近紅外光譜法快速測量平菇菌絲總蛋白含量

李瑾+韓建東+秦宏偉+任海霞+任鵬飛+萬魯長+姚強+宮志遠

摘要：本文以平菇平板培養(yǎng)菌絲總蛋白含量為指標，在1 000～1 799 nm近紅外光譜區(qū)域采集光譜信息，采用化學計量學法建立菌株各參數(shù)的偏最小二乘法（PLS）定量預測模型。結(jié)果表明：最佳光譜預處理方法為Savitzky-Golay平滑+Savitzky-Golay導數(shù)+多元散射校正（MSC）+均值中心化，所建定量模型的校正集相關系數(shù)、校正標準差（SEC）、驗證集相關系數(shù)、預測標準差（SEP）、主因子數(shù)、SEP/SEC均在合理范圍，模型真實值與預測值的相關系數(shù)為0.67263，模型可靠性、穩(wěn)健性和預測效果較好，可用于菌絲蛋白質(zhì)含量檢測。

關鍵詞：近紅外光譜；平菇；菌絲蛋白含量；定量模型

中圖分類號：S646.1+40.1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）07-0145-05

Abstract Using the total protein content in mycelia of oyster mushroom cultured in plate medium as the index， the spectral information in 1 000～1 799 nm region was collected to establish a quantitative prediction model for the parameters of strains through partial least squares regression combined with chemometrics. The results showed that the optimal spectral pretreatment method was the combination of Savitzky-Golay smoothness + Savitzky-Golay derivative + MSC + Mean-Centering. Parameters of the quantitative model including RC， SEC， RP， SEP， MF， SEP/SEC were all in the reasonable regions. The correlation coefficient of the real value and predictive value of the model was 0.67263. The prediction model had better reliability， robustness and predictive effects， so it could be used for protein content detection in mycelia.

Keywords Near infrared spectroscopy； Oyster mushroom； Protein content in mycelia； Quantitative model

平菇是山東省食用菌栽培的主要菇種之一，年產(chǎn)量超過160萬噸，占全省食用菌總產(chǎn)量1/3以上，在全國僅次于河南省。平菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展最基本的條件是生產(chǎn)菌株，而選育高品質(zhì)、高抗病、高轉(zhuǎn)化率的平菇菌種是食用菌科研的根本目標。對大多數(shù)菌株來說，同培養(yǎng)條件下，特定時間內(nèi)菌體積累的蛋白質(zhì)含量往往與出菇時間、出菇品質(zhì)緊密相關，因而測定平菇菌體蛋白質(zhì)含量就成為平菇種質(zhì)資源鑒定以及品種選育的重要方式之一。目前測定平菇菌體中的蛋白含量主要使用紫外分光光度計法、凱氏定氮法和旋光法等[1]，這些方法可靠性高，但所需樣品量大、采樣過程對樣品產(chǎn)生污染損耗，無法多次連續(xù)測量，測定步驟繁瑣、費用高。而在平菇育種過程中，一般采用平板培養(yǎng)的方式對大量種質(zhì)資源、突變體、雜交后代材料進行鑒定和篩選，如果采用傳統(tǒng)分析方法意味著巨大的工作量和試驗結(jié)果同步性不足，因而需要快速、無損無污染的檢測方法即時監(jiān)控菌體蛋白質(zhì)含量變化過程。

近紅外光譜（Near Infrared，NIR） 分析技術(shù)近年來在農(nóng)業(yè)育種、質(zhì)量檢測領域發(fā)展迅速，其原理是利用光譜儀獲取有機物在近紅外光譜區(qū)的特征振動吸收信息，與其在化學分析法基礎上取得的測定值對應，通過數(shù)學方法建立近紅外光譜分析模型，待測樣品通過該模型快速與光譜信息庫內(nèi)模型比對計算，給待測參數(shù)定量，從而一次性獲取樣品中多種化學成分含量數(shù)值，是一種簡便無損無需生化試驗操作的即時檢測手段[2]。

