滇池高背鯽人工繁殖與胚胎發(fā)育觀察研究

陳俊+郗啟文+華澤祥

摘要 對(duì)體重200～300 g的三倍體全雌性滇池高背鯽進(jìn)行人工催產(chǎn)試驗(yàn)，雄魚(yú)選擇體重180 g左右的云南光唇魚(yú)和100 g左右的短須裂腹魚(yú)，利用雄魚(yú)精液刺激滇池高背鯽卵子，觀察受精卵雌核發(fā)育情況。結(jié)果表明，雌魚(yú)注射500 IU/kg魚(yú)體重的HCG（水溫14 ℃左右），15～18 h后可進(jìn)行人工催產(chǎn)，平均催產(chǎn)率93%。受精卵胚體呈青綠色，比重大于水，黏性強(qiáng)，平均卵徑1.8 mm；受精卵經(jīng)歷胚盤隆起期、細(xì)胞分裂期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、胚孔封閉期、肌節(jié)出現(xiàn)期、眼囊期、尾牙期、尾泡期等16個(gè)階段、23個(gè)時(shí)序。水溫12.5～14.2 ℃條件下歷時(shí)10 493 min出膜，初孵仔魚(yú)全長(zhǎng)6.1 mm。滇池高背鯽受精率81%，孵化率77%。

關(guān)鍵詞 滇池高背鯽；三倍全雌體；人工繁殖；胚胎發(fā)育

中圖分類號(hào) S965.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）12-0259-02

滇池高背鯽（Carassius sp.）是云南特有三倍體全雌性鯽魚(yú)，染色體數(shù)為162條，形態(tài)上體高、背寬、頭較尖，呈銀灰色。20世紀(jì)70年代中期在滇池形成產(chǎn)量，捕撈量占滇池捕撈量的50%左右，常見(jiàn)體重0.5～1.0 kg，因其生長(zhǎng)速度快，加之孤雌生殖，能大量補(bǔ)充群體數(shù)量，保證了資源的穩(wěn)定[1-4]。20世紀(jì)80—90年代，隨著捕撈強(qiáng)度的加大和外來(lái)物種的引進(jìn)，以及人類活動(dòng)的加劇和滇池等湖庫(kù)水體污染，滇池高背鯽魚(yú)產(chǎn)卵場(chǎng)所遭到破壞，群體逐漸縮小，產(chǎn)量逐年下降。為保護(hù)滇池高背鯽種質(zhì)資源，恢復(fù)其自然種群，云南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站基地——云南高背鯽原種場(chǎng)從2000年開(kāi)始，致力于滇池高背鯽的馴養(yǎng)繁育和種質(zhì)選育與保種工作。2011年，滇池高背鯽被評(píng)為云南“六大名魚(yú)”之一，在全省重點(diǎn)推廣。

本試驗(yàn)采用云南光唇魚(yú)和短須裂腹魚(yú)的雄魚(yú)精液刺激滇池高背鯽卵子，以獲得受精卵，其目的在于進(jìn)一步探索滇池高背鯽雌核發(fā)育雄魚(yú)來(lái)源的可獲得性，通過(guò)對(duì)胚胎發(fā)育的觀察，為其人工繁殖、種質(zhì)資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，為滇池高背鯽增養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)參考。

1 材料與方法

1.1 親魚(yú)來(lái)源

試驗(yàn)用魚(yú)來(lái)自于云南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站基地，為云南高背鯽原種場(chǎng)保種的親本。

1.2 親魚(yú)培育

2016年12月，從云南高背鯽原種場(chǎng)3#保種池塘（面積0.8hm2）挑選體重200～300 g、腹部較膨大的滇池高背鯽，置于7-1#（面積300 m2）流水池單獨(dú)培育，投喂粗蛋白含量33%的鯉魚(yú)魚(yú)苗料，加強(qiáng)日常管理和定期流水刺激。

1.3 親魚(yú)選擇

選擇腹部膨大柔軟的滇池高背鯽作為母本。雄魚(yú)從原種場(chǎng)人工養(yǎng)殖的云南光唇魚(yú)和短須裂腹魚(yú)中挑選，體重100～180 g/尾，可以人工擠出精液。

1.4 人工催產(chǎn)與授精

2017年3月7日和10日進(jìn)行2次人工催產(chǎn)，雌魚(yú)采用500 IU/kg魚(yú)體重的HCG一次性注射，雄魚(yú)不注射。平均水溫14 ℃，15～18 h后進(jìn)行人工授精。受精卵置于塑料大棚中孵化，用于胚胎發(fā)育觀察的受精卵置于載玻片上。

1.5 胚胎觀察

每次取受精卵20～30枚，采用Olympus SZ61體視解剖鏡和上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司生產(chǎn)的LW100T生物顯微鏡進(jìn)行觀察，胚胎發(fā)育圖片采集使用Nikon D50相機(jī)，圖片制作排版使用Photoshop cs6；胚胎發(fā)育按50%受精卵發(fā)育至同一時(shí)期開(kāi)始計(jì)時(shí)。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工催產(chǎn)情況

