養(yǎng)殖半滑舌鰨肝胰、中腎、鰓、頭腎、脾和心中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和過氧化物酶的組織化學(xué)定位

王一澤，孫敬鋒*，劉軍鋒，郭永軍，邢克智，呂愛軍，Yeong Yiksung

（1天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2天津市漁生堂生物技術(shù)有限公司，天津 300404）

養(yǎng)殖半滑舌鰨肝胰、中腎、鰓、頭腎、脾和心中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和過氧化物酶的組織化學(xué)定位

王一澤1，孫敬鋒1*，劉軍鋒2，郭永軍1，邢克智1，呂愛軍1，Yeong Yiksung1

（1天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2天津市漁生堂生物技術(shù)有限公司，天津 300404）

目的研究半滑舌鰨肝胰、中腎、鰓、頭腎、脾和心中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）和過氧化物酶（POX）的分布及組織定位。方法取健康半滑舌鰨肝胰、中腎、鰓、頭腎、脾和心組織進(jìn)行固定，冰凍切片后進(jìn)行酶組織化學(xué)染色和光密度定量統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果ACP活性部位為棕色，主要分布于肝胰小葉間膽管和靜脈，中腎腎小體中的腎小球和腎間質(zhì)的腎小管，頭腎和脾中的巨噬細(xì)胞以及心肌層中，在鰓中未見有分布；ALP活性部位被染為藍(lán)紫色，主要分布于肝胰的胰腺腺泡內(nèi)，中腎腎間質(zhì)的腎小管，鰓的鰓絲血管和上皮細(xì)胞，脾靜脈的管壁處和橢圓體，心外膜和肌膜上以及頭腎的血竇腔內(nèi)皮；POX活性部位被染為茶褐色，主要分布于肝胰小靜脈和肝血竇內(nèi)的血細(xì)胞，中腎腎間質(zhì)的血細(xì)胞，鰓的鰓絲血管、鰓小片血竇和上皮細(xì)胞，頭腎、脾內(nèi)的血細(xì)胞以及心的心肌層和血細(xì)胞中。ACP活性由大到小依次為心、肝胰、脾、中腎、頭腎；ALP活性由大到小依次為中腎、鰓、頭腎、脾、心、肝胰；POX活性由大到小依次為脾、頭腎、肝胰、中腎、鰓、心。結(jié)論ACP、ALP和POX在半滑舌鰨6種組織中分布特點(diǎn)不同，其活性大小在不同組織中有顯著差異。

半滑舌鰨；酶組織化學(xué)；酸性磷酸酶；堿性磷酸酶；過氧化物酶

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）是一種廣泛分布于我國(guó)沿海地區(qū)的底棲魚類，尤其在黃海和渤海分布較多[1]。半滑舌鰨出肉率高，營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著半滑舌鰨人工繁殖及養(yǎng)殖技術(shù)的日漸成熟，近年來逐漸成為我國(guó)最具吸引力的海水養(yǎng)殖魚類之一。目前，對(duì)半滑舌鰨的組織形態(tài)學(xué)[2]、攝食習(xí)慣[3]、營(yíng)養(yǎng)飼料[1]和疾病控制[4]等方面已有一些研究。在硬骨魚類中，頭腎、脾是重要的免疫造血器官，肝胰是魚類的主要消化腺，中腎和鰓承擔(dān)泌尿機(jī)能和滲透壓調(diào)節(jié)功能，心是血液循環(huán)的中樞，它們共同維持著魚類機(jī)體正常代謝及生理活動(dòng)。

酸性磷酸酶（acid phosphatase, ACP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、過氧化物酶（peroxidase, POX）是重要的水解酶或氧化酶，在機(jī)體組織器官執(zhí)行正常生理功能過程中發(fā)揮重要作用。在水生動(dòng)物中，目前對(duì)于ACP、ALP和POX的研究多集中于酶的生化性質(zhì)以及消化道的分布定位研究[5-9]，而對(duì)半滑舌鰨各組織器官的酶組織化學(xué)分布研究尚缺乏。本研究對(duì)ACP、ALP和POX在半滑舌鰨頭腎、脾、肝胰、中腎、鰓和心中的分布進(jìn)行組織化學(xué)定位，并進(jìn)行光密度定量分析。旨在為深入研究半滑舌鰨免疫相關(guān)水解酶和氧化酶在不同組織器官中作用機(jī)制提供參考資料。