因為平板培養(yǎng)是食用菌育種篩選優(yōu)良新品種、測定菌株形態(tài)和生理生化指標最常用的方法之一，研究組以70個平板培養(yǎng)模式下的平菇菌株為對象，用分光光度計法測定其蛋白質(zhì)含量，利用SupNIR-2720近紅外光譜分析儀，優(yōu)化光譜預處理方法，建立平菇菌體蛋白質(zhì)含量的相關模型，并對建模效果進行評價，以期為平菇蛋白質(zhì)含量指標的準確快速檢測提供依據(jù)，為平菇種質(zhì)資源評價篩選提供一種快速、簡便、無損的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

供試材料：平菇為山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所菌種庫保藏的70個菌株。平板培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g，加水至1 000 mL[3]。每個菌株接種3個平板，25℃避光培養(yǎng)9 d。

儀器設備：近紅外光譜分析儀（杭州聚光科技SupNIR-2720 ）、紫外分光光度計（北京普析T6新世紀）、恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊）、生物樣品研磨器（法國Bertin Precellys Evolution ）、烘箱（淄博新華醫(yī)療）、高速冷凍離心機（Eppendorf 5810 ）

1.2 檢測方法

1.2.1 平板菌體蛋白質(zhì)含量測定 采用標準曲線法。首先從5.00 mg/mL標準蛋白質(zhì)溶液中用移液器分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用0.9% NaCl溶液分別稀釋至10 mL，以0.9% NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測定各標準溶液的吸光度，以標準溶液吸光度U為縱坐標、蛋白質(zhì)含量（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線[4]（圖1），可得標準溶液蛋白質(zhì)含量標準曲線公式：y=0.6352x+0.0068，R2=0.9867 。

制備檢測樣品：每個菌株平板刮取500 mg菌絲放入加研磨珠的研磨管，液氮冷凍，放入生物樣品研磨器5 000 r/min、5 min研磨2輪，再加入0.9%NaCl溶液1.0 mL，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液0.1 mL，用0.9% NaCl溶液稀釋至10 mL，得到待測樣品。將紫外分光光度計波長設為280 nm，檢測樣品吸光度，每樣品做3份平行取平均值，代入標準曲線計算對應樣品蛋白質(zhì)濃度[5]。根據(jù)樣品蛋白質(zhì)濃度計算平板菌體蛋白質(zhì)含量。

1.3 光譜數(shù)據(jù)采集

提前12 h將樣品平板從恒溫箱中取出，放入25℃烘箱除去樣品的冷凝水。在光譜采集過程中保持25℃環(huán)境溫度、35%環(huán)境濕度，使待測樣品溫度和濕度基本一致[6]。設置光譜掃描范圍為1 000～1 799 nm，分辨率為10 nm，波長準確性為0.2 nm，波長重復性為±0.05 nm，吸光度噪聲小于50 μA。將待測平板放在檢測槽正中，面朝上并保證旋轉(zhuǎn)掃描區(qū)域都在平板之內(nèi)，樣品旋轉(zhuǎn)一周為5 s，重復掃描采集3次形成一條反射光譜儲存。每個菌株采集3 個平板光譜信息，作為原始光譜，并將光譜信息轉(zhuǎn)換成吸光度值儲存[7]。

1.4 光譜預處理

將各樣品含量數(shù)據(jù)與光譜數(shù)據(jù)一一對應并進行關聯(lián)，使用RIMP化學計量學分析軟件進行光譜處理，采用k-s分類方法將樣品集劃分為校正集和驗證集，采用80∶20的馬氏距離分配[8]，將樣品隨機劃分為168個校正集和42個驗證集。

