizer進(jìn)行組織破碎勻質(zhì)，隨后RNA提取及純化步驟按TRIzol及RNasey Mini試劑盒使用說明書進(jìn)行。使用NanoDrop ND-1000測(cè)量純化后的RNA濃度，凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.4 RNA標(biāo)記與芯片雜交 抽提的RNA通過質(zhì)檢后，使用miRCURYTM Array Power標(biāo)記試劑盒對(duì)miRNA進(jìn)行標(biāo)記。具體操作由上?？党缮锕就瓿?，簡(jiǎn)而言之，1 μg的RNA加水至2 μL，加1 μL的CIP Buffer和CIP酶(Exiqon)。混合后置于37 ℃下30 min。隨后，將樣品置于95 ℃下5 min終止反應(yīng)。加入3 μL Labeling Buffer，1.5 μL Fluorescent Label (Hy3)，2.0 μL DMSO，2.0 μL Labeling Enzyme。在16 ℃下反應(yīng)1 h后將樣品置于65°C下15 min終止反應(yīng)。標(biāo)記完成后，將樣品與miRCURYTM LNA Array (v.18.0)芯片雜交，根據(jù)Exiqon的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行：(1)25 μL樣品與25 μL雜交緩沖液混合，95 ℃下變性2 min，然后置于冰上2 min。(2)與芯片在56 ℃下雜交16～20 h，雜交系統(tǒng)為Nimblegen Systems, Inc., Madison, WI, USA。(3)雜交完成后，使用Wash Buffer Kit (Exiqon公司)清洗芯片，應(yīng)用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片。

1.5 數(shù)據(jù)分析 使用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號(hào)值。相同的探針取中值合并。保留在所有樣品中均≥30.0的探針，對(duì)全部芯片進(jìn)行中值標(biāo)準(zhǔn)化，篩選差異表達(dá)探針。使用Fold change(>2.0)和P值(P<0.05)篩選兩組樣品間差異表達(dá)的miRNA。最后，對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行聚類并繪制聚類圖。差異表達(dá)的miRNA Raw 數(shù)據(jù)提交上傳至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus database, GEO數(shù)據(jù)庫)，通過號(hào)為GSE78091。

1.6 qPCR檢測(cè) 選取10個(gè)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，模版為上述3對(duì)胃癌及其配對(duì)正常胃黏膜組織標(biāo)本。應(yīng)用Primer 6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)miRNA引物，引物合成由英駿生物公司完成，通用引物序列為5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′，miRNA特異性引物序列見表1。應(yīng)用ABI ViiA7 Real-time PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)：miRNA逆轉(zhuǎn)錄采用miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)試劑盒采用miRcute miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒。反應(yīng)體系：2×SYBR Green mix 10 μL，通用引物(10 μmol/L)0.4 μL，特異引物(10 μmol/L)0.4 μL，cDNA 1 μL，50×ROX Reference Dye 1 μL，RNase-free水補(bǔ)充至體積20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)反應(yīng)2 min，94 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)值，U6 snRNA為內(nèi)參。PCR結(jié)果應(yīng)用SPSS 18.0軟件Studentt檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.7 生物信息學(xué)分析 檢索miR2Disease與miRCancer數(shù)據(jù)庫，查詢癌癥相關(guān)miRNA, BioVenn軟件在線分析，查找本文中的差異表達(dá)miRNA與miR2Disease與miRCancer數(shù)據(jù)庫腫瘤相關(guān)miRNA三方重疊數(shù)據(jù)。利用在線miRTarBase軟件(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)下載差異表達(dá)miRNA實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證的靶向基因，并應(yīng)用在線DAVID系統(tǒng)(http://david.ncifcrf.gov/)將獲得的靶向基因進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)及KEGG pathways富集分析。

表1 miRNA特異性引物及U6引物列表

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取質(zhì)量分析 為盡可能保持組間數(shù)據(jù)的一致性，本組實(shí)驗(yàn)選擇了病理信息及臨床資料相對(duì)接近的3對(duì)胃癌病例。3例均為男性，55～58歲(平均56.7歲)，TNM分期ⅢA的彌漫性胃癌(Lauren分類)患者。

