無(wú)腦回畸形患兒的臨床表現(xiàn)及基因分析

趙 敏劉 方

1.山東省單縣中心醫(yī)院兒科；2.山東省單縣中醫(yī)院（山東單縣 274300）

無(wú)腦回畸形患兒的臨床表現(xiàn)及基因分析

趙 敏1劉 方2

1.山東省單縣中心醫(yī)院兒科；2.山東省單縣中醫(yī)院（山東單縣 274300）

目的探討無(wú)腦回畸形患兒的臨床特征及其致病基因。方法回顧分析2例無(wú)腦回畸形患兒的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及基因檢測(cè)結(jié)果，并復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果2例無(wú)腦回畸形患兒均為男性，分別為7個(gè)月、3歲4個(gè)月。均以癲癇發(fā)作入院，發(fā)作時(shí)意識(shí)喪失。實(shí)驗(yàn)室檢查無(wú)明顯異常；腦電圖均提示有癲癇波；頭部MRI均提示無(wú)腦回畸形?；蚍治霭l(fā)現(xiàn)，1例患兒的PAFAH1B1基因存在IVS3-1G＞A雜合突變，功能分析證實(shí)該位點(diǎn)突變導(dǎo)致mRNA水平外顯子4缺失，患兒父母均未見(jiàn)突變；另1例患兒PAFAH1B1基因存在c.274A＞G突變（p.K92E），其父母未見(jiàn)異常，該突變未見(jiàn)報(bào)道。結(jié)論無(wú)腦回畸形患兒可能合并癲癇發(fā)生，PAFAH1B1基因突變是導(dǎo)致無(wú)腦回畸形的常見(jiàn)原因。

無(wú)腦回畸形；PAFAH1B1基因； 基因檢測(cè)

無(wú)腦回畸形以及巨腦回畸形均屬于不同程度大腦發(fā)育畸形，是由于神經(jīng)元移行異常導(dǎo)致[1]。臨床上根據(jù)病因以及腦回的數(shù)量等特點(diǎn)把無(wú)腦回畸形分為5種類型[2]。該疾病發(fā)病率大約為1/（13 000～20 000），常伴有癲癇、智力低下、運(yùn)動(dòng)障礙以及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，預(yù)后多數(shù)較差[3]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外均有研究發(fā)現(xiàn)，部分無(wú)腦回畸形患兒可檢測(cè)到PAFAH1B1、DCX、ARX以及TUBA1A等基因存在異常[4]。本研究總結(jié)分析單縣中心醫(yī)院診治的2例無(wú)腦回畸形患兒的臨床資料，并對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行復(fù)習(xí)，討論該病的臨床表現(xiàn)及遺傳學(xué)特點(diǎn)，進(jìn)一步提高臨床醫(yī)師對(duì)該疾病的認(rèn)識(shí)。

1 臨床資料

例1，男，7個(gè)月，因“3天內(nèi)抽搐發(fā)作10余次”入院?；純河谌朐呵?天突發(fā)抽搐，表現(xiàn)表現(xiàn)為雙眼凝視、面色發(fā)紺，口吐白沫，四肢強(qiáng)直，意識(shí)喪失，約1～2分鐘左右自行緩解，無(wú)發(fā)熱?；純篏2P1，足月順產(chǎn)。母親孕期無(wú)異常，既往無(wú)特殊疾病史。入院體格檢查：T 36.7 ℃, P 121次/min，R 37次/min；面容正常，神志清楚，雙側(cè)呼吸運(yùn)動(dòng)對(duì)稱，心臟各聽診區(qū)未聞及雜音，關(guān)節(jié)及四肢活動(dòng)未見(jiàn)異常；Brudzinkski征陰性，Kernig征陰性。入院后實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)白細(xì)胞11.26×109/L，血紅蛋白 111 g/L，紅細(xì)胞3.84×1012/L；心肌酶譜、肝腎功能均正常；乳酸2.31 mmol/L；腦電圖顯示高度失律，頻繁部分性發(fā)作；頭部MRI提示無(wú)腦回畸形?；純涸\斷為嬰兒痙攣、無(wú)腦回畸形。

