SSBP1在肝癌組織中的表達及意義

馬榮芬 陳秋英 劉艷芬

·論著·

SSBP1在肝癌組織中的表達及意義

馬榮芬 陳秋英 劉艷芬

目的 觀察線粒體單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSBP1)在肝癌組織的表達及意義。方法 收集2013年12月至2016年12月手術(shù)切除的肝癌患者組織標本80例，采用Real time-PCR和免疫組化SP法檢測80例肝癌組織和癌旁組織SSBP1 mRNA和蛋白表達狀況，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并檢測SSBP1在肝癌細胞株HepG2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7及正常人肝細胞L-02的表達狀況。結(jié)果 SSBP1在肝癌組織和癌旁組織的表達水平和陽性表達率分別為1.87±0.23、0.36±0.05和80.00%(64/80)、15.00%(12/80)，SSBP1在肝癌組織的表達水平和陽性表達率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HepG2細胞中SSBP1表達水平顯著高于MHCC97H、SMMC7721、Huh7及L-02細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。且SSBP1表達與腫瘤大小、AFP、TNM分期、分化程度及有無門靜脈癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 肝癌組織和細胞系高表達SSBP1，與臨床病理參數(shù)有關(guān)，且SSBP1高表達提示預(yù)后不良。

肝癌；線粒體單鏈DNA結(jié)合蛋白；預(yù)后

肝癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率高居所有惡性腫瘤的第二位，僅次于肺癌[1,2]。肝癌手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)，且對放化療不敏感，患者預(yù)后差[3]。目前，靶向治療為肝癌的臨床治療提供了新思路。因此，篩選有效的腫瘤標志物、明確肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制已經(jīng)成為當前研究的熱點，這對于肝癌治療及預(yù)后評估至關(guān)重要。線粒體單鏈DNA結(jié)合蛋白(Mitochondria single-strand DNA protein 1，SSBP1)定位于線粒體基質(zhì)和擬核，由148個氨基酸組成，主要在線粒體DNA(mtDNA)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、損傷后修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，SSBP1表達失調(diào)與乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤關(guān)系密切[4-7]。但是，有關(guān)SSBP1在肝癌組織的表達狀況及意義目前研究尚少。本研究采用Real time-PCR和免疫組化SP法檢測SSBP1在肝癌組織和細胞系的表達狀況，初步探討SSBP1表達與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性，旨在為尋找防治肝癌的有效靶點提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2013年12月至2016年12月經(jīng)肝膽外科手術(shù)切除的肝癌組織石蠟標本80例，術(shù)后均經(jīng)病理確診。癌旁組織取自來源于同一標本的距腫瘤邊緣>2 cm的正常肝組織。其中男49例，女31例；年齡35～76歲，平均年齡(60.68±7.13)歲，≤60歲44例，>60歲36例；腫瘤直徑≤5 cm 28例，>5 cm 52例；AFP≤200 μg/ml 30例，>200 μg/ml 50例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期37例，Ⅲ+Ⅳ期43例；分化程度：高+中分化35例，低分化45例；33例無門靜脈癌栓，47例有門靜脈癌栓；30例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，50例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有患者術(shù)前均未接受過放、化療及生物治療，臨床病理資料完整?；颊咝g(shù)后隨訪5年。

1.2 細胞、試劑與儀器 人肝癌細胞株(HepG2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7)及正常人肝細胞L-02購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；Trizol、實時熒光定量試劑盒購自美國Promega公司；兔抗人SSBP1購自美國Santa Cruz公司；免疫組化試劑盒購自日本Takara公司；Chemi DocTM XRS+化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Biorad公司；全自動7300型熒光定量PCR擴增儀購自美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化:采用免疫組織化學染色 SP法測定SSBP1表達，嚴格按照試劑盒說明書操作，用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。判定標準：SSBP1陽性染色的判定標準為細胞質(zhì)內(nèi)檢出棕黃色或棕褐色顆粒。在200倍光鏡下隨機選取5個有代表性的視野計數(shù)100個細胞，“-”：細胞無著色或<10%的細胞呈微弱著色；“+”：>10%的細胞呈微弱著色；“++”：>10%的細胞呈中度著色；“+++”：>10%的細胞呈完全著色。

1.3.2 細胞培養(yǎng):人肝癌細胞株HepG2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7及正常人肝細胞L-02用含10% FBS、1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.3 Real time-PCR Trizol提取組織(或細胞)總RNA，分光光度計測定RNA濃度和純度。采用Genne Tool 軟件設(shè)計人SSBP1引物，由上海生工生物工程有限公司合成。按照試劑盒說明書加樣進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，ABI 7300型熒光定量PCR儀擴增。用儀器自帶的分析軟件得到各樣本、各基因擴增的Ct值，以β-actin為內(nèi)參照基因，目的基因表達相對水平RQ=2△△Ct。見表1。

表1 Real time-PCR引物序列

1.4 觀察指標 比較肝癌組織和癌旁組織SSBP1表達水平、陽性表達率的差異。比較4種肝癌細胞系(HepG2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7)和正常人肝細胞SSBP1表達水平的差異。探討SSBP1表達水平、陽性表達率與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。患者出院后隨訪5年，觀察患者中位生存時間、生存率和復(fù)發(fā)率。

2 結(jié)果

2.1 SSBP1 mRNA在肝癌組織、癌旁組織的表達水平比較 Real time-PCR結(jié)果顯示，SSBP1 mRNA在肝癌組織和癌旁組織的表達水平分別為1.87±0.23、0.36±0.05，SSBP1 mRNA在肝癌組織的表達水平顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

組別SSBP1mRNA表達水平癌旁組織0．36±0．05肝癌組織1．87±0．23?