3對(duì)胃癌及其配對(duì)組織提取的總RNA經(jīng)NanoDrop ND-1000檢測(cè)，各標(biāo)本總RAN OD260/280在1.97～2.01之間，總含量均超過30 μg；凝膠電泳鑒定顯示，各標(biāo)本均有3條清晰的泳帶，28S、18S清晰明亮(圖1)。這些結(jié)果表明提取的總RNA含量充足，可用于下一步芯片檢測(cè)及qPCR分析。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖1C～3C.胃癌組織；1N～3N.正常胃黏膜組織

2.2 胃癌組織miRNA表達(dá)芯片結(jié)果分析 3對(duì)病例經(jīng)芯片雜交，GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，SAM軟件數(shù)據(jù)分析篩選。有超過2 000個(gè)miRNA檢測(cè)到表達(dá)，400個(gè)miRNA在胃癌組織及其正常胃黏膜組織間出現(xiàn)不同程度的差異表達(dá)(具體請(qǐng)查詢GEO：GSE78091)。其中，相對(duì)正常胃黏膜組織，有95個(gè)miRNA在胃癌組織內(nèi)出現(xiàn)顯著的上調(diào)表達(dá)，16個(gè)出現(xiàn)顯著的下調(diào)表達(dá)(差異倍數(shù)>2，P<0.05)(圖2A)，前10個(gè)上調(diào)及下調(diào)表達(dá)的miRNA見表2。

表2 差異表達(dá)的前10個(gè)miRNA(胃癌/配對(duì)正常胃黏膜組織)

為觀察胃癌及其正常胃黏膜組織中miRNA表達(dá)譜是否具有顯著差異性，根據(jù)芯片中所有miRNA的表達(dá)特征，無監(jiān)督層次聚類與相關(guān)分析被執(zhí)行。結(jié)果顯示6組miRNA很清晰的分為兩大組，對(duì)應(yīng)胃癌組及其配對(duì)組(圖2B)，表明大量的miRNA在胃癌組織中出現(xiàn)了明顯的表達(dá)變化。

2.3 qPCR驗(yàn)證 為驗(yàn)證miRNA芯片數(shù)據(jù)的可靠性，10個(gè)差異表達(dá)的miRNA(7個(gè)上調(diào)表達(dá)，3個(gè)下調(diào)表達(dá))被隨機(jī)選取執(zhí)行qPCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，在這3對(duì)胃癌組織中，有7個(gè)miRNA出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，2個(gè)出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，1個(gè)未檢測(cè)出差異性表達(dá)。與芯片檢測(cè)的結(jié)果基本一致(P=0.040)，表明miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果真實(shí)有效(圖3)。

2.4 生物信息學(xué)分析 檢索miR2Disease與miRCancer數(shù)據(jù)庫，共獲得780個(gè)癌癥相關(guān)miRNA，其中與胃癌相關(guān)的miRNA共256個(gè)。將本組中的差異表達(dá)miRNA與這兩群數(shù)據(jù)相比較，通過BioVenn在線軟件分析發(fā)現(xiàn)有24個(gè)miRNA與兩大數(shù)據(jù)庫腫瘤相關(guān)miRNA重疊，其中與胃癌相關(guān)的17個(gè)，有8個(gè)miRNA表達(dá)與其它已驗(yàn)證的數(shù)據(jù)一致，包括：hsa-miR-106b、hsa-miR-1284、hsa-miR-138、hsa-miR-191、hsa-miR-20a、hsa-miR-23b、hsa-miR-543、hsa-miR-98。

圖2 胃癌組織miRNA差異表達(dá)譜分析圖

A.聚類分析圖：1N～3N.配對(duì)的正常胃黏膜組織；1C～3C.胃癌組織；紅色表示高表達(dá)miRNA，綠色表示低表達(dá)miRNA；B.相對(duì)配對(duì)組織胃癌miRNA表達(dá)變化火山圖：左側(cè)為下調(diào)表達(dá)，右側(cè)為上調(diào)表達(dá)的miRNA；豎綠線以外點(diǎn)為差異表達(dá)超過2倍數(shù)量的miRNA，橫綠線以上表示P>0.05的miRNA，紅色點(diǎn)代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)miRNA