3月7日催產(chǎn)滇池高背鯽20尾，雄魚(yú)選擇短須裂腹魚(yú)；3月10日催產(chǎn)10尾，雄魚(yú)選擇短須裂腹魚(yú)。雌雄比均為1：1，共獲得受精卵約14.3萬(wàn)枚。催產(chǎn)率93%，受精率（以發(fā)育至原腸中期計(jì)）均達(dá)81%以上，孵化率77%以上，人工繁殖情況詳見(jiàn)表1。

2.2 胚胎發(fā)育情況

滇池高背鯽受精卵胚胎發(fā)育過(guò)程可分為胚盤隆起期、細(xì)胞分裂期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、胚孔封閉期、肌節(jié)出現(xiàn)期、眼囊期、尾芽期、尾泡期等16個(gè)階段，包括23個(gè)時(shí)序。各階段發(fā)育時(shí)序見(jiàn)表2，各階段發(fā)育圖譜見(jiàn)圖1。

2.2.1 胚盤隆起。滇池高背鯽成熟受精卵為圓形沉性卵，胚體呈青綠色，卵子直徑1.5 mm，遇水后具有強(qiáng)黏性。受精10 min吸水膨脹至最大，卵徑平均1.8 mm，見(jiàn)圖1（1）。受精27 min后胚盤形成，見(jiàn)圖1（2）。

2.2.2 細(xì)胞分裂期。受精48 min，胚盤上開(kāi)始形成一卵裂溝，細(xì)胞開(kāi)始分裂，進(jìn)入二細(xì)胞期，見(jiàn)圖1（3）；71 min進(jìn)入四細(xì)胞期，見(jiàn)圖1（4）。隨著細(xì)胞團(tuán)不斷分裂，細(xì)胞體積逐漸變小，細(xì)胞數(shù)目不斷增多，約243 min進(jìn)入多細(xì)胞期，見(jiàn)圖1（5）。

2.2.3 囊胚期。隨著細(xì)胞分裂和細(xì)胞團(tuán)的隆起，囊胚層在卵黃上形成1個(gè)半球狀隆起，815 min到達(dá)囊胚早期，見(jiàn)圖1（6）。之后細(xì)胞下移，囊胚層高度逐漸降低，進(jìn)入囊胚中期，見(jiàn)圖1（7），時(shí)間為1 100 min。受精1 358 min，囊胚細(xì)胞向邊緣擴(kuò)展、下包，囊胚層變?yōu)楸馄綘?，進(jìn)入囊胚晚期，見(jiàn)圖1（8）。

2.2.4 原腸期。受精1 630 min，囊胚層下包至卵黃囊1/2位置，胚環(huán)出現(xiàn)，進(jìn)入原腸早期見(jiàn)圖1（9），受精1 911 min，囊胚層下包卵黃囊2/3，在囊胚邊沿的上沿一環(huán)形區(qū)域內(nèi)細(xì)胞分裂加速，形成一增厚層，即胚環(huán)，而胚環(huán)上突出、加厚的部分為胚盾，進(jìn)入原腸中期，見(jiàn)圖1（10）。受精2 220 min，胚環(huán)下包至卵黃囊3/4位置，進(jìn)入原腸晚期，見(jiàn)圖1（11）。

2.2.5 神經(jīng)胚期。受精2 428 min，胚盤幾乎包裹整個(gè)卵黃囊，未包入部分的卵黃為卵黃栓，進(jìn)入神經(jīng)胚期，見(jiàn)圖1（12）。

2.2.6 胚孔封閉期。受精2 452 min，卵黃栓消失，胚盤完全包住卵黃，進(jìn)入胚孔封閉期，見(jiàn)圖1（13）。

2.2.7 肌節(jié)出現(xiàn)期。3 371 min，胚體可見(jiàn)2～3對(duì)肌節(jié)，進(jìn)入肌節(jié)出現(xiàn)期，見(jiàn)圖1（14）。

2.2.8 眼囊期。3 969 min，眼基呈橢圓形，肌節(jié)9對(duì)，進(jìn)入眼囊期，見(jiàn)圖1（15）。

2.2.9 尾芽期。4 595 min，尾芽前端開(kāi)始從卵黃囊上分離，稱為尾芽期，見(jiàn)圖1（16）。

2.2.10 尾泡期。受精4 695 min，尾部出現(xiàn)一空泡，卵黃囊略成梨型，胚體尾部呈梨型，為尾泡期，見(jiàn)圖1（17）。

2.2.11 眼晶體形成期。4 983 min，卵黃囊開(kāi)始收縮，呈倒梨型，為眼晶體形成期，見(jiàn)圖1（18）。

2.2.12 肌肉效應(yīng)期。5 185 min，胚體微弱扭動(dòng)，進(jìn)入肌肉效應(yīng)期，見(jiàn)圖1（19）。

2.2.13 心臟搏動(dòng)期。受精6 016 min，胚體頭部下方、卵黃囊前端出現(xiàn)一搏動(dòng)小管，心率29～31次/min，進(jìn)入心臟搏動(dòng)期，見(jiàn)圖1（20）。眼部黑色素開(kāi)始形成。

