C 20or f54抑制食管癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

馬良，徐延鈞，李丹，郭步平，郭旭霞*

（長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2普外三科，3生殖遺傳中心，長(zhǎng)治 046000）

C 20or f54抑制食管癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

馬良1，徐延鈞2，李丹3，郭步平1，郭旭霞1*

（長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2普外三科，3生殖遺傳中心，長(zhǎng)治 046000）

目的觀察過表達(dá)C20orf54對(duì)食管癌細(xì)胞周期和凋亡的影響，探討C20orf54基因在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)C20orf54蛋白在食管癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)；應(yīng)用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá) C20orf54對(duì)食管癌細(xì)胞系EC9706細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的影響。結(jié)果C20orf54在食管癌組織中免疫反應(yīng)性顯著低于癌旁正常組織。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)C20orf54的EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制，且G0/G1期細(xì)胞積聚，周期阻滯，細(xì)胞凋亡增多。結(jié)論C20orf54 基因可能參與食管癌的生長(zhǎng)調(diào)控，食管癌的發(fā)生與C20orf54 基因的表達(dá)有關(guān)。

食管癌； C20orf54基因；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

C20orf54基因是人類核黃素轉(zhuǎn)移蛋白2基因（human ribofavin transporter 2，hRFT2），也稱為SLC52A3基因，是近幾年新發(fā)現(xiàn)的與食管癌發(fā)病相關(guān)基因。該基因定位于20p13，其mRNA全長(zhǎng)2716 bp（NM_033409.3），共有5個(gè)外顯子，編碼一個(gè)由469個(gè)氨基酸組成的開放閱讀框蛋白。C20orf54被認(rèn)為在人體吸收核黃素過程中起重要作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)，C20orf54基因中多個(gè)位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致一種罕見的神經(jīng)退行性疾病Brown-Vialetto-Van Laere syndrome（BVVLS）的發(fā)生[1-3]，這些突變導(dǎo)致C20orf54對(duì)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)定位核黃素的能力失敗，進(jìn)而體內(nèi)核黃素水平下降。在臨床治療中補(bǔ)充核黃素可以對(duì)其中一些BVVLS病人起到很好的療效[4]；將核黃素應(yīng)用于臨床放化療，可有效緩解黏膜炎癥，對(duì)黏膜增生惡化有很好的防治作用[5]。C20orf54基因編碼的蛋白含有11 個(gè)跨膜區(qū)，可以特異高效將核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，在食管癌高發(fā)區(qū)實(shí)施核黃素強(qiáng)化鹽可以顯著增加機(jī)體內(nèi)的核黃素水平，延緩和逆轉(zhuǎn)食管癌前病變的發(fā)展進(jìn)程，降低食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[6]。然而，C20orf54在腫瘤，特別是在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制尚不清楚。本研究在檢測(cè)食管癌組織中C20orf54表達(dá)水平的基礎(chǔ)上，分析了過表達(dá)C20orf54對(duì)食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期及凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，初步探討C20orf54在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料與方法

1 主要材料和試劑

臨床標(biāo)本取自2014年1月至2015年3月在長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院住院期間經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)、術(shù)前均未經(jīng)放療、化療及其他治療的58例食管癌患者的食管鱗癌組織及癌旁（距腫瘤邊緣＞3cm）的正常食管黏膜組織，其中男性32例，女性26例，年齡45～70歲。食管鱗癌細(xì)胞株EC9706購(gòu)自中科院北京腫瘤細(xì)胞庫(kù)。

C20orf54基因引物設(shè)計(jì)及構(gòu)建過表達(dá)載體pCDNA-C20orf54-Flag由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供?？贵w：兔抗人C20orf54多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司； HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物公司。Lipofectam ine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

