白腐真菌預處理對柳枝稷降解的影響

李 敏， 林炎麗， 楊富裕,2*

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院， 北京100193； 2. 國家能源非糧生物質(zhì)原料研發(fā)中心， 北京100193； 3. 北京助爾生物科學研究院， 北京100085)

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)原產(chǎn)于北美地區(qū)，是禾本科黍?qū)僦参?，也是C4植物，對水分的利用率特別高，可用于放牧、造紙、水土保持以及生態(tài)建設(shè)等[1-3]。美國首先把柳枝稷作為一種模式能源作物進行系統(tǒng)的研究，此后在國際上掀起了對柳枝稷的研究熱潮。有研究表明，用柳枝稷生產(chǎn)出來的乙醇產(chǎn)生的能量，是柳枝稷在生產(chǎn)、收割和運輸植物以及將其轉(zhuǎn)化為乙醇等相關(guān)過程所消耗能量的5倍[4]。柳枝稷作為一種重要的能源草，歐美各國很多年前就將其作為能源植物進行研究，并大規(guī)模低成本地利用柳枝稷生產(chǎn)清潔能源[5]。近年來，我國對生物質(zhì)能源的發(fā)展也日益重視，利用木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇已經(jīng)成為全球的研究熱點[6-7]。而利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇，必須要解決的問題就是對原料進行預處理，通過改變木質(zhì)纖維素原料的結(jié)構(gòu)，將木質(zhì)素減少，破壞木質(zhì)素和半纖維素對纖維素的包圍，暴露更多的纖維素并使其更易轉(zhuǎn)化為可利用的糖[8]。有研究表明，木質(zhì)素的降解程度與葡萄糖和乙醇的生產(chǎn)率均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.9328和0.9270，即木質(zhì)素的降解率越高，后期糖化及發(fā)酵得到的葡萄糖和乙醇就越多[9]。目前預處理方法很多(如物理法、化學法及物化結(jié)合法等)，但大多存在成本高，效率低和污染嚴重等問題。生物處理法因能耗低、成本低、無污染等優(yōu)勢成為目前研究的熱點[10-11]。

本試驗選取目前研究較多且對秸稈降解效果較好的3種白腐真菌即：黃孢原毛平革菌[12](Phanerochaetechrysosporium)、乳白耙菌[9](Irpexlacteus)、蟲擬蠟菌[13-14](Ceriporiopsissubvermispora)及其混合真菌對柳枝稷(PanicumvirgatumL.)進行預處理，研究白腐真菌種類、預處理時間、溫度、含水量和菌液量這些因素對柳枝稷木質(zhì)素降解的影響，為白腐真菌對柳枝稷的生物預處理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)購買自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，乳白耙菌(Irpexlacteus) 購買自中國普通微生物菌種保藏中心，蟲擬蠟菌(Ceriporiopsissubvermispora)購買自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，將這3株白腐真菌保存于土豆培養(yǎng)基并放入4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

柳枝稷來源于北京涿州，自然曬干，粉碎過40目篩，放于自封袋保存，使用之前65°C烘干。原料柳枝稷的纖維素、半纖維素、酸性洗滌木質(zhì)素的含量分別是36.22%, 33.74%, 8.08%。

綜合PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO43 g，維生素B1微量，自然pH。滅菌鍋121°C滅菌15 min。

1.2 試驗方法

1.2.1菌液制備 選取單一菌種菌絲長勢旺盛的平板，取菌苔前端接種到液體培養(yǎng)基中，并在28°C恒溫搖床(180 r·min-1)培養(yǎng)4 d，長出白色可見的菌絲球，即可作為菌液使用?；旌险婢木杭礊椴煌N的單一菌液同比例混合。

1.2.2白腐真菌拮抗試驗 將活化后的白腐真菌兩兩對點接種到同一PDA 培養(yǎng)基平板上，接種點之間的距離約為3 cm，28°C恒溫培養(yǎng)6天，每組兩個重復，觀察菌落的生長狀況及菌絲相容情況。

1.2.3白腐真菌種類及時間對柳枝稷降解的研究 本實驗總共分為7組，H表示黃孢原毛平革菌處理組；R表示乳白耙菌處理組；C表示蟲擬蠟菌處理組；HR表示黃孢原毛平革菌與乳白耙菌的混合處理組；HC表示黃孢原毛平革菌與蟲擬蠟菌的混合處理組；RC表示乳白耙菌與蟲擬蠟菌的混合處理組；HRC表示3種白腐真菌的混合處理組。具體試驗方案如下：

