吸入細(xì)顆粒物在小鼠體內(nèi)多器官分布及其組織損害的組織化學(xué)檢測(cè)

馬葉冰，程培培，呂新，袁廷國(guó)，向菲

（1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢430030；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科，武漢 430022）

吸入細(xì)顆粒物在小鼠體內(nèi)多器官分布及其組織損害的組織化學(xué)檢測(cè)

馬葉冰，程培培1，呂新#，袁廷國(guó)Δ，向菲2*

（1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢430030；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科，武漢 430022）

目的探討我國(guó)大氣污染的主要成分細(xì)顆粒物（PM 2.5）被吸入后在機(jī)體內(nèi)的分布情況。方法選用碳粉顆粒制成懸液，于霧化箱中超聲霧化使小鼠吸入碳粉顆粒，6周后取小鼠臟器并行HE染色明確碳粉顆粒的體內(nèi)分布，Masson三聯(lián)染色檢測(cè)肺組織膠原沉積，肺組織免疫熒光染色檢測(cè)F4/80和TGF-β1蛋白的免疫反應(yīng)性表達(dá)。結(jié)果吸入體內(nèi)的碳粉顆粒主要沉積于肺泡及肺間質(zhì)中，并誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞在肺內(nèi)聚集，以及誘導(dǎo)肺組織膠原纖維沉積和TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)；全身臟器中，脾臟內(nèi)有較多的碳粉沉積，其他臟器如心、肝、小腸內(nèi)也見(jiàn)少許分布。結(jié)論可吸入的細(xì)顆粒物主要分布于肺，引起肺泡腔變小、肺間隔增厚和膠原纖維沉積，并可以到達(dá)全身其他臟器，可能造成全身性危害。

細(xì)顆粒物；分布；呼吸

目前，我國(guó)大氣污染嚴(yán)重。2016年5月20日，我國(guó)政府公布的《2015年中國(guó)環(huán)境狀況公報(bào)》顯示，目前我國(guó)主要的空氣污染物是細(xì)顆粒物（PM 2.5）、臭氧和可吸入顆粒物（PM 10），以它們?yōu)槭滓廴疚锒鴮?dǎo)致空氣質(zhì)量超標(biāo)的天數(shù)分別占66.8%、16.9%和15.0%[1]。其中，PM 2.5被吸入后，可到達(dá)呼吸系統(tǒng)的終端--肺泡，并能被吸收入血。所以，研究者們格外重視對(duì)PM 2.5的研究。流行病學(xué)分析證實(shí)PM 2.5與糖尿病、哮喘和高血壓等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[2]。然而，PM 2.5被吸入機(jī)體后，究竟可以到達(dá)哪些部位，對(duì)機(jī)體究竟有何具體危害作用，此方面的報(bào)道尚不多見(jiàn)。為此，我們進(jìn)行了吸入PM 2.5在體內(nèi)分布的研究。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為C57BL/6J小鼠，購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心?？晌爰?xì)顆粒物選用碳粉顆粒，所用碳粉為日本三菱生產(chǎn)的色素碳黑MA100，顆粒直徑24nm?？故驠4/80抗體購(gòu)于Santa Cruz公司，抗鼠TGF-β1抗體購(gòu)于R&D公司，A lexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗鼠和CY3標(biāo)記山羊抗鼠購(gòu)自谷歌生物。

2 碳粉懸液的配制

用無(wú)菌生理鹽水將碳粉配制成濃度為2000μg/ m l的碳粉懸液，加入超聲霧化儀中霧化使用。

3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

雄性、鼠齡8-10周的C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分成正常對(duì)照組與碳粉霧化吸入組，每組5只。

4 碳粉霧化方法

將小鼠置于帶開放孔的霧化箱中，每天兩次（上午、下午各一次）霧化吸入碳粉，霧化劑量每次為50m l碳粉懸液，1h左右霧化完畢。每周一至周五霧化，周六、周天停用，總共持續(xù)6周。

5 標(biāo)本的處理

小鼠于6周霧化結(jié)束后處死，立即分離肺、心、肝、脾臟、小腸等器官，用0.1mol/L PB（pH7.4）配制的4%的甲醛固定，石蠟包埋。

6 肺組織切片的伊紅染色

將石蠟切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，然后用伊紅染液染色5m in，再依次經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。為便于觀察碳粉顆粒的分布，未進(jìn)行蘇木素染色染細(xì)胞核。用光學(xué)顯微圖像采集系統(tǒng)采集圖像。

