藍(lán)莓酒降酸酵母篩選鑒定及能力測(cè)定

李 迪，李靜媛

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109)

藍(lán)莓酒降酸酵母篩選鑒定及能力測(cè)定

李 迪，李靜媛

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109)

藍(lán)莓酒酸含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酒體不協(xié)調(diào)，以藍(lán)莓果皮表面獲取的菌種作為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)自然篩選和紫外誘變篩選，以降酸量為依據(jù)選出降酸效果顯著的菌株，并對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，篩選出的菌株降酸量為5.2 g/L。利用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和分子生物學(xué)的方法，最終確定篩選菌株為釀酒酵母。該菌株能最大限度的將糖轉(zhuǎn)化為酒精，轉(zhuǎn)化率達(dá)91%，最終殘?zhí)菫?.4 g、酒精度為7.2%vol，同時(shí)對(duì)糖、酒精也有良好的耐受性。篩選出的釀酒酵母實(shí)現(xiàn)了在發(fā)酵的同時(shí)進(jìn)行降酸，這對(duì)于藍(lán)莓酒業(yè)的發(fā)展來(lái)說(shuō)提供了良好的酵母資源，也為微生物釀造提供了一個(gè)良好的發(fā)展方向。

微生物； 藍(lán)莓酒； 降酸酵母； 篩選

藍(lán)莓酒是以藍(lán)莓漿果為原料，經(jīng)自然發(fā)酵釀制而成的低度營(yíng)養(yǎng)保健酒[1]。藍(lán)莓酒較好地保留了漿果中天然花色苷、果膠質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[2]，具有延緩衰老、保護(hù)視力、增強(qiáng)人體免疫力等功能。但因酒中有機(jī)酸含量過(guò)高，酒體過(guò)于酸澀，口味粗糙，酒體不協(xié)調(diào)，破壞了酒的口感和品質(zhì)，所以必須對(duì)藍(lán)莓酒進(jìn)行嚴(yán)格的降酸處理。目前藍(lán)莓酒降酸的主要方法有3種，即化學(xué)降酸法[3]、物理降酸法、微生物降酸法[4]。物理、化學(xué)降酸需耗費(fèi)大量能源輔料，對(duì)酒負(fù)面影響較大且降酸具有選擇性。與之相比，微生物降酸具有明顯優(yōu)勢(shì)，降酸的同時(shí)，增加酒的穩(wěn)定性，提升酒風(fēng)味復(fù)雜性和口感[3]。

微生物降酸的一種途徑是利用乳酸菌在蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）中將蘋(píng)果酸降解為乳酸，迄今為止，國(guó)外生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)紅葡萄酒甚至一些佐餐紅葡萄酒大部分都采用MLF降酸，但這個(gè)過(guò)程一般發(fā)生在酒精發(fā)酵之后，耗時(shí)長(zhǎng)且不易控制[5]；另一種途徑是利用酵母進(jìn)行降酸，較典型的有利用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）在蘋(píng)果酸-酒精發(fā)酵(Malo-alcoholic Fermentation,MAF)中將蘋(píng)果酸分解為乙醇和CO2，從而降低酒的酸度[6-9]，該方法能較好保持酒的清爽感與口感[10]，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵的同時(shí)降酸。但裂殖酵母發(fā)酵能力較弱，會(huì)產(chǎn)生不良?xì)馕丁?/p>

利用酵母進(jìn)行果酒降酸是一個(gè)較新的研究方向，目前，篩選應(yīng)用于藍(lán)莓酒降酸的酵母研究較少。本研究擬以藍(lán)莓果皮表面的菌種為出發(fā)菌株，經(jīng)自然篩選和紫外誘變篩選出降酸及發(fā)酵能力強(qiáng)的酵母并對(duì)其發(fā)酵特性進(jìn)行探索，以應(yīng)用到藍(lán)莓酒發(fā)酵中，以期實(shí)現(xiàn)在發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行降酸處理。試驗(yàn)所篩出的菌種可以作為新菌種進(jìn)行生產(chǎn)，在一定程度上豐富了果酒生物降酸的內(nèi)涵，為提高藍(lán)莓酒的口感品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓：市售；藍(lán)莓的糖含量是138 g/L，酸含量是9.146 mg/g。

商業(yè)酵母(Saccharomyces cerevisiae）AWRI R2：拉曼公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose YPDfgreg)培養(yǎng)基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、瓊脂粉2%。

模擬藍(lán)莓汁培養(yǎng)基：葡萄糖13%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸銨0.2%、七水硫酸鎂0.04%、酵母膏0.1%、草酸0.197 g/L、酒石酸0.333 g/L、蘋(píng)果酸1.170 g/L、檸檬酸7.446 g/L。

