產(chǎn)后蒜薹灰霉病菌產(chǎn)毒條件研究

王勇+張春祥+高葦+孔慶學(xué)+閻瑞香+張娜

摘要：由灰葡萄孢霉引起的蒜薹灰霉病是貯藏期蒜薹的重要病害之一?；移咸焰呙箍梢援a(chǎn)生真菌毒素，為明確灰葡萄孢霉的最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間，本研究從蒜薹主產(chǎn)區(qū)采集的蒜薹灰霉病病樣上分離到灰葡萄孢霉強(qiáng)致病菌株BC-3，通過(guò)黃瓜種子萌發(fā)生長(zhǎng)法、葉片圓盤法、蒜薹懸滴接種法及系統(tǒng)侵染法4種方法測(cè)定灰葡萄孢霉毒素對(duì)黃瓜和蒜薹的生物活性。結(jié)果表明，蒜薹灰葡萄孢霉毒素為非寄主選擇性毒素，最適產(chǎn)毒培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和淀粉酵母培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為12～18 d。

關(guān)鍵詞：蒜薹；灰霉病；灰葡萄孢霉；培養(yǎng)條件；真菌毒素；生物活性

中圖分類號(hào)：S436.33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2017）07-0116-04

Abstract The grey mold on garlic scape infected by Botrytis cinerea is one of the main fungal diseases during the storage of garlic scape. The pathogen Botrytis cinerea can produce mycotoxin. In order to research the optimum medium and culture time of mycotoxin production of Botrytis cinerea， the Botrytis cinerea BC-3 with high pathogenicity isolated from garlic scape was selected for target strain in this study. The bioassay of crude toxin was detected by germination-growth of cucumber seeds， plant leaf disc test， garlic scape droplet inoculation and scape wilting method. The results showed that the toxin of Botrytis cinerea was nonhost-selective toxin， the optimal medium for mycotoxin production was potato glucose medium and starch yeast medium， and the culture time was 12～18 days.

Keywords Garlic scape； Grey mold； Botrytis cinerea； Culture condition；Mycotoxin； Bioassay

灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）是引起產(chǎn)后蒜薹灰霉病的重要致病病原之一[1，2]，嚴(yán)重威脅蒜薹貯藏和市場(chǎng)供應(yīng)?；移咸焰呙钩Ｔ谥参锇l(fā)育早期侵入宿主，并在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持沉默，直到宿主植物生理發(fā)生變化有利于其生長(zhǎng)時(shí)，引發(fā)宿主軟腐、組織壞死。究其原因是由于灰葡萄孢霉在與宿主植物相互識(shí)別、相互作用的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物——真菌毒素，毒素在致病過(guò)程中會(huì)起決定因子的作用[3，4]。1974年灰葡萄孢霉產(chǎn)生的二環(huán)倍半萜烯類毒素Botrydial最早被分離鑒定出來(lái)，經(jīng)檢測(cè)Botrydial的毒性很高，其它毒素多為其前體或衍生物[5，6]。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)被灰葡萄孢霉侵染的宿主植物出現(xiàn)傷口后，植物組織細(xì)胞中就可以檢測(cè)到Botrydial，但植物本身并不能分泌這種化合物。隨著植物葉片上萎黃程度增高，檢測(cè)到Botrydial的量也增加，所以灰葡萄孢霉分泌的二環(huán)倍半萜類毒素被認(rèn)為是灰霉病致病的關(guān)鍵因素，這些毒素可以引發(fā)宿主植物萎黃病和組織細(xì)胞破裂[7]。