7 肺組織切片的M asson三聯(lián)染色

將石蠟切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化；入重鉻酸鉀浸泡過(guò)夜，水稍洗后用鐵蘇木素染液染色3min，自來(lái)水洗后經(jīng)鹽酸酒精分化；然后用麗春紅酸性品紅液染色5～10m in，自來(lái)水快速漂洗；再經(jīng)磷鉬酸水溶液處理1～3m in后直接用苯胺藍(lán)染液染色3～6m in；1%冰醋酸分化，最后依次經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。用光學(xué)顯微圖像采集系統(tǒng)采集圖像。Masson三聯(lián)染色檢測(cè)膠原沉積，藍(lán)色為膠原纖維。

8 肺組織切片巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物F4/80和TGF-β1免疫熒光染色

將石蠟切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、蒸餾水洗滌；用EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH8.0）孵育切片進(jìn)行抗原修復(fù)， 經(jīng)0.01mol/L PBS震蕩洗滌3次，每次5m in；加入自發(fā)熒光淬滅劑5m in，流水沖洗10m in；3%BSA孵育30m in；滴加小鼠F4/80單克隆抗體（1:50 稀釋）或小鼠TGF-β1單克隆抗體（1:20 稀釋）， 4°C孵育過(guò)夜； PBS洗滌后滴加Alexa CY3標(biāo)記山羊抗鼠IgG (用于F4/80，1:300稀釋) 或Fluor 488標(biāo)記山羊抗鼠IgG（用于TGF-β1，1:400稀釋），避光室溫孵育50m in； PBS洗滌后滴加4μg/m l DAPI染液，避光室溫孵育10min； 經(jīng)PBS洗滌后用抗熒光淬滅封片劑封片。激光掃描共聚焦顯微成像系統(tǒng)采集圖像。

結(jié) 果

1 碳粉顆粒在呼吸道中的分布

伊紅染色結(jié)果顯示，碳粉顆粒被小鼠吸入后，可在氣管（圖1）、支氣管壁粘附（圖1），有的被巨噬細(xì)胞所吞噬，且每個(gè)巨噬細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)吞噬的多個(gè)碳粉顆粒。到達(dá)肺泡的碳粉顆粒，造成肺泡的炎癥反應(yīng)，肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞增多、肺泡間隔增寬，碳粉顆粒多數(shù)分布于肺泡及肺間質(zhì)中（圖1）。

2 吸入碳粉顆粒誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞的聚集

為明確肺泡巨噬細(xì)胞與吸入碳粉在肺內(nèi)分布的關(guān)系，我們用免疫熒光染色檢測(cè)了小鼠活化巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80在肺內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在碳粉顆粒分布的區(qū)域（圖2），F(xiàn)4/80免疫反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞明顯增多（圖2），但僅有部分碳粉顆粒分布于F4/80染色陽(yáng)性的細(xì)胞中，這些結(jié)果提示，吸入的碳粉顆?？赡苷T導(dǎo)了肺泡巨噬細(xì)胞的聚集。

3 碳粉吸入促進(jìn)肺組織中膠原纖維沉積及TGF-β1免疫反應(yīng)性表達(dá)增強(qiáng)

為明確碳粉吸入對(duì)肺內(nèi)膠原纖維沉積的影響，進(jìn)行了肺組織切片的Masson三聯(lián)染色，結(jié)果顯示碳粉吸入使肺組織的膠原沉積明顯增多（圖3）。

圖1 吸入碳粉顆粒在氣管、支氣管及肺內(nèi)的分布。箭頭示碳粉顆粒所在處；標(biāo)尺，50μmFig. 1 The distribution of inhaled carbon particles in the trachea, bronchia and lung. Arrows indicate carbon particle deposition; scale bar, 50μm

TGF-β1是細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)重建的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子，為進(jìn)一步分析膠原纖維沉積的可能機(jī)制，進(jìn)行了TGF-β1的免疫熒光染色。與對(duì)照組比較，碳粉吸入組TGF-β1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，并且主要位于碳粉分布區(qū)域（圖3）。

4 碳粉顆粒在脾臟的分布

脾臟內(nèi)部可分為紅髓及白髓，碳粉顆粒由呼吸系統(tǒng)進(jìn)入小鼠體內(nèi)后，在脾臟有較多分布。碳粉顆粒有的被巨噬細(xì)胞吞噬，有的直接散布于脾臟組織中。脾臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)未受到明顯影響（圖4）。

5 碳粉顆粒在其他臟器的分布

進(jìn)一步觀察碳粉顆粒在其他臟器的分布顯示，心肌組織、肝組織及小腸上皮組織中均可見(jiàn)少量碳粉顆粒沉積，碳粉顆粒主要位于巨噬細(xì)胞中（圖5）。這些臟器的形態(tài)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變。