例2，男，3歲4個(gè)月。因“無(wú)明顯誘因出現(xiàn)抽搐2天”來(lái)院就診。患兒發(fā)作時(shí)突然點(diǎn)頭，口唇發(fā)紺，四肢抖動(dòng)，持續(xù)約數(shù)秒至1分鐘緩解，無(wú)發(fā)熱，無(wú)吐瀉。既往史無(wú)異常。 入院體格檢查：T 37.1℃，P 117次/min，R35次/min；面容正常，神志清楚，未見(jiàn)皮疹，咽無(wú)充血，雙側(cè)扁桃體無(wú)腫大；頸軟，雙側(cè)呼吸運(yùn)動(dòng)對(duì)稱，四肢未見(jiàn)異常，活動(dòng)無(wú)受限，各關(guān)節(jié)未見(jiàn)異常，活動(dòng)無(wú)受限；四肢肌力Ⅱ級(jí)， Brudzinkski征陰性，Kernig征陰性。入院實(shí)驗(yàn)室檢查：肝腎功能、血氨等均未見(jiàn)異常；腦電圖檢測(cè)到成串痙攣發(fā)作；頭部MRI提示腦發(fā)育不良，無(wú)腦回畸形。

經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，患兒家長(zhǎng)知情同意后，取2例患兒及其父母外周血各2 mL，委托金域檢驗(yàn)公司進(jìn)行疾病相關(guān)基因檢測(cè)。利用全血基因組提取試劑盒提取基因組DNA。從GeneBank上獲取基因PAFAH1B1序列，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增相關(guān)基因全部外顯子區(qū)域。 PCR體系為12.5 μL擴(kuò)增MIX（TaKaRa公司），上下游引物各100 pmol，DNA模板100 ng，無(wú)菌水補(bǔ)足到25 μL；在Eppendorf PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共36個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger法測(cè)序分析。

測(cè)序結(jié)果顯示，例1患兒的PAFAH1B1基因存在剪接位點(diǎn)IVS3-1G＞A雜合突變；患兒父母在該位點(diǎn)均未見(jiàn)突變（圖1）。該突變?yōu)橐阎闹虏⌒酝蛔?。提取?患兒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA以后利用特異性的引物擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以后，把不同的片段切膠回收，然后進(jìn)行測(cè)序；結(jié)果顯示存在IVS3-1G＞A雜合突變者除了正常的轉(zhuǎn)錄本以外，還存在外顯子4缺失的轉(zhuǎn)錄本（圖2)，說(shuō)明該位點(diǎn)突變影響蛋白的功能。例2患兒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PAFAH1B1基因存在c.274A＞G雜合突變，導(dǎo)致編碼蛋白的第92位氨基酸由賴氨酸突變?yōu)楣劝彼幔╬.K92E），其父母未見(jiàn)異常(圖3)。利用生物信息學(xué)方法分析例2患兒PAFAH1B1基因c.274A＞G（p.K92E）突變是否為致病性突變。SIFT軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果為0.00（預(yù)測(cè)結(jié)果數(shù)值越小越影響蛋白質(zhì)功能）。Polyphen2軟件預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)為1.00（越接近1.00者致病的可能性越大），保守序列分析發(fā)現(xiàn)，不同物種之間的PAFAH1B1基因編碼的蛋白氨基酸（包括第92位賴氨酸）序列十分保守，見(jiàn)圖4，說(shuō)明該位點(diǎn)維持蛋白的正常功能發(fā)揮重要作用。

明確診斷以后，例1用硝基安定及妥泰口服止痙治療，定期門診檢查及調(diào)整藥物劑量，發(fā)作次數(shù)明顯減少；例2利用奧卡西平（0.3 g/次，bid）控制癲癇發(fā)作，隨訪3個(gè)月，藥物控制效果不明顯，發(fā)作頻率未見(jiàn)明顯減少。