WL瓊脂培養(yǎng)基：酵母膏0.4%、胰蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、磷酸二氫鉀0.055%、氯化鉀0.0425%、氯化鈣0.0125%、硫酸鎂0.0125%、氯化鐵0.00025%、硫酸錳0.00025%、瓊脂2%、溴甲酚綠0.0022%。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅醫(yī)療器械有限公司；KDM電子調(diào)溫電熱套（1000 mL），山東華魯電熱儀器有限公司；H13221臺(tái)式酸度測(cè)定儀，北京慧龍環(huán)科環(huán)境儀器有有限公司；SPX-250BS-II生化培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司；HYQ-180s搖床，武漢匯誠(chéng)生物科技有限公司；BSC-1100ⅡA2生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；酒精計(jì)，陸恒生物科技有限公司；電子天平，美國(guó)Ohaus公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌液制備

稱(chēng)取2 g藍(lán)莓樣品于2個(gè)250 mL三角瓶中，加幾粒玻璃珠，并加入100 mL無(wú)菌生理鹽水，室溫下以100 r/min搖床振蕩20 min后，取出靜置20 min。量取上清液5 mL，加入到100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，以25℃、100 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h。以同樣的條件再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)1次，獲得菌液。

1.3.2 菌種分離

將菌液按照 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋。將稀釋菌液均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，獲得單菌落。

1.3.3 菌種的自然篩選

將分離所得的100株單菌落分別接種到100 mL模擬藍(lán)莓汁培養(yǎng)基中，于25℃、100 r/min搖床中培養(yǎng)4 d。用濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定菌液，據(jù)降酸量初步獲得2株降酸能力較好的菌株，斜面4℃保存。

1.3.4 菌種的紫外誘變

（1）分別取初篩所得2株菌轉(zhuǎn)入YPD培養(yǎng)基，進(jìn)行菌種活化。分別吸取酵母菌懸液5 mL于平板上，打開(kāi)20 W紫外燈，距離20 cm，分別照射0 min、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min。

（2）將誘變后的菌液加入到2倍體積的新鮮YPD培養(yǎng)基中，避光放置在28℃培養(yǎng)箱中，2 h后取出。

（3）將未照射的對(duì)照菌液和經(jīng)紫外燈照射的菌液稀釋涂布在YPD固體培養(yǎng)基上，并用黑布包裹，28℃恒溫培養(yǎng)48 h。

（4）挑取長(zhǎng)出的40個(gè)菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中24 h，進(jìn)行菌種活化。

（5）按1%接種量將活化的酵母菌液接種到模擬藍(lán)莓汁培養(yǎng)基中，以28℃、100 r/min搖床培養(yǎng)4 d后，用濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定酵母菌液和空白培養(yǎng)基，選出1株降酸量最大的菌株，斜面4℃保存。

1.3.5 菌種鑒定

將獲得的酵母菌株，在YPD培養(yǎng)基活化后涂布到WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5 d后觀(guān)察，根據(jù)菌落顏色及形態(tài)與藍(lán)莓酒相關(guān)酵母類(lèi)別鑒別表（表1）進(jìn)行對(duì)比，初步確定菌種種類(lèi)[11]。

挑取篩選菌株中具有典型形態(tài)的菌株，送中科院微生物研究所進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

1.3.6 篩選菌株發(fā)酵性能分析

（1）發(fā)酵速率測(cè)定：將分篩選出的菌株以及1株商業(yè)酵母分別活化接入到模擬藍(lán)莓汁培養(yǎng)基中，每間隔24 h稱(chēng)1次培養(yǎng)瓶的重量，發(fā)酵溫度為25℃，每次與前一次的差值即為CO2的質(zhì)量損失[12]。

（2）OD600nm值的測(cè)定：將篩選得到的菌株以及1株商業(yè)酵母分別活化接種到模擬藍(lán)莓汁培養(yǎng)基中，每隔2 h進(jìn)行取樣，測(cè)其OD600nm，至穩(wěn)定末期，繪制曲線(xiàn)。

（3）酵母發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定：發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液的殘?zhí)呛途凭窟M(jìn)行測(cè)定，判斷該菌株對(duì)糖的轉(zhuǎn)化能力及轉(zhuǎn)化效率。

1.3.7 篩選菌株耐受性分析

（1）酒精耐受性：將模擬藍(lán)莓汁培養(yǎng)基的酒精度調(diào)整為12%vol，接入已活化的酵母菌，在28℃下靜置培養(yǎng)，每隔3 h測(cè)其OD600nm，記錄數(shù)據(jù)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