1.5 模型建立與評價方法

采用標準化、求導、平滑、信號校正等11 種預處理方法處理光譜。先用168個校正樣品集在全光譜范圍下應用偏最小二乘法（partia least squares method，PLS）建立校正模型，再將驗正樣品集進行外部驗證，以校正標準差（SEC）、交互驗證標準差（SECV）、預測標準差（SEP）、校正集相關系數(shù)（RC）和驗證集相關系數(shù)（RP）、主因子數(shù)（MF）為參考標準，選出最優(yōu)樣品預處理方法[9]。根據(jù)一般模型評價的規(guī)則，在主因子數(shù)較少，SEP/SEC<1.2條件下，校正標準差、交互驗證標準差、預測標準差越小且相互間越接近，說明近紅外分析結(jié)果與化學分析結(jié)果越吻合，可信度越高；校正集相關系數(shù)和驗證集相關系數(shù)越接近1，則模型預測值與化學分析值越接近，模型的準確度越高。以上述參數(shù)作為評價指標對模型進行優(yōu)化時，應剔除個別異常值[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學分析結(jié)果

210個樣品蛋白含量試驗數(shù)據(jù)范圍為 5.950%～14.510%，平均值為 10.000%，將其輸入RIMP軟件做參比值分析，參比值分布區(qū)見圖2，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)參比值變化幅度較大、分布范圍比較寬，說明樣品具有較好的代表性，建立的模型適用性較高[11]。

2.2 光譜數(shù)據(jù)預處理

經(jīng)掃描獲得210份平菇樣品的近紅外光譜圖（圖3）。從中可看出，光譜在1466 nm附近有最大吸收，該處位于蛋白質(zhì)特征吸收譜段[122]。各樣品的光譜波形很相似，但并不完全重合，這表明不同樣本之間重現(xiàn)性良好，又存在差異。為了消除樣品檢測過程誤差對建模的影響，需要對光譜進行預處理[13]。

2.2.1 校正集、驗證集樣品分析 由表1可見，校正集和驗證集蛋白質(zhì)含量數(shù)據(jù)的最大值、最小值及平均值與總樣品數(shù)據(jù)接近，化學值分布的離散程度較高，表明校正集和驗證集的分組合理，其數(shù)據(jù)相對于總樣品具有代表性；驗證集數(shù)據(jù)標準差、平均值與校正集偏差小，且上下限均包含在校正集數(shù)據(jù)內(nèi)，因而驗證集可用于對校正集所建模型的驗證[14]。

2.2.2 光譜預處理方法的選擇與最優(yōu)模型構(gòu)建 通過RIMP軟件中的自動優(yōu)化功能，對最佳光譜預處理方法進行篩選，最終確定在1 000～1 799 nm光譜范圍內(nèi)，Savitzky-Golay平滑+Savitzky-Golay導數(shù)+多元散射校正（MSC）+均值中心化為最優(yōu)光譜預處理方法，采用PLS方法建立樣品集分析預測模型，用驗證集樣品對模型進行驗證，并依據(jù)相應參評指標的優(yōu)劣篩選出最優(yōu)光譜預處理方法，最優(yōu)參評指標見表2。圖4顯示當主因子數(shù)為14的時候，得到的press值最小，但綜合試驗數(shù)據(jù)分析，主因子數(shù)為8時，模型能夠包含樣品集絕大多數(shù)光譜信息和蛋白含量信息，模型的預測偏差最小，因此模型最佳主因子數(shù)為8。

2.2.3 模型驗證結(jié)果 用樣品集建立的模型對驗證集進行預測，其回歸效果如圖5所示。從中可以看出真實值與預測值分布在直線兩側(cè)，其相關系數(shù)為0.67263，說明預測效果比較好，化學法和近紅外儀器法測定結(jié)果無顯著差異，近紅外測定結(jié)果準確可靠。

3 討論與結(jié)論

近紅外光譜作為一種間接性鑒定技術(shù)，能夠無損、快速、準確給出成分復雜物質(zhì)的特異圖譜，作為定性和定量分析的依據(jù)[16，17]，該方法如果用于生產(chǎn)過程實時定量監(jiān)測，將成為食用菌育種、生產(chǎn)自動化條件下質(zhì)量控制的理想工具。