從mitarBASE數(shù)據(jù)庫[7]下載已驗(yàn)證的這8個(gè)miRNA的靶向基因(至少有兩種方法證實(shí))，共獲得93個(gè)基因。利用DAVID數(shù)據(jù)庫提供的基因功能注釋工具(GO及KEGG pathways富集分析)對(duì)這93個(gè)靶基因進(jìn)行功能和調(diào)控通路分析，結(jié)果表明，這些miRNA的異常表達(dá)可能與基因表達(dá)、DNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增生等調(diào)控失常有關(guān)，涉及miRNA腫瘤相關(guān)、p53及Akt等信號(hào)途徑的激活(圖4)。

圖3 miRNA差異表達(dá)qPCR及芯片結(jié)果對(duì)比圖(胃癌/配對(duì)組織)

圖4 KEGG分析P值前10個(gè)信號(hào)途徑

3 討論

目前在人類組織中發(fā)現(xiàn)近2 000個(gè)miRNA，調(diào)控大概1/3的人類基因表達(dá)。miRNA對(duì)靶基因mRNA的作用取決于其與靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)的程度，通過與靶基因完全互補(bǔ)結(jié)合，切割靶mRNA，或與靶基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶基因的翻譯，與靶基因互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，直接靶向切割mRNA；當(dāng)與靶基因不完全結(jié)合時(shí)，起調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用[3-4]。隨著對(duì)miRNA研究和認(rèn)識(shí)的加深，異常表達(dá)的miRNA可引起相關(guān)癌基因的激活或抑癌基因的失活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展被證實(shí)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡、血管生成、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等[3-4]。

基因芯片是篩選疾病相關(guān)miRNA最常用的方法之一，應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)人類大部分常見惡性腫瘤均有miRNA的表達(dá)異常[3-5,8]。Volinia等[6]應(yīng)用基因芯片研究540例腫瘤組織標(biāo)本的miRNA表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)miRNA在不同腫瘤組織中的表達(dá)具有組織特異性，上調(diào)表達(dá)的miRNA-191、miRNA-59、miRNA-17、miRNA-20a、miRNA-92、miRNA-15、miRNA-106a等21個(gè)miRNA組合性檢測(cè)能正確區(qū)分胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和肺癌組織。本實(shí)驗(yàn)利用Exiqon miRNA芯片檢測(cè)3對(duì)胃癌組織及其配對(duì)正常胃黏膜組織，發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中有88個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，21個(gè)表達(dá)下調(diào)，qPCR的驗(yàn)證結(jié)果與芯片一致，表明胃癌組織中存在miRNA的表達(dá)異常。

近年來，關(guān)于胃癌組織miRNA異常表達(dá)的報(bào)道逐漸增多[3,9-11]。Guo等[9]用芯片掃描分析發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中有12個(gè)miRNA表達(dá)增高。Ueda等[10]分析353對(duì)胃癌組織miRNA表達(dá)特征發(fā)現(xiàn)，有22個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，13個(gè)表達(dá)下調(diào)，與胃癌的分型、預(yù)后、轉(zhuǎn)移等有關(guān)。陽圣等[11]分析21對(duì)胃癌病例，發(fā)現(xiàn)有88個(gè)miRNA表達(dá)異常。最近研究顯示，miR-340[12]、miR-181a-5p[13]、miR-196b-5p[14]、miR-375[14]等在胃癌中也出現(xiàn)異常表達(dá)，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。這些研究顯示胃癌組織中存在多量miRNA的異常表達(dá)，但不同的研究表達(dá)異常的miRNA重合率較低，重復(fù)性差。本文通過檢索miR2Disease與miRCancer數(shù)據(jù)庫，共獲得256個(gè)胃癌相關(guān)miRNA，來源于400篇文獻(xiàn)。本文芯片分析發(fā)現(xiàn)的111個(gè)miRNA只有24個(gè)先前有過報(bào)道，僅17個(gè)曾報(bào)道與胃癌相關(guān)，該17個(gè)miRNA中有8個(gè)與本文數(shù)據(jù)完全一致。造成重復(fù)性差的原因在文獻(xiàn)中沒有得到很好的闡明，作者認(rèn)為可能與胃癌組織高度異質(zhì)性、個(gè)體、種族的差異性及采用的研究方法不同有關(guān)。

