影響紫椴離體培養(yǎng)芽分化因素的研究

徐紹娣+邱金輝+祁永會(huì)

【摘 要】選擇不同年齡紫椴枝條上的頂芽、側(cè)芽為外植體，對(duì)其進(jìn)行組織培養(yǎng)。采用正交試驗(yàn)法對(duì)基本培養(yǎng)基、激素種類(lèi)與激素濃度進(jìn)行了篩選，找出影響芽分化的主要因子及最佳組合試驗(yàn)。

【關(guān)鍵詞】 離體培養(yǎng)；芽分化；激素；正交設(shè)計(jì)

[Abstract] The buds and buds of different age were selected as explants and tissue culture was carried out. The basic culture medium， hormone variety and hormone concentration were screened by orthogonal test.

[Key words] culture in vitro；budinitiation；hormone；orthogonal design

紫椴（Tilia amurensis Rupr）是東北林區(qū)珍貴闊葉樹(shù)種之一，木材輕軟，富有彈性，是優(yōu)良膠合板和細(xì)木工板的重要原料，花期為最好的蜜源，質(zhì)白味香是上等蜂蜜，紫椴樹(shù)冠大，抗煙、抗毒性強(qiáng)，樹(shù)姿優(yōu)美又是較好的行道樹(shù)和庭園綠化樹(shù)種。東北林區(qū)的紫椴紅松林是生產(chǎn)力較高的林型之一。多年的大量采伐和利用，已使紫椴種群的數(shù)量和質(zhì)量逐年下降，造成了紫椴資源枯竭，達(dá)到了瀕危的邊緣。為了及時(shí)挽救和最快地恢復(fù)紫椴資源，應(yīng)建立紫椴無(wú)性系人工林經(jīng)營(yíng)體系。而紫椴離體培養(yǎng)是無(wú)性繁殖中最重要的技術(shù)之一。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料的選取

莖尖：選擇25～30a生優(yōu)樹(shù)、幼樹(shù)5～10a年生、實(shí)生苗1～2a生超級(jí)苗，以及伐根萌生條1～2a枝條的項(xiàng)芽、側(cè)芽為外植體，采條時(shí)間為休眠期（10月初～10月末）；深休眠期（1～2月）；萌動(dòng)初期（4月末～5月初）。

1.2 材料的處理

將初眠枝條或萌生條采用水培至萌動(dòng)，使芽剛剛吐綠。深休眠枝條放置冰柜數(shù)日，然后用水培，培養(yǎng)至芽萌動(dòng)，將萌動(dòng)初期的枝條首先經(jīng)流水沖洗30～60min，然后用70%乙醇棉球擦洗整個(gè)枝條，然后剪取1.5～2.0cm長(zhǎng)，并帶有一個(gè)芽的小枝段，再用5%的過(guò)氧化氫消毒數(shù)分鐘，再轉(zhuǎn)入漂白粉飽和液消毒30～40min，之后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次即可接種。接種時(shí)將芽1～2層鱗片剝?nèi)?，?.8～1.0cm長(zhǎng)接種于培養(yǎng)基，芽基部要接觸培養(yǎng)基上。接種莖尖時(shí)，先將枝條水培于芽吐綠抽莖3～5mm，在無(wú)菌條件下，再切成2～3mm長(zhǎng)的莖尖接種，果實(shí)先去掉果皮，用水浸1～2d后，濃硫酸浸種20～30min，消毒后去掉果肉，夾取上胚軸做接種材料。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

誘導(dǎo)分化是以改良的MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，附加一定的激動(dòng)素（KT），外源激素有細(xì)胞分裂素6—芐基腺嘌呤（6—BA），玉米素（Zip），生長(zhǎng)素有萘乙酸（NAA），赤霉素（GA3）（本文濃度除標(biāo)明者外一律為mL/L）。繼代培養(yǎng)使用改良MS培養(yǎng)基附加6—BA、NAA等，蔗糖為2%。誘導(dǎo)生根采用改良的1/2改良的MS培養(yǎng)基附加IBA、NAA。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與測(cè)定方法