2.2.14 胸鰭原基期。6 562 min，眼部黑色素進(jìn)一步沉著，目視下可見(jiàn)1對(duì)黑色眼點(diǎn)，此時(shí)胸鰭原基出現(xiàn)、心臟增大，進(jìn)入胸鰭原基期，見(jiàn)圖1（21）。

2.2.15 眼黑期。7 500 min，胚體各部開(kāi)始出現(xiàn)黑色素，尾部進(jìn)一步從卵黃囊上分離，且可自由伸達(dá)至頭部，裸視情況下眼睛明顯，心臟處可見(jiàn)血液流動(dòng)，略呈淡紅色，心率40～42次/min，進(jìn)入眼黑期，見(jiàn)圖1（22）。

2.2.16 出膜期。胚體尾部不斷扭動(dòng)并與頭部同時(shí)用力，尾部先于頭部伸出卵膜，隨后在胚體扭動(dòng)下出膜，進(jìn)入出膜期初孵仔魚(yú)，見(jiàn)圖1（23），心率42～46次/min，時(shí)間為10 493 min。初孵仔魚(yú)平均全長(zhǎng)6.1 mm，體黑色素明顯，尤以背部和尾部較多，初孵仔魚(yú)沉入池底，靜待器官的進(jìn)一步發(fā)育。

3 結(jié)論與討論

3.1 滇池高背鯽雌核發(fā)育特點(diǎn)

滇池高背鯽屬自然形成的一個(gè)特殊三倍體鯽魚(yú)種群，為滇池水系特有種。其在自然條件下依靠麥穗魚(yú)、鯉魚(yú)等魚(yú)類的雄魚(yú)精子刺激卵子發(fā)育，精子的細(xì)胞核并未參與卵球的發(fā)育，胚胎的發(fā)育僅在母體遺傳的控制下進(jìn)行[5]。本試驗(yàn)采用云南光唇魚(yú)和短須裂腹魚(yú)雄魚(yú)刺激滇池高背鯽卵子，獲得較高的受精率和出膜率。雌核發(fā)育的滇池高背鯽因其只繼承母體特性，遺傳性高、抗逆性強(qiáng)，在養(yǎng)殖條件下也能夠較好地保證其種質(zhì)純度，且在單一數(shù)量情況下可以迅速補(bǔ)充群體數(shù)量。通過(guò)試驗(yàn)觀察，云南光唇魚(yú)和短須裂腹魚(yú)雄魚(yú)在3月初即達(dá)到性成熟，與滇池高背鯽性腺發(fā)育同步，且雄魚(yú)精液充足，無(wú)需人工催產(chǎn)，是滇池高背鯽人工繁殖良好的選擇品種。

3.2 繁殖生物學(xué)特性

在昆明地區(qū)，滇池高背鯽性成熟時(shí)間為3月上旬。本試驗(yàn)中，3月2日即觀察到池塘中部分鯽魚(yú)排卵，3月15日檢查已全部排卵。受精卵在水溫12.9～15.0 ℃條件下，經(jīng)10 493 min即可孵出仔魚(yú)，仔魚(yú)平均全長(zhǎng)6.1 mm，與李映伶等[6]報(bào)道的滇池高背鯽孵化時(shí)間接近。

3.3 胚胎發(fā)育特點(diǎn)

滇池高背鯽卵子直徑為1.5 mm，吸水膨脹后卵子直徑可達(dá)1.8 mm，卵周隙較小。鯽屬魚(yú)類受精卵卵徑大多為1.2～2.0 mm，滇池高背鯽受精卵比彩鯽受精卵（2.0 mm）略小，與普安鯽卵徑（1.88 mm）相近，較以異源四倍體鯽鯉為父本、二倍體金魚(yú)為母本雜交形成的三倍體鯽魚(yú)卵徑（1.3～1.4 mm）略大[6-10]。

滇池高背鯽受精卵卵膜較軟，黏性強(qiáng)，顯微鏡下觀察，軟膜表面有透明膠狀體，可能是滇池高背鯽受精卵黏性強(qiáng)的原因。由于滇池高背鯽受精卵黏性強(qiáng)和卵膜軟薄的特點(diǎn)，黏附的受精卵在觀察時(shí)翻動(dòng)困難，容易破碎，觀察角度局限，加之四細(xì)胞后期細(xì)胞分裂大小不均等，細(xì)胞分裂期觀察效果不佳。

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