稱取2 g烘干的柳枝稷至100 mL三角瓶中，加入5 mL蒸餾水，8層紗布封口，121°C高壓滅菌15 min。冷卻至室溫后，在超凈臺工作，分別吸取7個組2 mL菌液至裝有柳枝稷的三角瓶中，總共分為6批，攪拌均勻后封口放入恒溫培養(yǎng)箱28°C下培養(yǎng)。分別在第5, 10, 15, 20, 25, 30 d取一批樣品，過濾取樣，測定中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)、酸性洗滌木質(zhì)素(acid detergent lignin, ADL)含量。所有樣品重復3次，取檢測值平均值。

中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素含量的測定采用濾袋技術(shù)和范氏纖維測定法[15]。

纖維素降解率、半纖維素降解率、木質(zhì)素降解率計算公式如下：

1.2.4溫度、水分、菌液量對乳白耙菌降解柳枝稷的研究 采用正交試驗設(shè)計法，考察溫度、水分、菌液量3因子對乳白耙菌生物預處理柳枝稷的影響。稱取2 g烘干的柳枝稷至100 mL三角瓶中，加入的蒸餾水設(shè)置3個濃度梯度分別為3 mL, 5 mL, 7 mL，8層紗布封口，121°C高壓滅菌15 min。冷卻至室溫后，加入乳白耙菌菌液，且設(shè)置3個濃度梯度分別為1 mL, 2 mL, 3 mL，分別放在 20°C, 28°C, 37°C3個恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d，每個恒溫箱有9個組，每組樣品有3個重復，本次試驗總共有81個三角瓶樣品。在第20 d時過濾取樣，測定NDF、ADF和ADL含量。所有樣品重復3次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件進行簡單的數(shù)據(jù)處理和圖表制作，并用SPSS 18.0中的ANOVA程序?qū)嶒灲Y(jié)果進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白腐真菌拮抗試驗結(jié)果

每組兩個重復，黃孢原毛平革菌(H)、乳白耙菌(R)和蟲擬蠟菌(C)3個菌種在恒溫箱培養(yǎng)至第6天的生長拮抗關(guān)系如圖1所示：在第6天，黃孢原毛平革菌的粉孢子、乳白耙菌的菌絲生長迅速且濃密，蟲擬蠟菌的菌絲生長緩慢，只在一小片區(qū)域生長，與其他兩個菌種沒有競爭優(yōu)勢，但3種白腐真菌兩兩之間均無拮抗反應(yīng)，沒有產(chǎn)生相互抑制的現(xiàn)象。結(jié)果表明，黃孢原毛平革菌、乳白耙菌和蟲擬蠟菌兩兩之間可以共同培養(yǎng)，混合生長。

圖1 白腐真菌的拮抗試驗Fig.1 Antagonism test of three white rot fungi

2.2 白腐真菌種類及時間對柳枝稷降解的影響

在白腐真菌30 d的降解中，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的相對含量發(fā)生了變化，從圖2可以看出，半纖維素降解率整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，除了黃孢原毛平革菌處理組(H)在第10天降解率達到最高值為10.8%，其他處理組都在預處理第15天達到最高降解率。在第15天，乳白耙菌處理組(R)、蟲擬蠟菌處理組(C)、乳白耙菌與蟲擬蠟菌的混合處理組(RC)、黃孢原毛平革菌與乳白耙菌混合處理組(HR)、3種白腐真菌的混合處理組(HRC)、黃孢原毛平革菌與蟲擬蠟菌處理組(HC)的半纖維素降解率分別為18.09%, 15.04%, 14.30%, 13.76%, 12.44%, 12.08%。

圖2 半纖維素降解率的變化Fig.2 The change of hemicellulose degradation rate

從圖3可以看到，纖維素降解率變化上下浮動不大，變化都在±8%以內(nèi)。從第20天開始，乳白耙菌處理組(R)和黃孢原毛平革菌處理組(H)的纖維素降解率一直都比其他處理組低。乳白耙菌與蟲擬蠟菌的混合處理組(RC)的纖維素降解率在第30天時達到最高為5.81%，另外黃孢原毛平革菌與蟲擬蠟菌的混合處理組(HC)、黃孢原毛平革菌與乳白耙菌的混合處理組(HR)、蟲擬蠟菌處理組(C)、3種白腐真菌的混合處理組(HRC)在第30天的降解率分別為5.67%, 5.43%, 4.92%, 4.44%。