目前，關(guān)于灰葡萄孢霉毒素的分離提取、活性成分鑒定方面已有部分研究報(bào)道[8]，發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢霉產(chǎn)生的毒素Botrydial是非寄主選擇性毒素[9]，但研究顯示侵染蒜薹和黃瓜的灰葡萄孢霉在菌株的生物學(xué)、致病力上都存在顯著差異[10-12]。而目前對(duì)采后蒜薹灰葡萄孢霉毒素的研究報(bào)道較少，且毒素對(duì)采后蒜薹的致病作用方式尚不明確。據(jù)此，本試驗(yàn)對(duì)蒜薹灰葡萄孢霉的產(chǎn)毒條件及毒素對(duì)蒜薹和黃瓜活性進(jìn)行研究，以期找到該病原菌產(chǎn)毒的最適培養(yǎng)條件和毒素活性評(píng)價(jià)方法，為產(chǎn)后蒜薹灰霉病毒素致病機(jī)制等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

采集產(chǎn)后蒜薹灰霉病典型發(fā)病樣本，按常規(guī)組織分離方法分離獲得病原菌，經(jīng)純化獲得蒜薹灰霉病菌純培養(yǎng)菌株10株。依據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定，驗(yàn)證結(jié)果表明該10個(gè)菌株均可侵染蒜薹，在蒜薹薹條和薹苞上形成黃色的梭形或不規(guī)則形病斑。其中菌株BC-3致病力較強(qiáng)，經(jīng)鑒定為灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），選其作為產(chǎn)毒培養(yǎng)基篩選的靶標(biāo)菌株。

1.2 灰葡萄孢霉粗毒素濾液的制備

本試驗(yàn)采用以下5種液體培養(yǎng)基：（1）馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱PD培養(yǎng)基，下同）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，加蒸餾水至1 L。（2）淀粉酵母培養(yǎng)基：可溶性淀粉40 g，酵母浸膏5 g，蒸餾水1 L。（3）酵母浸膏Ⅰ培養(yǎng)基：酵母浸膏0.9 g、蒸餾水1 L。（4）酵母浸膏Ⅱ培養(yǎng)基：酵母浸膏4 g、麥芽膏10 g、葡萄糖4 g、蒸餾水1 L。（5）Czapeks培養(yǎng)基：NaNO3 3 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 1 g， FeSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖30 g，蒸餾水1 L。

在250 mL三角瓶中分別加入150 mL上述5種液體培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基每個(gè)取樣時(shí)間段設(shè)定3次重復(fù)。將供試灰葡萄孢霉BC-3菌株移至PDA培養(yǎng)基上活化，于25℃下培養(yǎng)4 d，用直徑4 mm打孔器在長(zhǎng)勢(shì)一致的菌落邊緣打取菌餅，每瓶接種5塊菌餅，在黑暗條件下25℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)第0、3、6、9、12、15、18、21、24 d各取一瓶培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液通過(guò)雙層滅菌濾紙過(guò)濾除去菌絲體和孢子，后用0.22 μm微孔濾膜加壓抽濾，獲得無(wú)菌濾液，即灰葡萄孢霉Botrydial粗毒素濾液。4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?

1.3 不同培養(yǎng)條件下灰葡萄孢霉毒素對(duì)黃瓜和蒜薹生物活性的測(cè)定

1.3.1 對(duì)黃瓜種子活性 采用種子萌發(fā)生長(zhǎng)法測(cè)定。黃瓜品種為長(zhǎng)春密刺，將50粒種子置于鋪有雙層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，分別加入不同培養(yǎng)條件下灰葡萄孢霉產(chǎn)毒素濾液5 mL，以無(wú)菌水為對(duì)照，各處理設(shè)定3次重復(fù)。在28℃培養(yǎng)箱中催芽3 d，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽情況，測(cè)量芽長(zhǎng)，計(jì)算毒素抑制發(fā)芽率。