2 免疫組織化學(xué)染色

組織標(biāo)本經(jīng)4%的多聚甲醛固定液固定、石蠟包埋、切片（厚度4μm），微波修復(fù)法進(jìn)行進(jìn)行抗原修復(fù)，取500 m l枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）于微波盒中，加熱直至沸騰，切片脫蠟入水后置于耐高溫塑料切片架上。放人己沸騰的緩沖液中，微波繼續(xù)處理15m in，取出微波盒冷卻至室溫，取出玻片。先用蒸餾水沖洗2次，隨后，PBS洗2～3次（各5min），3% H2O2室溫靜置10m in，兔抗C20orf54多克隆抗體（1:500）室溫靜置1h，PBS洗2～3次（各5min），HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:500）37℃孵育1h，PBS洗3次（各5m in），DAB顯色10m in，PBS洗2次各5m in，蘇木素復(fù)染2m in后鹽酸酒精分化，自來水沖洗10m in，脫水，透明、封片后鏡檢。觀察10個(gè)高倍視野，Image Proplus軟件統(tǒng)計(jì)陽性染色標(biāo)記細(xì)胞的平均光密度。

3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)C20orf54細(xì)胞株的建立

食管癌細(xì)胞株EC9706用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔日換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞備用。轉(zhuǎn)染前 24 h 將細(xì)胞接種至 6 孔板，接種量1×106個(gè)細(xì)胞/孔，轉(zhuǎn)染時(shí)匯合度達(dá)90%以上，載體與脂質(zhì)體比例為1μg:3μl，空白對(duì)照組（EC9706）只轉(zhuǎn)染Lipofectam ine 2000試劑，陰性對(duì)照組（EC9706/pCDNA）轉(zhuǎn)染空載體pCDNA-Flag，實(shí)驗(yàn)組（EC9706/C20orf54-Flag）轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA-C20orf54-Flag。轉(zhuǎn)染4～6h后，細(xì)胞換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染24h后更換含G418（200μg/m l）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)兩周，待對(duì)照細(xì)胞全部死亡時(shí)基本已得到G418抗性細(xì)胞的穩(wěn)定克隆。挑選單個(gè)細(xì)胞的陽性克隆至24孔板繼續(xù)篩選培養(yǎng)，篩選出的穩(wěn)定株分別為陰性對(duì)照組EC9706/pCDNA和實(shí)驗(yàn)組EC9706/C20orf54-Flag。

4 M TT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

3組穩(wěn)定細(xì)胞傳代培養(yǎng)24h后，分別接種于96孔板（1×103細(xì)胞/孔），每組12孔，分別于24h，48h，72h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入20μl MTT試劑，37℃、5% CO2繼續(xù)孵育4h，小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入100μl DMSO，充分溶解結(jié)晶，429nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光OD值。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡

細(xì)胞周期檢測(cè)：穩(wěn)定細(xì)胞在6孔板內(nèi)培養(yǎng)48h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，2000 r/m in離心5m in，棄上清。用預(yù)冷的1×PBS洗滌收集的細(xì)胞3次，2000r/m in，5m in，棄上清，以0.5 m l 1×PBS重懸細(xì)胞，快速加入3.5 m l 70%預(yù)冷的乙醇，吹打均勻，4℃儲(chǔ)存過夜。 離心乙醇固定過的細(xì)胞，棄上清，1×PBS洗滌細(xì)胞3次去除殘留的乙醇，用含有0.2mg RNase A的1m l PI/Triton X-100染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100）重懸細(xì)胞， 37℃避光孵育15m in后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Annexin-V-FITC 和 PI雙染法檢測(cè)凋亡：取穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)48h、72h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的3組細(xì)胞，用不含EDTA的0.25%的胰酶消化細(xì)胞，2000r/m in離心5m in，棄上清；用1×PBS洗滌細(xì)胞2次，2000r/min離心5m in，棄上清；加入500μl Binding Buf er懸浮細(xì)胞后，加入5μl Annexin V-EGFP混勻，再加入5 μl PI，混勻；室溫避光10m in，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 食管癌組織中C20orf54免疫反應(yīng)性降低

對(duì)58例食管癌組織和癌旁正常組織C20orf54進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示， C20orf54免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物主要定位在食管鱗狀上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中（圖1）。Image Proplus分析結(jié)果顯示，癌旁組織C20orf54免疫反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度為0.30±0.04，而食管癌組織C20orf54免疫反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度為0.15±0.07，食管癌組織中C20orf54免疫反應(yīng)性明顯降低。