試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)L9（3）4，對(duì)基本培養(yǎng)基，激素種類(lèi)與激素濃度進(jìn)行了篩選，找出影響分化的主要因素及最佳試驗(yàn)組合，測(cè)定指標(biāo)為分化指數(shù)=分化率×分化株數(shù)×新梢平均高。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 激素種類(lèi)、濃度對(duì)芽分化的影響

試驗(yàn)對(duì)影響紫椴芽分化的主要因素進(jìn)行了篩選，采用正交L9（34）法，激素種類(lèi)為KT、6-BA和GA3，因素水平分別為0.5、1.0和1.5三個(gè)水平。

正交試驗(yàn)結(jié)果證明，激素6—BA的R值25.64為最大，所以是主要因素，GA3的R值為15.78次之，激動(dòng)素KT的R值為6.35，因素的主次順序?yàn)?—BA、GA3、KT。如果單項(xiàng)因素分析、KT因素T2為最大值，6—B因素T3為最大值，GA3D因素T1為最大值，因此確定對(duì)紫椴胚分化的最佳培養(yǎng)基是改良MS+KT1.0+6-BA3+GA30.5+NAA0.03。為了進(jìn)一步證實(shí)上述試驗(yàn)結(jié)果，又進(jìn)行了正交試驗(yàn)方差分析。結(jié)果也證明，只有激素6-BA這一因素以90%的概率保證有顯著性差異，因此認(rèn)為激素6-BA是影響紫椴芽分化的主要因素。

2.2 母樹(shù)年齡對(duì)芽的分化影響

實(shí)驗(yàn)選取的采穗母樹(shù)年齡分別為20～30年、5～8年、1～2年生實(shí)生超級(jí)苗和1年-2年生萌生條，對(duì)上述四種采條母株取芽的培養(yǎng)，在相同的條件下（取材時(shí)期、培養(yǎng)基及條件相同），60d調(diào)查芽的增殖情況并進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)1～2a生超級(jí)苗及萌生條上的芽培養(yǎng)嫩梢增長(zhǎng)較快，隨著年齡的增加，增殖效應(yīng)減慢。

2.3 有機(jī)附加物對(duì)芽的分化影響

為了啟動(dòng)休眠芽的細(xì)胞活性，除了采用適宜的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素外，在培養(yǎng)基中附加有機(jī)物質(zhì)，可以起到增強(qiáng)細(xì)胞活性的作用，促進(jìn)芽的分化。附加精氨酸、賴(lài)氨酸和谷氨酸都有不同程度的促進(jìn)作用，分化率分別高于對(duì)照25%、12%和8%。

2.4 不同取材時(shí)期對(duì)芽的分化影響

取材于不同發(fā)育階段的芽，分化率和嫩梢伸長(zhǎng)都有所差異。實(shí)驗(yàn)采用五個(gè)不同時(shí)期取材，分別是10月末（初休眠）、1～2月（休眠期）、4～5月（萌動(dòng)期）、6月初（莖尖）和6月中（莖尖）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以萌動(dòng)期（4～5月）不僅分化率高，而且嫩梢伸長(zhǎng)較快。其次是6月初取莖尖培養(yǎng)，分化效果也較理想。但到6月中旬后，隨著芽的生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，再啟動(dòng)分化也較困難，分化率下降。

3 結(jié)論

（1）從芽分化的情況可以看出，激素采用6—BA、KT、GA3效果較好。 （2） 紫椴是生長(zhǎng)較快的樹(shù)種，但幼年時(shí)期生長(zhǎng)速度甚緩，所以紫椴的芽分化和根生長(zhǎng)也都緩慢。（3）1～2a生超級(jí)苗及萌生條上的芽培養(yǎng)，嫩梢增長(zhǎng)較快，隨著年齡的增加，增殖效應(yīng)減慢。（4）在培養(yǎng)基中附加有機(jī)物，能促進(jìn)芽的分化。（5）在4～5月樹(shù)木萌動(dòng)期取的芽分化率高，而且新梢伸長(zhǎng)較快，其次是6月初取莖尖培養(yǎng)分化效果較好。