（2）糖耐受性的測(cè)定：將模擬藍(lán)莓汁培養(yǎng)基的糖濃度調(diào)整為20%，接入已活化的酵母菌，接種量為1×106cfu/mL，在28℃條件下靜置培養(yǎng)，每隔3 h振蕩測(cè)OD600nm，記錄數(shù)據(jù)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.8 指標(biāo)的測(cè)定

（1）總酸滴定

參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》。

（2）酒精度測(cè)量

參考GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度（酒精度）的測(cè)定》。

（3）降酸能力測(cè)定

以降酸量衡量降酸能力，公式如下：

式中：X—樣品的降酸量，g/L；C—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；V0—空白培養(yǎng)基消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V1—樣品滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2—吸取樣品的體積，mL；S1—0.075。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選

挑取100株分離獲得的菌株進(jìn)行降酸量計(jì)算，得到的降酸范圍在0.2～3.7 g/L之間，選取降酸效果明顯的20株繪制出圖1，由圖1可看出，菌種9號(hào)和13號(hào)的降酸量分別為3.7 g/L、3.4 g/L，降酸效果最好，因此選取菌種9號(hào)及13號(hào)進(jìn)行紫外誘變。

挑取40株紫外誘變后分離獲得的菌株進(jìn)行降酸量計(jì)算，得到的降酸范圍在3.8～5.2 g/L，選出10株降酸好的菌，繪制降酸量見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，誘變后的菌株之間降酸效果差別不大，但相比自然篩出的菌株降酸能力顯著提高。選6號(hào)為最終的菌株，進(jìn)行菌種鑒定。

表1 WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)藍(lán)莓酒相關(guān)酵母的鑒別

圖1 酵母菌降酸量

圖2 酵母菌降酸量

2.2 菌種鑒定

篩選出的6號(hào)酵母菌在WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落顏色為奶油色至綠色，表面為球形突起，光滑，不透明，奶油狀的菌株，菌株形態(tài)見(jiàn)圖3，與表1對(duì)比，初步確定為釀酒酵母。

圖3 篩選菌株在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

對(duì)分離菌株的rDNA ITS區(qū)進(jìn)行克隆和測(cè)序，堿基序列如下：

TTTCCGTAGGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT AAAGAAATTTAATAATTTTGAAAATGGATTTTT TTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACT GGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGC CGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAG GCCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACG GTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAA TTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAG TTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATT CGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACAC AAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAA AAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAA ATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGT TCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG ATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATC ATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGG TATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATT TCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGA TACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCT TTTCATTGGATGTTTTTTTTTCCAAAGAGAGGT TTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACG GTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCT TTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATA AGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCA

與Saccharomyces cerevisiea模式菌株S288C的rDNA ITS區(qū)序列(GenBank accession number:Z73329)進(jìn)行對(duì)照和比較，分析結(jié)果顯示，分離菌株ITS區(qū)堿基序列與Saccharomyces cerevisiea模式菌株的相應(yīng)堿基序列相似率為99.5%，分離的酵母菌株可確定為釀酒酵母。

2.3 酵母發(fā)酵性能測(cè)定

2.3.1 酵母發(fā)酵速率測(cè)定

比較篩選酵母與商業(yè)酵母的發(fā)酵性能，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，篩選酵母的CO2產(chǎn)生速率及產(chǎn)生量與商業(yè)酵母相比，基本一致，具有良好的發(fā)酵性能。

圖4 不同酵母菌發(fā)酵速率的比較

2.3.2 OD600nm值的測(cè)定

將篩選所得的酵母和商業(yè)酵母進(jìn)行生長(zhǎng)特性的比較，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可看出，篩選酵母和商業(yè)酵母比較，生長(zhǎng)曲線(xiàn)相似，篩選酵母的遲滯期與商業(yè)酵母相比沒(méi)有明顯的區(qū)別，對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)較快，細(xì)胞分裂快，具備良好的發(fā)酵生長(zhǎng)特性。

圖5 酵母生長(zhǎng)性能比較分析

2.3.3 酵母發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液中的殘?zhí)呛考耙掖己窟M(jìn)行測(cè)量，測(cè)得發(fā)酵液的殘?zhí)橇繛?.4 g＜4.0 g，說(shuō)明菌能夠充分利用培養(yǎng)基的糖，有良好發(fā)酵糖的能力。酒精度為7.2%vol，達(dá)到期望的酒精度數(shù)，說(shuō)明該菌具有較高的轉(zhuǎn)化率。