材料與方法

1 材料

健康的半滑舌鰨購(gòu)自天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，體重100～150g，體長(zhǎng)20～30cm，解剖后分別取其肝胰、中腎、鰓、頭腎、脾、心6種組織，0.85%生理鹽水快速洗凈，切成5mm×3mm小塊。用于ALP和POX染色的組織，分別先經(jīng)4%甲醛鈣和25%戊二醛固定，再利用OCT（Optimal Cutting Temperature Compound）包埋后，進(jìn)行冷凍切片。用于ACP染色的組織直接利用OCT包埋后，進(jìn)行冷凍切片。切片厚度7μm。

2 ACP酶組織化學(xué)

參照賁長(zhǎng)恩和李叔庚[10]報(bào)道的方法進(jìn)行。孵育液配制：10m l醋酸緩沖液（0.05mol/L, pH 5.0）、10mg硝酸鉛、0.8g蔗糖和1m l 3% β-甘油磷酸鈉混勻后過濾待用。冰凍切片入孵育液37℃孵育1h，蒸餾水浸洗，入1%硫化銨液復(fù)染1m in，再次蒸餾水浸洗，最后封片拍照。

3 ALP酶組織化學(xué)

參照呂大成等[11]報(bào)道的方法進(jìn)行。孵育液配制：堿性磷酸酶緩沖液（100mmol/L NaCl, 5mmol/L MgCl2, 100mmol/L Tris-HCl, pH 9.2～9.4）、5%硝基藍(lán)四唑（NBT）和5% 5-嗅-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（BCIP）混勻即可。冰凍切片室溫下孵育20min，蒸餾水浸洗，封片觀察拍照。

4 POX酶組織化學(xué)

參照賁長(zhǎng)恩和李叔庚[10]報(bào)道的方法進(jìn)行。將10mg DAB·4HCl溶于5m l蒸餾水和5m l磷酸緩沖液（0.2mol/L, pH 7.0）中配制成POX預(yù)孵育液，然后在預(yù)孵育液中加入0.1m l H2O2配制成POX孵育液。室溫條件下切片先在POX預(yù)孵育液孵育20min，然后在POX孵育液中孵育30m in，蒸餾水漂洗，亞甲藍(lán)染核5m in，封片鏡檢。

5 酶組織化學(xué)染色光密度定量與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Leica DM 4000B顯微鏡在40倍物鏡視野下進(jìn)行鏡檢拍照。每種組織檢測(cè)5張切片，每張切片取3個(gè)視野拍照用于數(shù)據(jù)分析。用Image J圖像分析軟件對(duì)陽(yáng)性染色部位測(cè)定和計(jì)算平均光密度（mean optical density, MOD）。使用SPSS 16.0軟件對(duì)3種酶在不同組織內(nèi)染色光密度值進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，P＜0.05表示具有顯著性差異。

結(jié) 果

ACP染色結(jié)果顯示ACP陽(yáng)性部位染為棕色，其在半滑舌鰨的肝胰、中腎、頭腎、脾和心中都有分布，而鰓中未見陽(yáng)性分布。ACP活性主要分布在肝胰小葉間膽管和靜脈（圖1A），中腎腎小體中的腎小球和腎間質(zhì)的腎小管（圖1B），頭腎和脾中的巨噬細(xì)胞（圖1C、1D）以及心心肌層中（圖1E）。

ALP染色結(jié)果顯示ALP陽(yáng)性部位染為藍(lán)紫色，其在半滑舌鰨的肝胰、中腎、頭腎、鰓、脾和心中都有分布。ALP活性主要分布在肝胰胰腺的腺泡內(nèi)(圖2A)，中腎腎間質(zhì)的腎小管(圖2B)，鰓的鰓絲血管和上皮細(xì)胞(圖2C)，脾內(nèi)靜脈的管壁和橢圓體內(nèi)(圖2D)，心外膜和肌膜上(圖2E)以及頭腎的血竇腔內(nèi)皮(圖2F)。