討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)霧化碳粉懸液使小鼠吸入細(xì)顆粒物，經(jīng)伊紅染色觀察，碳粉顆粒主要沉積于肺泡及肺間質(zhì)中，在呼吸系統(tǒng)內(nèi)，還可粘附于氣管、支氣管，并有部分進(jìn)入氣道上皮細(xì)胞內(nèi)。全身臟器中，脾臟內(nèi)有較多的碳粉沉積，其他臟器包括心、肝、小腸等僅見(jiàn)少許分布。

PM 2.5的來(lái)源復(fù)雜，主要成分為元素碳、有機(jī)碳、硫酸鹽、硝酸鹽、銨鹽等，其中含碳物質(zhì)所占比例高達(dá)40%以上[3]。近年，研究人員分析我國(guó)部分地區(qū)空氣中PM 2.5的構(gòu)成，其中含碳物質(zhì)的濃度為19～44μg/m3, 以冬季采暖期間最高[4,5]。所以，研究可吸入性含碳顆粒物的危害有重大意義。因此，我們選取碳粉作為可吸入顆粒進(jìn)行了相關(guān)研究。同時(shí)碳粉進(jìn)入機(jī)體后，因其黑色，便于跟蹤觀察，這也是我們選取碳粉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的原因。

以往的研究證實(shí)，直徑小于0.1μm的顆?？梢灾苯舆M(jìn)入非巨噬細(xì)胞內(nèi)[6]。為明確碳粉顆粉吸入后在肺內(nèi)的分布與肺泡巨噬細(xì)胞之間的關(guān)系，我們進(jìn)行了活化的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80的染色[7]。結(jié)果證實(shí)，碳粉顆粒沉積區(qū)域肺泡巨噬細(xì)胞大量聚集，但僅有部分碳粉顆粒分布于F4/80染色陽(yáng)性的細(xì)胞中。究其原因，本研究中使用的碳粉顆粒為24nm，碳粉顆粒除了可以進(jìn)入巨噬細(xì)胞以外，也可以直接進(jìn)入肺內(nèi)其它細(xì)胞中。另一方面，吞噬了碳粉顆粒的巨噬細(xì)胞會(huì)破裂、分解，也直接導(dǎo)致了其標(biāo)志物F4/80的丟失，染色呈陰性。因此，并非所有含碳粉顆粒的細(xì)胞均呈F4/80染色陽(yáng)性。

圖2 碳粉吸入對(duì)小鼠肺組織中肺泡巨噬細(xì)胞分布的影響。 紅色為F4/80免疫熒光染色，藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核；黑色箭頭示碳粉顆粒所在處；白色箭頭分別示代表性的F4/80陽(yáng)性肺泡巨噬細(xì)胞；標(biāo)尺，50μmFig. 2 The ef ect of inhaled PM 2.5 on the distribution of alveolar macrophages in mouse lung tissue. Red, immunofuorescence stained F4/80; blue, DAPI stained cell nuclei; black arrows, carbon particle deposition; white arrows, representative F4/80 positive macrophages; scale bar, 50μm

本實(shí)驗(yàn)中，碳粉被小鼠吸入后停留于肺組織中，引起了炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺泡腔變小、肺間隔增厚和膠原纖維沉積，這些改變會(huì)導(dǎo)致肺泡通氣及氣血交換的下降，因而影響機(jī)體氧氣的交換與吸收。大量研究揭示PM 2.5參與呼吸系疾病如慢性阻塞性肺病[8-10]及哮喘[11-12]的發(fā)生和急性加重，而PM 2.5與肺纖維化的關(guān)系尚不明確。近些年我國(guó)肺纖維化疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，這可能與環(huán)境污染、PM 2.5濃度較高密切相關(guān)[13]，但PM 2.5參與肺纖維化的具體機(jī)制尚不清。肺纖維化多由肺間質(zhì)增生、膠原過(guò)度沉積所致[14]。本實(shí)驗(yàn)研究了碳粉顆粒吸入后小鼠肺間質(zhì)增生和膠原表達(dá)的變化，結(jié)果顯示碳粉顆粒確實(shí)誘導(dǎo)了肺間質(zhì)的增生，膠原表達(dá)增加。TGF-β1是組織增生、促纖維化最重要的生長(zhǎng)因子[15]，碳粉顆粒導(dǎo)致了肺組織中TGF-β1的表達(dá)增強(qiáng)，提示TGF-β1這一經(jīng)典的促纖維化因子可能參與了PM 2.5 介導(dǎo)的肺間質(zhì)增生反應(yīng)。