2.4 酵母耐受性評(píng)定

2.4.1 酒精耐受性

酒精對(duì)細(xì)胞的抑制作用比較復(fù)雜，重點(diǎn)體現(xiàn)在它能夠抑制酵母菌的存活、增殖速度和發(fā)酵力3個(gè)方面。本實(shí)驗(yàn)比較了篩選酵母和商業(yè)酵母在外加酒精培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的差異來(lái)考察酵母菌的酒精耐受性，生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖6。由圖6可知，篩選酵母和商業(yè)酵母相似，在酒精度為12%vol時(shí)生長(zhǎng)情況正常，說(shuō)明篩選出的酵母具有良好的酒精耐受性。

圖6 初始酒精度12%vol YPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.4.2 糖耐受性的測(cè)定

在葡萄酒工業(yè)中，糖是酒精發(fā)酵的基質(zhì)，也是酵母賴(lài)以生存的能源物質(zhì)，含糖量為20%及以上時(shí)，酵母菌的生長(zhǎng)發(fā)酵就會(huì)受到抑制，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可看出，在葡萄糖濃度為20%的培養(yǎng)基中篩選酵母的生長(zhǎng)曲線(xiàn)與商業(yè)酵母相似，說(shuō)明篩選的酵母菌具有良好的糖耐受性。

圖7 初始糖濃度為20%YPD培養(yǎng)基中酵母生長(zhǎng)曲線(xiàn)

3 結(jié)果與討論

本研究通過(guò)自然篩選和紫外誘變從藍(lán)莓果皮上篩出的酵母降酸效果良好，降酸量達(dá)5.2 g/L，同時(shí)對(duì)糖的發(fā)酵及酒精的轉(zhuǎn)化率也較高，酒精轉(zhuǎn)化率達(dá)91%。與常規(guī)的蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵相比，在不影響基本工藝的要求下，一定程度上彌補(bǔ)了耗時(shí)長(zhǎng)及不易控制等缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵的同時(shí)降酸，簡(jiǎn)化了工藝，具有較大優(yōu)勢(shì)。

本研究采用紫外誘變的方式篩出降酸顯著的菌株，這可能是由于紫外處理造成釀酒酵母的基因突變，從而實(shí)現(xiàn)降酸能力的提高?？v觀(guān)近幾年眾多學(xué)者、專(zhuān)家的研究，其改造手段主要是利用基因工程技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)對(duì)降酸酵母進(jìn)行基因改造。人們?cè)O(shè)想，把乳酸菌中的MLF基因通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入葡萄酒酵母中，使葡萄酒酵母在酒精發(fā)酵的同時(shí)，賦予其MLF降酸的功能[13]。目前，已對(duì)MLF基因及其調(diào)節(jié)基因進(jìn)行了定位和序列分析，轉(zhuǎn)基因方法已用于葡萄酒酵母工程菌的育種[14]。但對(duì)于進(jìn)行基因改造的酵母，仍面臨著許多問(wèn)題，如基因是否表達(dá)以及是否完全表達(dá)及其安全性、菌株的遺傳穩(wěn)定性等問(wèn)題[15]，這對(duì)于之后的研究及大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，仍需要更深入的研究和探索。

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Screening of an Acid-Reducing Yeast Strain for Blueberry Wine Production and Determination of Its Properties

LI Di and LI Jingyuan
(College of Food Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao,Shandong 266109,China)

Excessive acid in blueberry wine will damage the harmony of wine body.In this study,yeast strains obtained from the skin of blueberry were used as the starting strains.After natural selection and UV mutagenesis screening,a yeast strain with good performance in deacidification was selected,and the strain was identified.The results showed that,the deacidification amount of the strain was 5.2 g/L.The strain was identified as S.cerevisiae based on WL culture medium and molecular biology.Such strain could convert sugar into alcohol thoroughly and the conversion rate reached up to 91%.After the fermentation,the residual sugar content was 3.4 g and the content of alcohol was 7.2%vol.Besides,the strain had good tolerance for high sugar and high alcohol.The screened strain could achieve fermentation and deacidification simultaneously and it was a good choice for the production of blueberry wine.

microbe;blueberry wine;acid-reducing yeast;screening

TS262.7；TS261.4；TS261.1

A

1001-9286（2017）07-0046-06

10.13746/j.njkj2017082

國(guó)家自然基金青年基金（31501458）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金（6631113350）。

2017-04-07；

2017-06-21

李迪（1995-），女，本科，研究方向?yàn)槠咸丫漆勗欤籈-mail：lidi17854266337@163.com。

李靜媛（1985-），女，博士研究生，講師，研究方向?yàn)槠咸丫漆勗?；E-mail：jyli@qau.edu.cn。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-05-04；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170504.0841.001.html。