圖1 半滑舌鰨肝胰、中腎、頭腎、脾、心ACP酶組織化學(xué)染色。A, ACP在肝胰小葉間膽管（箭頭）和靜脈（箭）中有分布；B, ACP在中腎腎小體中的腎小球（箭頭）和腎間質(zhì)的腎小管（箭）中有分布；C, ACP在頭腎巨噬細(xì)胞（箭）中有分布；D, ACP在脾巨噬細(xì)胞（箭）中有分布；E, ACP在心心肌層中有分布；CM, 心肌層；HM, 被膜；RCo, 腎小體；RI, 腎間質(zhì)；比例尺, 100μmFig. 1 Histochemical staining of ACP in the hepatopancreas, m id-kidney, head kidney, spleen and heart of Cynoglossus semilaevis. A, ACP activity detected in the interlobular bile duct (arrowhead) and vein (arrow) of the hepatopancreas; B, ACP activity detected in the glomerulus in the renal corpuscle (arrowhead) and tubule in the interstitium (arrow) of the mid-kidney; C, ACP activity detected in the macrophages (arrow) of the head kidney; D, ACP activity detected in the macrophages (arrow) of the spleen; E, ACP activity detected in the cardiac muscle of the heart; CM, cardiac muscle; HM, hepatic membrane; RCo, renal corpuscle; RI, renal interstitium; scale bar, 100μm

圖2 半滑舌鰨肝胰、中腎、鰓、脾、心、頭腎ALP酶組織化學(xué)染色。A, 肝胰胰腺腺泡（箭）；B, 中腎腎間質(zhì)的腎小管（箭）；C, 鰓的鰓絲的血管和上皮細(xì)胞；D, 脾靜脈的管壁處和橢圓體；E, 心外膜和心肌層肌膜；F, 頭腎血竇內(nèi)皮（箭）；AD, 外膜；CM, 心肌層；EL, 橢圓體；GF, 鰓絲；GL, 鰓小片；RI, 腎間質(zhì)；SV, 小靜脈；VE, 靜脈；比例尺, 100μmFig. 2 Histochemical staining of ALP in the hepatopancreas, m id-kidney, gill, spleen, heart and head kidney of Cynoglossus semilaevis. A, the pancreatic acinus (arrow) of the hepatopancreas; B, the interstitium tubule (arrow) of the mid-kidney; C, the blood vessel and epithelial cells of gill f laments; D, the venous wall and ellipsoid of the spleen; E, the adventitia and sarolemma of the heart; F, the blood sinus (arrow) of the head kidney; AD, adventitia; CM, cardiac muscle; EL, ellipsoid; GF, gill f lament; GL, gill lamella; RI, renal interstitium; SV, small vein; VE, vein; scale bar, 100μm

POX染色結(jié)果顯示POX陽(yáng)性部位染為茶褐色，其在半滑舌鰨的肝胰、中腎、頭腎、鰓、脾和心中都有分布。POX活性主要分布在肝胰小靜脈和肝血竇內(nèi)的血細(xì)胞（圖3A），中腎腎間質(zhì)的血細(xì)胞（圖3B），鰓的鰓絲血管、血竇和鰓小片上皮細(xì)胞（圖3C、3D），頭腎、脾內(nèi)的血細(xì)胞（圖3E、3F）以及心心肌層和血細(xì)胞中（圖3G）。

圖3 半滑舌鰨肝胰、中腎、鰓、頭腎、心、脾POX酶組織化學(xué)染色。A, 肝胰小靜脈和肝血竇內(nèi)的血細(xì)胞（箭）；B,中腎腎間質(zhì)的血細(xì)胞（箭）；C, 鰓的鰓絲血竇（箭頭）和鰓小片上皮細(xì)胞（箭）；D, 鰓的鰓絲血管的血細(xì)胞；E, POX遍布在整個(gè)頭腎組織的血細(xì)胞中；F, POX遍布在整個(gè)脾組織的血細(xì)胞中；G, 心肌層以及血細(xì)胞；AD, 外膜；BV, 血管；CA, 鰓絲軟骨；CM, 心肌層；GF, 鰓絲；RI, 腎間質(zhì)；RT, 腎小管；SV, 小靜脈；比例尺, 100μmFig. 3 Histochemical staining of POX in the hepatopancreas, m id-kidney, gill, head kidney, heart and spleen of Cynoglossus semilaevis. A, the blood cells in the vein and hepatic sinusoid (arrow) of the hepatopancreas; B, the blood cells in the interstitium (arrow) of the mid-kidney; C, the sinusoid of gill f laments (arrowhead) and epithelial cells of gill lamellae (arrow); D, the blood cells in gill blood vessels; E, the blood cells all over the head kidney; F, the cardiac muscle and blood cells of the heart; G, the blood cells all over the spleen; AD, adventitia; BV, blood vessel; CA, cartilage; CM, cardiac muscle; GF, gill f lament; RI, renal interstitium; RT, renal tubule; SV, small vein; scale bar, 100μm