圖1 食管癌組織C20orf54的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。 A，食管癌組織；B，癌旁組織；箭頭示C20orf54免疫反應(yīng)產(chǎn)物；比例尺，100μm；C，食管癌組織C20orf54免疫反應(yīng)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與癌旁組織比較，0.01＜P＜0.05Fig. 1 Immunohistochem ical detection for C20orf54 expression in esophageal cancer tissue. A, esophageal cancer tissue; B, adjacent tissue; arrows indicating C20orf54 immunoreactive products; scale bar, 100μm; C, statistical analysis of C20orf54 immunoreactivity in esophageal cancer tissue; *, 0.01＜P＜0.05, compared w ith adjacent tissue

2 過表達(dá)C20orf54抑制EC9706細(xì)胞增殖

為了明確C20orf54對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，用真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pCDNA-C20orf54-Flag轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)C20orf54的細(xì)胞株。用MTT分析檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株過表達(dá)C20orf54對(duì)EC9706細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖能力無明顯差異，而過表達(dá)C20orf54的細(xì)胞增殖能力顯著降低（表1），表明C20orf54對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用。

表1 過表達(dá)C20orf54對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的影響Tab. 1 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell proliferation

3 過表達(dá)C20orf54使EC9706細(xì)胞周期阻滯在G0/ G1期

為了明確C20orf54是否調(diào)控食管癌的細(xì)胞周期，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了過表達(dá)C20orf54對(duì)EC9706細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，過表達(dá)C20orf54的細(xì)胞，其G0/G1期細(xì)胞顯著增多，而S期細(xì)胞顯著減少，G2/M期無顯著變化（圖2，表2），由此表明，過表達(dá)C20orf54使EC9706細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，具有明顯抑制細(xì)胞增殖作用。

圖2 過表達(dá)C20orf54對(duì)EC9706細(xì)胞周期的影響。A，空白組；B，陰性對(duì)照組；C，實(shí)驗(yàn)組Fig. 2 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell cycle. A, blank control group; B, negative control group; C, experimental group

表2 過表達(dá)C20orf54對(duì)EC9706細(xì)胞周期的影響Tab. 2 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell cycle

4 過表達(dá)C20orf54促進(jìn)EC9706細(xì)胞凋亡

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C20orf54的EC9706細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率無明顯差異，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率顯著升高（圖3，表3）。

圖3 過表達(dá)C20orf54對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響。A，空白組；B，陰性對(duì)照組；C，實(shí)驗(yàn)組Fig. 3 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell apoptosis. A, blank control group; B, negative control group; C, experimental group

討 論

食管癌在我國(guó)高發(fā)，是惡性腫瘤相關(guān)死亡的重要原因，探究其病因十分重要。C20orf54在人小腸粘膜上皮攝取核黃素的過程中發(fā)揮重要作用[6]，核黃素，即維生素B12，一種水溶性維生素，需要從體外攝取。在人體內(nèi)以黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）形式存在，參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，參與體內(nèi)很多調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的化學(xué)反應(yīng)，如碳水化合物、氨基酸、脂肪酸的氧化代謝等。核黃素需要從體外攝入，人體自身不能合成，C20orf54負(fù)責(zé)體內(nèi)核黃素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。

表3 過表達(dá)C20orf54對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響（%，±s）Tab. 3 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell apoptosis (%,±s)

表3 過表達(dá)C20orf54對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響（%，±s）Tab. 3 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell apoptosis (%,±s)

*，與空白組比較，0.01＜P＜0.05；#與陰性對(duì)照組比較，0.01＜P＜0.05*, 0.01＜P＜0.05, compared w ith blank；#, 0.01＜P＜0.05, compared w ith negative control

組別Group Apoptotic rate (%) 48 h 72 h空 白 組Blank control group 5.20±0.74 5.82±1.01陰性對(duì)照組Negative control group 5.63±0.82 6.27±0.87實(shí) 驗(yàn) 組Experimental group 13.04±1.53*#14.26±1.77*#

在食管癌高發(fā)區(qū)進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究表明，核黃素代謝異常是食管癌發(fā)生的重要背景，食管癌高發(fā)區(qū)居民膳食中普遍存在缺乏核黃素的現(xiàn)象。核黃素缺乏可引起皮膚、口腔及食道的炎癥，進(jìn)而引起食管上皮細(xì)胞萎縮、增生等病理變化；核黃素缺乏還會(huì)增加食管上皮對(duì)亞硝胺等致癌物質(zhì)的敏感性，間接促進(jìn)食管癌的發(fā)生發(fā)展[7,8]。