圖1 例1患兒PAFAH1B1基因突變分析

圖2 例1患兒剪接位點(diǎn)突變影響mRNA剪接

圖3 例2患兒PAFAH1B1基因突變分析

圖4 不同物種間PAFAH1B1基因編碼蛋白保守序列分析

2 討論

人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常形成需要神經(jīng)元干細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化，以及來(lái)自大腦腦室區(qū)及腦室下區(qū)神經(jīng)元準(zhǔn)確的移行到目的區(qū)域，并彼此交聯(lián)發(fā)揮正常功能[5]。大腦皮層的多層結(jié)構(gòu)是神經(jīng)元正常移行而形成，否則就會(huì)形成神經(jīng)元移行障礙性疾病，導(dǎo)致大腦皮層發(fā)育畸形。依據(jù)病因以及相關(guān)的畸形特點(diǎn)可以將無(wú)腦回畸形分為 5種類型：①經(jīng)典型無(wú)腦回畸形即Ⅰ型無(wú)腦回，②鵝卵石樣無(wú)腦回畸形即Ⅱ型，③伴有胼胝體發(fā)育不全的Ⅹ-連鎖無(wú)腦回畸形，④光滑腦伴小腦發(fā)育不全以及⑤小腦無(wú)腦回畸形[2]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，在懷孕期間感染、中毒以及接觸放射線等不良的外界環(huán)境可能在胚胎早期影響神經(jīng)細(xì)胞移行導(dǎo)致大腦皮層發(fā)育不良[6]；除外界因素以外，特定的遺傳基因突變也是導(dǎo)致神經(jīng)元移行障礙疾病的重要原因，如PAFAH1B1基因及DCX基因缺陷導(dǎo)致經(jīng)典型無(wú)腦回畸形[7]；ARX異常導(dǎo)致X連鎖無(wú)腦回畸形伴生殖器異常[8]；TUBA1A基因突變導(dǎo)致無(wú)腦回伴小腦發(fā)育不全[9]；FLNA及ARGEF2基因突變導(dǎo)致腦室周圍灰質(zhì)異位等[1]。除生殖細(xì)胞突變以外，體細(xì)胞突變也可以導(dǎo)致無(wú)腦回畸形的產(chǎn)生。Jamur等[10]利用候選基因高通量測(cè)序方法檢測(cè)大腦皮層發(fā)育畸形的患兒，攜帶基因突變的患兒27例，其中8例為體細(xì)胞突變，約占檢出率的30%，因此致病基因Sanger測(cè)序陰性患者可能存在體細(xì)胞突變。本組2例患兒MRI檢測(cè)發(fā)現(xiàn)均為無(wú)腦回畸形，且患兒母親孕期未接觸不良的外界環(huán)境，推測(cè)患兒可能存在相關(guān)基因異常。

位于17號(hào)染色體p13.3區(qū)域的PAFAH1B1基因發(fā)生突變是導(dǎo)致無(wú)腦回畸形的常見(jiàn)病因。PAFAH1B1基因編碼一種高度保守的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為45 000，該蛋白含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端同源二聚體結(jié)構(gòu)、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)及C端的WD40重復(fù)序列。研究證實(shí)，該蛋白在細(xì)胞的分化及神經(jīng)元移行過(guò)程中發(fā)揮重要功能[11]。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的PAFAH1B1基因突變大約有165種（HGMD database），其中以點(diǎn)突變以及大片段的缺失突變?yōu)橹?。本文?患兒檢測(cè)到PAFAH1B1基因存在IVS3-1G＞A雜合突變，該突變導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中外顯子4缺失；例2患兒發(fā)現(xiàn)PAFAH1B1基因存在c.274A＞G雜合突變（p.K92E），該位點(diǎn)未見(jiàn)報(bào)道，生物信息學(xué)分析及保守序列分析發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在不同的物種間保守，可能為致病性突變。

綜上所述，無(wú)腦回畸形是一種嚴(yán)重的神經(jīng)元移行障礙疾病，患者一般發(fā)病較早，臨床表現(xiàn)及MRI檢測(cè)有一定的特征。結(jié)合患者臨床特點(diǎn)、基因檢測(cè)能夠進(jìn)一步幫助確診及分型。此外本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的導(dǎo)致無(wú)腦回畸形的PAFAH1B1基因突變，豐富了

PAFAH1B1基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，為相關(guān)研究提供了一定參考。

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The clinical manifestations and genetic analysis of lisencephaly in children

ZHAO Min1, LIU Fang2(1. Shanxian Central Hospital, Shanxian 274300, Shandong, China; 2. Shanxian Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanxian 274300,Shandong, China)

ObjectiveTo explore clinical characteristics and pathogenic gene of lisencephaly.MethodsThe clinical manifestation, laboratory examination and gene detection results of lisencephaly in two children were analyzed retrospectively,and relevant literature were reviewed.ResultsTwo male children with lisencephaly are at ages of 7 months, and 3 years and 4 months respectively. Both of them were admitted to hospital due to epilepsy and loss of consciousness at the time of attack.There was no obvious abnormality in laboratory examination. Both of their EEG indicated epileptic wave. Cranial MRI showed lissencelphaly. Gene analysis showed that there was a heterozygous mutation of IVS3-1G＞A inPAFAH1B1gene in a child, which resulted in the deletion of exon 4 in mRNA level by functional analysis. No mutations were found in the parents of the child.The other one had c.274A＞G mutation (p.K92E) inPAFAH1B1gene, which has not been reported before, and his parents were normal.ConclusionPatients with lissencelphaly may combine with epilepsy, and thePAFAH1B1gene mutation is the common cause.

lissencelphaly;PAFAH1B1gene; gene detection

2016-12-14)

(本文編輯：蔡虹蔚)

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.07.011