用Image J圖像分析軟件對(duì)各種酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行光密度定量分析顯示，ACP在心和肝胰中活性最強(qiáng)，其次是脾，在中腎和頭腎中酶活性最弱；ALP在中腎活性最強(qiáng)，其次是鰓，頭腎和脾活性較弱，而心和肝胰酶活力最弱；POX在脾和頭腎中活性最強(qiáng)，其次是肝胰，中腎和鰓中的POX活力較弱，心內(nèi)酶活性最弱（表1）。

討 論

本研究首次對(duì)半滑舌鰨的肝胰、中腎、鰓、頭腎、脾和心中ACP、ALP和POX的分布進(jìn)行了定位分析，并對(duì)酶活性大小進(jìn)行了比較。

ACP是溶酶體的一種標(biāo)志酶，不僅參與吞噬細(xì)胞的胞內(nèi)消化和胞飲作用[5,6]，還參與核酸和蛋白質(zhì)的代謝、免疫調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)等重要生命活動(dòng)[7,12,13]，在疾病的發(fā)生發(fā)展、免疫防御反應(yīng)和細(xì)胞損傷與修復(fù)過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)[10]。組織化學(xué)研究結(jié)果表明，ACP在半滑舌鰨肝胰、心、頭腎、脾、中腎中都有分布，而在鰓中未見陽(yáng)性分布。而在文昌魚（Branchiostoma belcheri tsingtauense）中，則觀察到ACP分布于鰓絲上皮細(xì)胞[14]。對(duì)酶活性強(qiáng)弱進(jìn)行定量分析表明，ACP在肝胰和心中較強(qiáng)。在泥鰍（Misgurnus Anguillicadatus）和卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）中，ACP在肝中活性較強(qiáng)[8,15]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。由于肝胰是魚類的物質(zhì)能量代謝中心，心是整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)的動(dòng)力中心，而ACP廣泛參與代謝調(diào)節(jié)和能量轉(zhuǎn)換等生命活動(dòng)[16]，因此較強(qiáng)的ACP活性可能與相應(yīng)的器官承擔(dān)的主要生理功能有關(guān)。

表1 半滑舌鰨肝胰、中腎、鰓、頭腎、心、脾中ACP、ALP和POX活性定量分析Tab. 1 Quantitative analysis of the activity of ACP, ALP and POX in the hepatopancreas, m id-kidney, gill, head kidney, heart and sp leen of Cynoglossus sem ilaevis.

ALP主要參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和離子分泌等生命活動(dòng)過程[8,16,17]，與免疫防御和消化吸收功能密切相關(guān)[5,18]。我們觀察到，在半滑舌鰨肝胰、中腎、鰓、頭腎、脾和心組織中均有ALP陽(yáng)性分布，其活性在中腎中最強(qiáng)，其次是鰓、脾、頭腎、肝胰和心，且在腎小管的刷狀緣和鰓絲上皮細(xì)胞及血管內(nèi)分布更加密集。這是因?yàn)楹Ｋ~主要依靠腎小管和鰓絲上皮細(xì)胞承擔(dān)分泌離子和排泄的功能[19]，ALP在這些生理活動(dòng)中有著更為重要的作用。