圖3 纖維素降解率的變化Fig.3 The change of cellulose degradation rate

從圖4中可以看到，乳白耙菌處理組(R)的木質(zhì)素降解率變化比較明顯，且在第20天時達到最高值為36.63%，黃孢原毛平革菌與乳白耙菌混合處理組(HR)木質(zhì)素降解率也在第20天時達到最高值為20.17%。黃孢原毛平革菌處理組(H)、黃孢原毛平革菌與蟲擬蠟菌的混合處理組(HC)、3種白腐真菌的混合處理組(HRC)在第10天的木質(zhì)素降解率最高分別為31.98%, 25.99%, 15.17%, 11.52%。蟲擬蠟菌處理組(C)在第5天的降解率最高為6.98%。乳白耙菌與蟲擬蠟菌的混合處理組(RC)在第15天的木質(zhì)素降解率最高為9.72%?？傮w來說，混合真菌處理組以及蟲擬蠟菌處理組(C)的木質(zhì)素降解率一直都不高，且在第30天時，木質(zhì)素降解率變成負值。

圖4 木質(zhì)素降解率的變化Fig.4 The change of lignin degradation rate

2.3 溫度、水分、菌液量對乳白耙菌降解柳枝稷的影響

從表5可知，當溫度是28°C時，水分設(shè)置3個梯度為3 mL, 5 mL, 7 mL，乳白耙菌菌液量設(shè)置3個梯度1 mL, 2 mL, 3 mL，乳白耙菌對柳枝稷降解20 d的情況如表5：乳白耙菌對柳枝稷半纖維素、纖維素、木質(zhì)素的降解會受水分、菌液量的影響。第6, 7, 8, 9這4個組的半纖維素、木質(zhì)素、纖維素含量差異均不顯著，而且他們的木質(zhì)素含量比其他組低。第6組水分為5 mL，菌液量為3 mL時，木質(zhì)素含量最少，其降解率高達63.45%，與空白組(第0組)相比差異顯著(P<0.05)，半纖維素降解率為24.82%，纖維素含量和空白組差異不顯著。另外，第7, 8, 9這3個組的木質(zhì)素降解率分別為55.58%, 56.73%, 48.86%。

表5 溫度對柳枝稷降解效果的影響Table 5 Influence of temperature on the degradation effect of the switchgrass

注：同列標有不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note: Different letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level, the same as below

從表6可知，當水分為5 mL、菌液量為3 mL以及水分為7 mL、菌液量為2 mL時，乳白耙菌分別在溫度為20°C, 28°C, 37°C對柳枝稷降解的情況如表6所示：在同一溫度下，無論水分為5 mL、菌液量為3 mL還是水分為7 mL、菌液量為2 mL時，其半纖維素、木質(zhì)素含量差異不顯著，纖維素含量在20°C、28°C條件下差異也不顯著；當水分、菌液量組合固定時，在20°C, 28°C, 37°C這3個溫度環(huán)境條件下，纖維素含量差異不顯著，但半纖維素、木質(zhì)素含量都是在28°C溫度條件下較低，且與其他溫度條件(20°C, 37°C)相比差異顯著(P<0.05)。

表6 水分、菌液量對柳枝稷降解效果的影響Table 6 Influence of water and inoculum on the degradation effect of the switchgrass

3 討論

3.1 白腐真菌種類及時間對柳枝稷降解的分析

柳枝稷是一種重要的木質(zhì)纖維作物，但其高木質(zhì)素含量嚴重制約其作為能源植物的開發(fā)和利用[16]。在本試驗，白腐真菌生物預處理柳枝稷30 d的過程中，木質(zhì)素降解程度比較大，而半纖維素含量變化相對較小，纖維素含量變化不大，表明這3種白腐真菌在生物預處理過程中可以選擇性地降解柳枝稷纖維組分中的木質(zhì)素和半纖維素，保留及暴露更多的纖維素。這與前人研究相似，宋麗麗[9]研究了乳白粑菌玉米秸稈的預處理對纖維組分的影響，發(fā)現(xiàn)乳白耙菌可以選擇性降解玉米秸稈中的半纖維素和木質(zhì)素，在生物預處理的第28天，半纖維素和木質(zhì)素分別降解了28.24%和25.46%，纖維素得到了較大程度的保留。在3種單一白腐真菌處理中，乳白耙菌(R)在第20天的木質(zhì)素降解率最高為36.63%，且半纖維素降解率為17.29%，此時，纖維素降解率為負值，這可能是因為乳白耙菌對柳枝稷生物預處理前期以半纖維素、木質(zhì)素為底物，因而半纖維素、木質(zhì)素的含量降低了，而纖維素的含量沒變化，所以纖維素的相對含量增加，從而使纖維素降解率為負值。研究表明，白腐真菌對秸稈等木質(zhì)纖維素的去木質(zhì)化作用是增強酶解的主要原因[17]。而本試驗中黃孢原毛平革菌處理組(H)第10天的木質(zhì)素降解率最高為31.98%，蟲擬蠟菌處理組(C)第5天木質(zhì)素降解率最高為6.98%，都低于乳白耙菌對木質(zhì)素的降解率，因此，乳白耙菌對柳枝稷的生物預處理效果最好。