注：與癌旁組織比較,*P<0.05

2.2 SSBP1蛋白在肝癌組織、癌旁組織的陽性表達率比較 免疫組化結(jié)果顯示，SSBP1在肝癌組織和癌旁組織的陽性表達率分別為80.00%(64/80)、15.00%(12/80)，SSBP1在肝癌組織的陽性表達率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 SSBP1蛋白在肝癌組織、癌旁組織的的陽性表達率比較 n=80,例(%)

注：與癌旁組織比較,*P<0.05

2.3 SSBP1在肝癌細胞株、正常人肝細胞的表達水平比較 Real time-PCR和Western blot結(jié)果顯示，SSBP1 mRNA和蛋白在肝癌細胞HepG2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7的表達水平顯著高于正常人肝細胞L-02，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中SSBP1在HepG2細胞表達水平最高。見表4。

類別SSBP1表達水平mRNA蛋白HepG22．16±0．30?2．05±0．24?MHCC97H1．45±0．22?1．38±0．20?SMMC77211．98±0．25?1．83±0．22?Huh71．60±0．20?1．52±0．18?L?020．83±0．110．76±0．09

注：與L-02比較,*P<0.05

2.4 SSBP1表達與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 SSBP1表達水平與肝癌患者性別、年齡無關(guān)，而與腫瘤大小、AFP、TNM分期、分化程度及有無門靜脈癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。其中腫瘤大小≤5 cm、AFP≤200 μg/ml、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、高+中分化、未出現(xiàn)門靜脈癌栓和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌組織SSBP1表達較低，而腫瘤大小>5 cm、AFP>200 μg/ml、TNM分期Ⅲ+Ⅳ、低分化、出現(xiàn)門靜脈癌栓和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌組織SSBP1表達較高。見表5。

2.5 SSBP1表達與肝癌預(yù)后的相關(guān)性 SSBP1蛋白陽性表達患者中位生存時間為(29.78±4.05)個月，SSBP1蛋白陰性表達患者中位生存時間為(36.99±4.23)，SSBP1蛋白陽性表達患者中位生存時間顯著短于SSBP1蛋白陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SSBP1蛋白陽性表達患者術(shù)后生存率為46.88%(30/64)，SSBP1蛋白陰性表達患者術(shù)后生存率為68.75%(11/16)，SSBP1蛋白陽性表達患者術(shù)后生存率顯著低于SSBP1蛋白陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SSBP1蛋白陽性表達患者復(fù)發(fā)率為51.56%(33/64)，SSBP1蛋白陰性表達患者復(fù)發(fā)率為37.50%(6/16)，SSBP1蛋白陽性表達患者復(fù)發(fā)率顯著高于SSBP1蛋白陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表6。

表5 SSBP1表達與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：與對應(yīng)項比較,*P<0.05

表6 SSBP1表達與肝癌預(yù)后的相關(guān)性

注：與SSBP1(-)表達比較,*P<0.05

3 討論

肝癌是高居我國惡性腫瘤病死率第二位的常見惡性腫瘤，具有癥狀隱匿、進展快、病死率高的特點，其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種分子和多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前，手術(shù)切除、放療、化療是治療肝癌的主要手段，但這些方法遠期療效均不理想，患者5年生存率低，預(yù)后差[8]。因此，尋找有效的HCC分子標志物對于肝癌診斷和治療具有重要臨床意義。

線粒體是真核生物體內(nèi)介導(dǎo)能量轉(zhuǎn)換和新陳代謝的重要細胞器，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于生命活動至關(guān)重要。同時，多種核基因表達產(chǎn)物又能調(diào)控線粒體基因組的完整性，其中線粒體單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSBP1)是調(diào)控線粒體生成和功能的關(guān)鍵因子。人類SSBP1基因定位于第7號染色體，其結(jié)構(gòu)高度保守，包括4個外顯子和3個內(nèi)含子，主要參與線粒體DNA(mtDNA)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、損傷后修復(fù)過程[9-11]。因此，SSBP1表達異常將直接導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)異常或基因突變，最終造成惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Santos-Jr 等[12-14]發(fā)現(xiàn)超過70%的惡性腫瘤細胞存在SSBP1、mtDNA突變，且SSBP1活性與mtDNA拷貝數(shù)具有正相關(guān)性。SSBP1活性異常升高造成mtDNA的過度復(fù)制和大量不成熟線粒體DNA前體生成，進而導(dǎo)致線粒體功能障礙。已有研究證實，SSBP1表達失調(diào)與乳腺癌、大腸癌、卵巢癌、骨肉瘤等惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。Kim等[15]發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織高表達SSBP1，可能與癌細胞能量代謝增高有關(guān)。Ye等[16]研究證實HCC組織SSBP1表達較癌旁組織顯著升高，推測可能是由于腫瘤微環(huán)境的變化導(dǎo)致了SSBP1突變，且Ras-Raf-MEK-ERK通路在這一過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但該研究并未探討SSBP1與肝癌臨床病理特征的關(guān)系。