1.3.2 對(duì)黃瓜離體葉片活性 采用圓盤葉片法測(cè)定。將同一生長(zhǎng)期的黃瓜葉片用直徑1 cm的打孔器打取葉盤，然后每20個(gè)葉盤為一個(gè)重復(fù)，立即浸入含有10 mL灰葡萄孢霉粗毒素濾液的直徑為9 cm培養(yǎng)皿中（葉盤背面朝下），以不同培養(yǎng)條件下灰葡萄孢霉產(chǎn)毒素濾液浸黃瓜葉片為處理，以無(wú)菌蒸餾水為對(duì)照，每處理設(shè)3次重復(fù)。于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d（光/暗周期為12 h）后，采用SPAD-502葉綠素儀測(cè)定葉綠素含量。毒素作用會(huì)使黃瓜葉盤褪綠變黃，通過(guò)葉盤的葉綠素變化來(lái)衡量毒素活性。

1.3.3 對(duì)蒜薹薹條活性 ①采用懸滴接種法測(cè)定。選取同一生長(zhǎng)期的蒜薹薹條，將其放在鋪有兩層浸濕濾紙的大培養(yǎng)皿中，在蒜薹薹條表面采用接種針制造傷口，懸滴接種20 μL粗毒素濾液于傷口表面，以不同培養(yǎng)條件下灰葡萄孢霉產(chǎn)毒素濾液懸滴接種蒜薹薹條為處理，每皿放入5根蒜薹薹條，以接種20 μL無(wú)菌水為對(duì)照，每處理重復(fù)3皿。25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后（光/暗周期為12 h），調(diào)查毒素接種點(diǎn)的細(xì)胞損傷情況。毒素作用蒜薹細(xì)胞造成細(xì)胞損傷，會(huì)使其自接種點(diǎn)位置褪綠變黃，并擴(kuò)展形成病斑，通過(guò)接種點(diǎn)細(xì)胞壞死、黃變、擴(kuò)展程度衡量毒素細(xì)胞損傷活性。

②采用系統(tǒng)侵染法測(cè)定。取20 mL燒瓶，分別加入各處理獲得的粗毒素濾液5 mL，將同一生長(zhǎng)期的蒜薹薹條浸入濾液中，以浸入5 mL無(wú)菌水為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后（光/暗周期為12 h），調(diào)查蒜薹薹條的黃變程度。毒素作用會(huì)通過(guò)蒜薹輸導(dǎo)系統(tǒng)傳導(dǎo)使蒜薹上部發(fā)生褪綠、黃化，可通過(guò)蒜薹的整體黃變程度來(lái)衡量毒素對(duì)蒜薹產(chǎn)生毒性影響的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件下灰葡萄孢霉毒素濾液對(duì)黃瓜種子生長(zhǎng)的抑制作用

試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，灰葡萄孢霉在5種培養(yǎng)基中均能正常生長(zhǎng)，其中在PD培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)6 d后菌絲生長(zhǎng)較多，培養(yǎng)濾液顯著少于其它培養(yǎng)基，菌絲聚集纏繞形成較大的菌球。在Czapeks培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)緩慢，形成較小的菌絲球。其它3種培養(yǎng)基中，菌絲生長(zhǎng)中等。

不同條件產(chǎn)毒素處理對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)率和胚根生長(zhǎng)影響有極顯著差異。其中，在相同培養(yǎng)基上，隨時(shí)間延長(zhǎng)毒素作用呈現(xiàn)先增強(qiáng)再減弱的趨勢(shì)， PD培養(yǎng)9～18 d、淀粉酵母培養(yǎng)6～21 d、酵母Ⅰ和酵母Ⅱ培養(yǎng)12～15 d、Czapeks培養(yǎng)21～24 d產(chǎn)生毒素對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和胚根伸長(zhǎng)影響較大；在相同培養(yǎng)時(shí)間， 淀粉酵母培養(yǎng)灰葡萄孢霉產(chǎn)生的毒素對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，顯著或極顯著高于其他處理和對(duì)照，PD培養(yǎng)基次之?；移咸焰呙乖诘矸劢湍概囵B(yǎng)基和PD培養(yǎng)基培養(yǎng)12 d后產(chǎn)生的毒素對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和胚根伸長(zhǎng)抑制最為明顯，酵母Ⅱ、酵母Ⅰ和Czapeks培養(yǎng)毒素次之，但抑制效果均高于對(duì)照（表2）。