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。碳粉顆粒經(jīng)呼吸系統(tǒng)進(jìn)入血液后，在脾臟有較多分布，主要原因應(yīng)該是巨噬細(xì)胞吞噬碳粉顆粒后轉(zhuǎn)運(yùn)至脾臟，使碳粉顆粒停留在脾臟內(nèi)。脾臟內(nèi)的部分碳粉顆粒不在巨噬細(xì)胞中，但呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，可能也是吞噬碳粉顆粒的巨噬細(xì)胞已死亡分解而導(dǎo)致的結(jié)果。碳粉顆粒在其他臟器，如心、肝、小腸等都可見(jiàn)分布，但是其量少，且大都分布于巨噬細(xì)胞中，所觀察的切片中，尚未見(jiàn)對(duì)這些臟器形態(tài)結(jié)構(gòu)造成影響。

圖3 碳粉吸入對(duì)小鼠肺組織中膠原纖維沉積及TGF-β1免疫反應(yīng)性表達(dá)的影響。綠色，TGF-β1免疫熒光染色；藍(lán)色，DAPI染色的細(xì)胞核；黃色箭頭，膠原纖維沉積；黑色箭頭，碳粉顆粒所在處；白色箭頭，代表性的TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)；標(biāo)尺，50μmFig. 3 The ef ect of inhaled PM 2.5 on collagenous fber deposition and TGF-β1 expression in mouse lung tissue. Green, immunof uorescence stained TGF-β1; blue, DAPI stained cell nuclei; yellow arrows, collagenous f ber deposition; black arrows, carbon particle deposition; white arrows, representative TGF-β1 positive expression; scale bar, 50μm

圖4 吸入碳粉顆粒在脾臟內(nèi)的分布。箭頭示碳粉顆粒所在處；標(biāo)尺，50μm。Fig. 4 The distribution of inhaled carbon particles in the spleen. Arrows show carbon particle deposition; scale bar, 50μm.

然而，真實(shí)大氣污染的PM 2.5中成份復(fù)雜，碳粉可以吸附很多有害物質(zhì)，如重金屬、微生物及有毒化合物[16]。其中微生物可導(dǎo)致機(jī)體的感染，其他物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體并達(dá)到一定的積累量，也會(huì)對(duì)有關(guān)臟器造成損害[17]。所以，PM 2.5除了其作為細(xì)顆粒物對(duì)機(jī)體的物理?yè)p傷之外，還因其包含的有害成分導(dǎo)致生物性、化學(xué)性等方面的損傷。避免PM 2.5的吸入當(dāng)然是杜絕其危害的最直接的方法，但是治理空氣污染非一日之功，探究PM 2.5在機(jī)體的分布及其危害等有明顯的現(xiàn)實(shí)意義，需要更深入的研究。

圖5 吸入碳粉顆粒在心、肝及小腸的分布。箭頭示碳粉顆粒所在處；標(biāo)尺，50μmFig. 5 The distribution of inhaled carbon particles in the heart, liver and small intestine. Arrows show carbon particle deposition; scale bar, 50μm

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H istochem ical detection for the distribution for inhaled particu late m atter 2.5 in mu ltip le organs and the related tissue damage of m ice

Ma Yebing, Cheng Peipei1, Lv Xin3, Yuan Tingguo3, Xiang Fei2*
(1School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China;2Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology)

ObjectiveTo investigate the distribution of particulate matter 2.5 (PM 2.5) inhaled into the body from air pollutants in China. M ethodsM ice were exposed to the ultrasonic aerosol of carbon particle (diameter 24nm) suspension for an hour, tw ice a day for 6 weeks, and then euthanized. the lung, heart, liver, spleen, and intestine were sampled for histological analysis. The distribution of inhaled particles was detected by HE staining; the deposition of collagenous fber was determ ined by Masson staining; the expression of F4/80 and TGF-β1 protein was detected by immunofuorescent staining of the lung tissue.ResultsThe inhaled carbon particles deposited mainly in lung alveoli and mesenchyme and induced alveolar macrophage accumulation, collagenous fber deposition as well as TGF-β1 up-regulation in the lung. Of the other organs, the spleen was found to contain more carbon particles than the rest, while a small amount of carbon deposition was also observed in the heart, liver and small intestine.ConclusionInhaled PM 2.5 distributes mainly in the lung and leads to thickening of interlobular septa and collagenous fber deposition, then narrow ing of alveolar cavity. The particles can also spread into other organs of the body and may cause systematic damage.

Particulate matter 2.5 (PM 2.5); distribution; respiration

R563

ADOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.03.003

2017-03-21

2017-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目（81300047）

馬葉冰，女（2000年），瑤族，武漢市第十一中學(xué)高中生，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院2016年科技夏令營(yíng)成員

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：2873465774@qq.com

#呂新，武漢市第十一中學(xué)生物學(xué)老師

Δ袁廷國(guó)，武漢市第十一中學(xué)物理學(xué)老師