本研究以70個平菇菌株的210組數(shù)據(jù)為樣本，采集樣本在1 000～1 799 nm區(qū)域近紅外光譜，以平板菌絲蛋白質(zhì)含量為參考指標，通過化學分析方法得到與近紅外光譜信息對應建模數(shù)據(jù)，分別輸入軟件，采用Savitzky-Golay平滑+Savitzky-Golay導數(shù)+多元散射校正（MSC）+均值中心化作為光譜預處理方法，應用偏最小二乘法（PLS）建立平菇蛋白質(zhì)含量預測模型，經(jīng)驗證該模型真實值與預測值的相關系數(shù)為0.67263，預測結(jié)果符合有效范圍，可用于平菇菌體蛋白質(zhì)含量的快速無損檢測。

后續(xù)試驗中發(fā)現(xiàn)，在控制環(huán)境并嚴格操作流程的重復性試驗條件下，大部分預測結(jié)果與實際試驗數(shù)據(jù)偏差均在試驗許可范圍內(nèi)，但建模樣本數(shù)量、參考指標樣本的分布廣度、樣品狀態(tài)、水含量等都是影響模型準確度的重要因素，需要不斷加入新的樣品進行模型補充矯正，進一步提高模型的穩(wěn)定性和準確性[15]。

參 考 文 獻：

[1]石禮娟.基于可見光/近紅外光譜的稻米質(zhì)量快速無損檢測研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2011.

[2]宦克為.小麥內(nèi)在品質(zhì)近紅外光譜無損檢測技術(shù)研究[D].長春：長春理工大學，2014.

[3]張玉森，姚霞，田永超，等.應用近紅外光譜預測水稻葉片氮含量[J]. 植物生態(tài)學報，2010（6）：704-712.

[4]呂慧. 基于近紅外光譜技術(shù)的大米品質(zhì)分析與種類鑒別[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學，2011.

[5]于燕波. 近紅外光譜分析技術(shù)在轉(zhuǎn)基因水稻識別和高油棉籽篩選中的應用研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2014.

[6]畢京翠，張文偉，肖應輝，等. 應用近紅外光譜技術(shù)分析稻米蛋白質(zhì)含量[J]. 作物學報，2006，32（5）：709-715.

[7]汪成龍. 基于多源信息融合的馬鈴薯分級無損檢測方法研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2014.

[8]劉培. 油菜品質(zhì)多參數(shù)近紅外檢測技術(shù)的建立與應用[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2008.

[9]高居榮，樊廣華，李圣福，等. 近紅外光譜技術(shù)分析小麥品質(zhì)的應用研究[J]. 實驗技術(shù)與管理，2009（3）：42-44.

[10]席志勇. 基于近紅外光譜技術(shù)蕎麥無損檢測方法研究[D].昆明：昆明理工大學，2013.

[11]俞永華.近紅外光譜技術(shù)定量測定基質(zhì)參數(shù)研究[J]. 光譜學與光譜分析，2011（11）：2928-2931.

[12]宋麗華. 花生籽仁蛋白質(zhì)含量近紅外光譜模型的建立及育種應用[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2011.

[13]秦利，劉華，杜培，等. 基于近紅外光譜法的花生籽仁中蔗糖含量的測定[J]. 中國油料作物學報，2016，38（5）：666-671.

[14]姚霞，湯守鵬，曹衛(wèi)星，等. 應用近紅外光譜估測小麥葉片氮含量[J].植物生態(tài)學報，2011，35（8）：844-852.

[15]唐月明. 稻谷品種和品質(zhì)的光譜快速無損檢測研究[D].杭州：浙江大學，2008.

[16]王剛. 花椒揮發(fā)油含量近紅外光譜無損檢測研究[D].重慶：西南大學，2008.

[17]林新. 綠茶主要成分近紅外光譜分析方法研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2008.