2.2 不同培養(yǎng)條件下灰葡萄孢霉毒素濾液對(duì)黃瓜離體葉片的影響

由表3可見，由5種培養(yǎng)基培養(yǎng)3、6 d的毒素濾液處理黃瓜葉盤后，葉綠素SPAD值與清水對(duì)照無(wú)極顯著差異，而從培養(yǎng)9 d開始，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，5種培養(yǎng)基產(chǎn)生毒素濾液處理黃瓜葉盤，葉綠素SPAD值基本呈逐漸減少趨勢(shì)。但在相同時(shí)間不同培養(yǎng)基處理對(duì)葉綠素SPAD值影響程度不同。其中PD培養(yǎng)9～24 d的毒素處理葉綠素SPAD值顯著或極顯著低于清水對(duì)照、酵母Ⅰ和Czapeks培養(yǎng)毒素處理；淀粉酵母培養(yǎng)9～18 d毒素處理的葉綠素極顯著低于清水對(duì)照、酵母Ⅰ和Czapeks培養(yǎng)毒素處理；酵母Ⅰ培養(yǎng)9～15 d毒素處理的葉綠素顯著高于清水對(duì)照；酵母Ⅱ培養(yǎng)9～12 d和Czapeks培養(yǎng)12～15 d毒素處理的葉綠素顯著低于清水對(duì)照。綜合不同培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)時(shí)間灰葡萄孢霉產(chǎn)生的粗毒素液處理黃瓜葉片葉綠素SPAD值，PD和淀粉酵母培養(yǎng)基處理產(chǎn)生的毒素抑制作用最強(qiáng)。

2.3 懸滴接種法測(cè)定粗毒素濾液對(duì)蒜薹薹條的影響

由表4可見，接種3 d后，對(duì)照處理薹條基本無(wú)變化，而接種毒素濾液處理的薹條接種點(diǎn)出現(xiàn)不同程度褪綠黃斑。其中PD培養(yǎng)基對(duì)蒜薹薹條接種點(diǎn)細(xì)胞的損傷程度最大，培養(yǎng)3 d產(chǎn)生的毒素即可使接種點(diǎn)失綠，培養(yǎng)15 d產(chǎn)生的毒素即可使接種點(diǎn)失綠變黃，培養(yǎng)18 d產(chǎn)生的毒素即可使接種點(diǎn)失綠變黃擴(kuò)展；淀粉酵母和酵母Ⅱ培養(yǎng)基次之，培養(yǎng)3 d產(chǎn)生的毒素即可使接種點(diǎn)失綠，培養(yǎng)18 d產(chǎn)生的毒素即可使接種點(diǎn)失綠變黃；酵母Ⅰ培養(yǎng)基培養(yǎng)9 d產(chǎn)生的毒素可使接種點(diǎn)失綠，培養(yǎng)21 d產(chǎn)生的毒素可使接種點(diǎn)失綠變黃； Czapeks培養(yǎng)基培養(yǎng)18 d產(chǎn)生的毒素才可使接種點(diǎn)失綠。