miRNA雖只有短短22個(gè)核苷酸，卻通過靶向序列的互補(bǔ)性調(diào)控大量的靶基因，發(fā)揮其生物學(xué)功能，因而挖掘miRNA的靶向基因是研究miRNA功能的重要手段[3-5,8]。目前，預(yù)測(cè)miRNA靶向基因的在線工具多種多樣，比較有名的有Targetscan、miRbase和pictar等[15]。然而這些軟件預(yù)測(cè)的靶向基因重復(fù)性較差，預(yù)測(cè)出來的靶向基因數(shù)量龐大，驗(yàn)證效果并不是很理想，說明依據(jù)miRNA和基因結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性預(yù)測(cè)靶向基因的方式還需要很大的提高。目前，有不少miRNA數(shù)據(jù)庫可以檢索已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miRNA靶向基因，利用這些數(shù)據(jù)庫分析miRNA的功能更加簡(jiǎn)單易行。本文通過檢索mitarBASE數(shù)據(jù)庫[7]獲得93個(gè)至少通過兩種方法驗(yàn)證的胃癌相關(guān)miRNA(hsa-miR-106b、hsa-miR-1284、hsa-miR-138、hsa-miR-191、hsa-miR-20a、hsa-miR-23b、hsa-miR-543、hsa-miR-98)靶向基因，隨后應(yīng)用DAVID 數(shù)據(jù)庫提供的基因功能注釋工具發(fā)現(xiàn)這些miRNA的表達(dá)涉及基因表達(dá)、DNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增生等調(diào)控，可能與miRNA腫瘤相關(guān)、p53及Akt等信號(hào)途徑激活有關(guān)，且這些調(diào)控功能及涉及的信號(hào)途徑大多已被文獻(xiàn)證實(shí)[3-5,8]。

綜上所述，胃癌組織中存在多量的miRNA表達(dá)異常，這些異常表達(dá)的miRNA涉及胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)已發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)miRNA的作用方式及功能有助于闡明胃癌發(fā)生、進(jìn)展的分子機(jī)制。

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Expression profile of microRNAs and bioinformatics analysis in human gastric cancer tissues

HUANG You-sheng, JIE Na, ZHANG Yi-Xin, LUO Zhi-fei, XUE Feng-gui
(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalUniversity,Haikou570102,China)

Purpose This experiment was designed to investigate the expression profile of miRNAs (microRNA) in human gastric cancer tissues. Methods The expression profiles of miRNAs were compared between 3 pairs of GC and adjacent normal tissues using an Exiqon miRNA array, following which quantitative PCR (qPCR) was employed to confirm the results of the miRNA array, and 10 miRNAs were selected. Bioinformatics was used to analyze the biological function of the differentially expressed miRNAs and its target genes in gastric cancer. Results Compared with adjacent mucosal tissues, 95 miRNAs were up-regulated and 16 miRNAs were down-regulated in GC(>2 folds，P<0.05). The qPCR results were consistent with microarray-based expression analysis (P=0.049). Furthermore, the online GO and pathway analysis revealed that miRNAs might involve RNA transcription, RNA metabolism, gene expression, gene silencing, and other biological functions in GC. Conclusion There is abnormal expression of miRNAs in gastric cancer, and the abnormal expression of miRNAs may be related to GC tumorigenesis.

gastric neoplasms; microRNA; differential expression; bioinformatics; microRNA array

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260321)

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，?？?570102

黃幼生，男，副教授，副主任醫(yī)師。Tel: (0898)66723333，E-mail: hys768811@163.com

時(shí)間：2017-6-20 11:17 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.001.html

R 735.2

A

1001-7399(2017)06-0591-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.001

接受日期：2017-04-14