POX在動(dòng)物、植物、微生物中廣泛存在，主要催化過氧化氫和有機(jī)過氧化物對(duì)各種有機(jī)物和無機(jī)物的氧化作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到，POX普遍分布于各個(gè)組織的血細(xì)胞中，以及鰓小片上皮細(xì)胞和心肌層中，其活性在頭腎和脾中最強(qiáng)，其次是鰓、中腎和肝胰，而心中較弱。血細(xì)胞是魚類機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，其中的白細(xì)胞直接參與了免疫應(yīng)答或者相關(guān)免疫防御過程，同時(shí)承擔(dān)著魚類機(jī)體非特異性和特異性免疫的主要機(jī)能。血細(xì)胞在魚類的抗感染免疫過程中會(huì)產(chǎn)生大量的H2O2等具有強(qiáng)氧化性的活性氧中間體來殺傷病原體。所以POX在血細(xì)胞中廣泛存在，可以利用其催化作用，發(fā)揮H2O2和有機(jī)過氧化物的殺傷病原微生物的作用，同時(shí)降低細(xì)胞內(nèi)H2O2和有機(jī)過氧化物的水平，起到保護(hù)宿主細(xì)胞的作用。頭腎、脾作為魚類重要的免疫器官，是魚類抗感染免疫過程中適應(yīng)性免疫應(yīng)答發(fā)生發(fā)展的重要場(chǎng)所。魚類的鰓直接接觸養(yǎng)殖水體中大量的致病性或非致病性微生物。所以POX在頭腎、脾、鰓中活性較強(qiáng)，有利于發(fā)揮其催化H2O2和有機(jī)過氧化物氧化反應(yīng)的作用，最后產(chǎn)生殺傷病原微生物的生物學(xué)效應(yīng)。

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Histochem ical localization of acid phosphatase, alkaline phosphatase and peroxidase in the hepatopancreas, m id-kidney, gill, head kidney, sp leen and heart of cu ltured Cynoglossus sem ilaevis Günther

Wang Yize1, Sun Jingfeng1*, Liu Junfeng2, Guo Yongjun1, Xing Kezhi1, Lv Aijun1, Yeong Yiksung1
(1Tianjin Key Lab of Aqua-Ecology and Aquaculture, Fisheries College, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China;2Tianjin Yushengtang Biotechnology Co.,Ltd., Tianjin 300404, China)

ObjeciveTo investigate the distribution and histochem ical localization of acid phosphatase (ACP), alkaline phosphatase (ALP) and peroxidase (POD) in the hepatopancreas, mid-kidney, gill, head kidney, spleen and heart of Cynoglossus semilaevis Günther.M ethodsTissue samples were taken from the hepatopancreas, m id-kidney, gill, head kidney, spleen and heart of healthy Cynoglossus semilaevis Günther, fxed and then frozen sectioned. Enzyme histochem ical staining was performed on the sections, and the mean optical density (MOD) was measured for quantitative analysis.ResultsACP stain was brown, mainly located in the interlobular bile duct and vein of hepatopancreas, glomerulus in renal corpuscle and tubule in interstitium of the mid-kidney, macrophages in head kidney, spleen and myocardium, while absent in the gill. The blue-purple-stained ALP was detected in the pancreatic acinus of hepatopancreas, tubule in the interstitium of mid-kidney, blood vessel and epithelial cells of gill f laments, venous wall and the ellipsoid of spleen, the adventitia and sarolemma of heart, and the blood sinus of head kidney. The dark-brown-stained POX was localized in the blood cells in the vein and hepatic sinusoid of hepatopancreas and those in the interstitium of m id-kidney, blood vessel of gill f laments, sinusoid and epithelial cells of gill lamellae, blood cells of head kidney, spleen and heart, and myocardium. ACP activity was in descending order in the heart, hepatopancreas, spleen, m id-kidney and head kidney; ALP activity was in descending order in the m id-kidney, gill, head kidney, spleen, heart and hepatopancreas; POX activity was in descending order in the spleen, head kidney,hepatopancreas, m id-kidney, gill and heart.ConclusionThe distribution of ACP, ALP, and POX vary in the six types of tissues investigated, and there are signif cant dif erences in their expressions and activities.

Cynoglossus semilaevis Günther; enzyme histochem istry; acid phosphatase; alkaline phosphatase; peroxidase

Q174

ADOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.03.005

2016-12-17

2017-05-02

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(15JCZDJC34000，16JCZDJC33500)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272692）

王一澤，男（1993年），漢族，碩士研究生

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：sun_jf@163.com