2.4 系統(tǒng)侵染法測(cè)定粗毒素濾液對(duì)蒜薹薹條的影響

由表5結(jié)果可知，接種3 d后清水對(duì)照薹條上未見變化，而毒素濾液處理薹條呈現(xiàn)不同程度的褪綠現(xiàn)象，說(shuō)明毒素可通過(guò)蒜薹輸導(dǎo)組織使蒜薹整體發(fā)生褪綠、黃化。不同培養(yǎng)基之間及相同培養(yǎng)基不同培養(yǎng)時(shí)間產(chǎn)生毒素引起的蒜薹薹條的黃花程度趨勢(shì)同懸滴接種法，只是系統(tǒng)侵染法下各處理影響程度略低于懸滴接種法。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)黃瓜種子萌發(fā)生長(zhǎng)法、黃瓜圓盤葉片法以及蒜薹懸滴接種法、蒜薹系統(tǒng)侵染法，對(duì)不同培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間獲得灰葡萄孢霉毒素活性進(jìn)行量化比較，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)條件獲得毒素對(duì)黃瓜和蒜薹表現(xiàn)的毒素反應(yīng)和強(qiáng)弱趨于一致，即灰葡萄孢霉的產(chǎn)毒能力與其培養(yǎng)基成分密切相關(guān)，在PD、淀粉酵母培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生毒素的活性較高，可作為其產(chǎn)毒培養(yǎng)基；在相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)毒素活性也具有顯著影響，PD和淀粉酵母培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～18 d，產(chǎn)毒活性最大，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)毒素活性具有抑制作用。說(shuō)明采后蒜薹灰葡萄孢霉毒素為非寄主選擇性毒素，該試驗(yàn)結(jié)果與Colmenares等[9]報(bào)道的結(jié)果一致。

種子萌發(fā)生長(zhǎng)法和圓盤葉片法均可對(duì)毒素活性進(jìn)行量化比較，而懸滴接種法及系統(tǒng)侵染法主要通過(guò)癥狀觀察衡量毒素活性強(qiáng)弱，且灰葡萄孢霉毒素為非寄主選擇性毒素，因此筆者認(rèn)為在毒素產(chǎn)生條件篩選試驗(yàn)中，在獲得的毒素濃度有限的條件下，可以采用種子萌發(fā)生長(zhǎng)法和圓盤葉片法兩種活性測(cè)定方法。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]趙淑艷，李喜宏，陳麗，等. 蒜薹采后致病菌種類及侵染規(guī)律研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（9）：74-78.

[2]劉麗影.影響蒜薹物流質(zhì)量安全的病害診斷及致病性研究[D].上海：華東師范大學(xué)，2013.

[3]石鳳梅. 植物病原真菌毒素研究進(jìn)展[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，26（2）：70-73.

[4]Aksenova V A. Toxicity of polysaccharide fraction of toxin of Botrytis cinerea[J]. Doklady.，1963，147：1426.

[5]Culter H G， Jacyno J M， Harwood J S， et al. Botcinolide： a biologically active natural product from Botrytis cinerea[J].Bioscience， Biotechnology and Biochemist， 1993， 57（11）：1980-1982.

[6]Jacyno J M， Harwood J S， Culter H G， et al. Structure and solution - state conformation of botcinolide， a new biologically active metabolite from the fungus Botrytis cinerea[J]. Tetrahedron， 1994， 50（40）：11585-11592.

[7]Deighton N， Muckenschnabel I， Colmenares A J， et al.Botrydial is produced in plant tissues infected by Botrytis cinerea[J]. Phytochemistry， 2001， 57（5）：689-692.

[8]Patron R D， Galan R H， Rebordinos L G， et al. Structure-activity relationships of new phytotoxie metabolites with the botryane skeleton from Botrytis cinerea[J]. Tetrahedron， 1999， 55：2389-2400.

[9]Colmenares A J， Aleu J， Durun-Patron R， et al. The putative role of botrydial and related metabolites in the infection [J]. Journal of Chemical Ecology， 2002， 28（5）：997-1005.

[10]王燕燕，薛婷，梁寧，等. 蒜薹灰霉病菌的生物學(xué)特性研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（8）：113-116.

[11]張從宇，高智謀，岳永德. 番茄灰霉病菌生物學(xué)性狀研究[J]. 安徽技術(shù)示范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，16（3）：10-14.

[12]童蘊(yùn)慧，陳夕軍，徐敬友，等. 江蘇省蔬菜灰葡萄孢生物學(xué)性狀及致病力研究初報(bào)[J]. 中國(guó)蔬菜，2003（1）：33-34.