本研究首先采用免疫組化和Real time-PCR技術(shù)檢測了SSBP1 mRNA和蛋白在80例肝癌組織和癌旁組織的表達狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSBP1在肝癌組織的表達水平和陽性表達率顯著高于癌旁組織，與魯睿等[17]報道一致。且SSBP1在4種肝癌細胞系(HepG2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7)的表達水平也顯著高于正常人肝細胞L-02。此外，SSBP1表達與腫瘤大小、AFP、TNM分期、分化程度及有無門靜脈癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。隨著腫瘤直徑增大、腫瘤分期增加及惡性程度增高，SSBP1表達顯著升高；此外，有門靜脈癌栓和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌組織SSBP1表達水平和陽性表達率顯著高于未出現(xiàn)門靜脈癌栓和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌組織，表明SSBP1可能參與了肝癌發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移過程。患者術(shù)后隨訪6個月，我們發(fā)現(xiàn)SSBP1陰性表達的患者平均生存時間較SSBP1陽性表達的患者顯著延長，生存率較SSBP1陽性表達的患者顯著提高，復(fù)發(fā)率較SSBP1陽性的患者顯著降低，說明SSBP1高表達提示預(yù)后不良。我們和他人研究結(jié)果均表明以肝癌組織異常表達的SSBP1為切入點有可能有利于揭示肝癌發(fā)病的具體分子機制，并且SSBP1可能作為潛在的腫瘤標志物，這對于肝癌診斷、療效及預(yù)后評估具有重要臨床價值[18,19]。

總之，本實驗表明SSBP1基因在肝癌組織和肝癌細胞表達上調(diào)，在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且對預(yù)后評估具有一定臨床價值。SSBP1可作為肝癌診斷和治療的早期腫瘤標志物，有可能成為防治肝癌的潛在靶點。然而，由于本研究樣本較少，還需擴大樣本量進一步驗證SSBP1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用。此外，SSBP1介導(dǎo)肝癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機制尚待后續(xù)研究。

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Expression and significance of SSBP1 in hepatocellular carcinoma tissues

MARongfen,CHENQiuying,LIUYanfen.

DepartmentofClinicalLaboratory,People’sHospitalofTangshanCity,Hebei,Tangshan063001,China

Objective To investigate the expression and significance of mitochondria single-strand DNA protein 1 (SSBP1) in hepatocellular carcinoma tissues.Methods The primary hepatocellular carcinoma tissue samples from 80 patients who were admitted and treated by surgical ablation in our hospital from December 2013 to December 2016 were collected.The expression levels of SSBP1 mRNA and protein in 80 cases of hepatocellular carcinoma tissues and cancer adjacent tissues were detected by Real time-PCR and immunohistochemistry (SP).The correlation between SSBP1 expression levels and clinicopathological parameters of hepatocellular carcinoma was analyzed.moreover the expression levels of SSBP1 in hepatocellular carcinoma cell strains including HepG2, MHCC97H, SMMC7721,Huh7 as well as normal hepatocellular line-L-027 were detected.Results The expression levels and positive expression rate of SSBP1 in cancer tissues and adjacent tissues were 1.87±0.23,0.36±0.05 and 80.00% (64/80),15.00% (12/80), respectively,and the differences were statistically significant (P<0.05).The expression levels and positive expression rate of SSBP1 in cancer tissues were obviously higher than those in cancer adjacent tissues (P<0.05).Moreover the expression levels and positive expression rate of SSBP1 in HepG2 cells were significantly higher than those in MHCC97H,SMMC7721,Huh7 and L-027 cells (P<0.05).Furthermore the expression levels of SSBP1 were closely correlated to tumor size, AFP,TNM clinical stage,differentiation degree,portal vein tumor thrombus and lymph node metastasis (P<0.05).Conclusion The overexpression of SSBP1 exists in hepatocellular carcinoma tissues and cell strains,which is related with clinicopathological parameters of hepatocellular carcinoma,moreover, the high-expression of SSBP1 is closely correlated to poor prognosis of patients.

hepatocellular carcinoma; mitochondria single-strand DNA protein 1; prognosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.16.006

063001 河北省唐山市人民醫(yī)院檢驗科

R 735.7

A

1002-7386(2017)16-2428-04

2017-03-29)