本實(shí)驗(yàn)觀察到C20orf54在食管鱗癌組織中表達(dá)有所下降。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定過表達(dá)C20orf54的食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑；流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定過表達(dá)C20orf54的EC9706細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞顯著增多，而S期細(xì)胞顯著減少，G2/M期沒有顯著變化，且細(xì)胞凋亡率明顯增加。本研究結(jié)果進(jìn)一步提示了 C20orf54 基因可能參與食管癌的生長(zhǎng)調(diào)控。C20orf54基因可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌基因的角色。該研究為進(jìn)一步尋找食管癌致病因素，建立食管癌高危人群篩查和早期診斷的方法，明確食管癌發(fā)生機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] Green P, W iseman M, Crow YJ, et al. Brown-Vialetto-Van Laere syndrome, a pontobulbar palsy w ith deaf iess, is caused by mutations in C20orf54. Am J Hum Genet, 2010, 86(3): 485-489.

[2] Bosch AM, Abeling NG, Ijlst L, et al. Brown-Vialetto-Van Laere and Fazio Londe syndrome is associated w ith a ribofavin transporter defect m im icking m ild MADD: a new inborn error of metabolism with potential treatment. J Inherit Metab Dis, 2011, 34(1): 159-164.

[3] Dezfouli MA, Yadegari S, Nafissi S, et al. Four novel C20orf54 mutations identifed in Brown-Vialetto-Van Laere syndrome patients. J Hum Genet, 2012, 57(9): 613-617.

[4] Bosch AM, Stroek K, Abeling NG, et al. The Brow n-Vialetto-Van Laere and Fazio Londe syndrome revisited: natural history, genetics, treatment and future perspectives. Orphanet J Rare Dis, 2012, 7(1): 1-13.

[5] Hassan I，Chibber S, Naseem I. Vitam in B2：a promising adjuvant in cisplatin based chemoradiotherapy by cellular redox management. Food Chem Toxicol. 2013, 59(3): 715-723.

[6] Fujimura M, Yamamoto S, Murata T, et al. Functional characteristics of the human ortholog of ribof avin transporter 2 and riboflavin-responsive expression of its rat ortholog in the small intestine indicate its involvement in ribofavin absorption. J Nutr, 2010, 140(10): 1722-1727.

[7] 商曉青，趙瑾，李鋒. 核黃素與食管癌發(fā)生的研究進(jìn)展.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展，2013，13（18）：3591-3593.

[8] 李紀(jì)賓，鄒小農(nóng)，王華余，等. 鹽亭縣核黃素強(qiáng)化鹽干預(yù)試驗(yàn)人群食管癌前病變與轉(zhuǎn)歸的研究. 中華腫瘤防治雜志，2009，16（5）：325-328.

C20orf54 inhibits the p roliferation of EC9706 cells and induces their apoptosis

Ma Liang1, Xu Yanjun2, Li Dan3, Guo Buping1, Guo Xuxia1*
(1Clinical Laboratory,2General Surgery Clinic Ⅲ,3Reproductive Medicine Center, Peace Hospital of Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China)

ObjectiveTo study the ef ect of C20orf54 overexpression on the cell cycle and apoptosis of EC9706 cell line and to investigate the role of C20orf54 in the occurrence and development of esophageal carcinoma.MethodsThe expression of C20orf54 in esophageal cancer tissue and normal esophageal mucosa was detected by immunohistochem ical staining. The ef ect of C20orf54 overexpression on the proliferative ability, apoptosis and cell cycle of esophageal cancer cell line EC9706 was detected by MTT and fow cytometry.ResultsImmunohistochem ical staining results showed that C20orf54 level was lower in esophageal cancer tissue than in adjacent tissue. MTT and fow cytometry results showed that for those EC9706 cells transfected w ith and stably expressing C20orf54, the grow th was signif cantly inhibited, G0/G1 cells accumulated, the cell cycle was arrested, and apoptosis increased.ConclusionsC20orf54 gene may be involved in the regulation of esophageal cancer development. Esophageal carcinogenesis is related to the expression of C20orf54 gene.

Esophageal carcinoma; C20orf54 gene; cell cycle; apoptosis

R361

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.03.009

2016-12-07

2017-05-22

長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（CX201405）

馬良，女（1985年），回族，主管檢驗(yàn)師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：305983534@qq.com