白腐真菌混合處理組對柳枝稷木質(zhì)素的最高降解率低于乳白耙菌處理組(R)和黃孢原毛平革菌處理組(H)，但高于蟲擬蠟菌處理組(C)?；旌咸幚斫M對木質(zhì)素降解率較低，對纖維素的降解率反而稍微高些，如乳白耙菌與蟲擬蠟菌的混合處理組(RC)在第15天的木質(zhì)素降解率最高為9.72%，其纖維素降解率達到5.81%，且在生物預處理后期，白腐真菌混合處理組(如HC, RC, HRC)的木質(zhì)素降解率反而成為負值，即后期木質(zhì)素含量反而有所增加。這與前人研究相似，Liu等[18]研究密孔菌(Pycnoporussp.)處理柳枝稷時，發(fā)現(xiàn)隨著預處理時間延長，酸性洗滌木質(zhì)素的含量呈先降低后增加的趨勢，72 d后酸性洗滌木質(zhì)素的含量反而超過了對照組。原因可能是在生物預處理過程中，其他成分減少，如纖維素被降解生成糖供白腐真菌自身生長利用，或者是底物濃度降低，而導致木質(zhì)素相對含量增加，從而導致木質(zhì)素降解率變?yōu)樨撝怠?/p>

3.2 溫度、水分、菌液量對乳白耙菌降解柳枝稷的分析

在微生物降解秸稈過程中，菌種的接種量以及培養(yǎng)物的氣體交換是影響白腐真菌降解秸稈的重要因素[19]，培養(yǎng)物中的氣體交換量是由秸稈與水分的相對含量之比決定。菌種接種量過大，菌體會因生長過快而對有限營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生競爭活動和過多代謝產(chǎn)物，從而影響酶的產(chǎn)生；菌種接種量過小，分泌的酶量較少，導致底物過剩，從而影響預處理的效果[20-21]。水分含量過高嚴重降低了乳白耙菌對氧氣的吸收和對二氧化碳的排出；水分含量過低時，乳白耙菌的菌絲不能很好的延長以及自身生長受到限制[22]。本試驗中，在28°C下，柳枝稷被乳白耙菌降解20 d后，第6, 7, 8, 9這四組的木質(zhì)素降解率較高，分別為：63.45%, 55.58%, 56.73%, 48.86%。但第6組即當水分為5 mL，菌液量為3 mL時，木質(zhì)素含量最少，其降解率為63.45%，半纖維素降解率為24.82%，而且纖維素含量和空白組差異不顯著。

發(fā)酵過程中的溫度、時間、水分、pH及其交互作用等因素均會對發(fā)酵產(chǎn)生影響，對固態(tài)發(fā)酵而言，溫度是首要因素[23]。合適的溫度對于微生物預處理至關(guān)重要，王蕾等[24]研究溫度(在37℃～ 45°C范圍內(nèi))對多孔菌(Polyporusvarius)預處理蘆葦?shù)挠绊?，結(jié)果表明，隨著預處理溫度的升高，木質(zhì)素的降解率先升高后下降，最適預處理溫度為41°C。本試驗中無論水分為5 mL、菌液量為3 mL還是水分為7 mL、菌液量為2 mL，都是在28°C溫度下，柳枝稷的木質(zhì)素降解率最高，且與其他溫度(20°C, 37°C)相比差異顯著(P<0.05)。

因此，乳白耙菌對柳枝稷(2 g)進行生物預處理20 d的最適條件為：水分5 mL、菌液量為3 mL、溫度為28°C，此時木質(zhì)素降解率為63.45%，半纖維素降解率為24.82%，而且纖維素含量與空白組差異不顯著，與優(yōu)化前相比，效率提高。

4 結(jié)論

黃孢原毛平革菌、乳白耙菌、蟲擬蠟菌相互之間沒有拮抗反應(yīng)，可以混合培養(yǎng)，為后續(xù)試驗的混合培養(yǎng)提供了基礎(chǔ)。在30 d的預處理過程中，混合真菌對柳枝稷的生物預處理與單一白腐真菌相比，并沒有優(yōu)勢，預處理效果并不好。在單一白腐真菌中，乳白耙菌對柳枝稷的木質(zhì)素降解率最高，預處理效果最好，其最佳預處理時間為20 d。