抗菌肽基因工程化研究進展

李忠強　鄭偉　閆春梅　韓葉

摘 要 作為最具潛力的抗生素替代藥物，抗菌肽業(yè)已成為業(yè)界研究重點。為了解決抗菌肽因產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高而無法大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用的難題，研究人員適時引入了基因工程技術(shù)，人工構(gòu)建抗菌肽基因，進而研發(fā)基因工程抗菌肽藥物。本文分析了抗菌肽基因工程化的研究歷程，為抗菌肽的深入研究及廣泛應(yīng)用添磚加瓦。

關(guān)鍵詞 抗菌肽；基因工程

中圖分類號 Q7 文獻標識碼 A 文章編號 2095-6363（2017）11-0027-02

基因工程技術(shù)在傳統(tǒng)生產(chǎn)中的應(yīng)用，生產(chǎn)高效低毒的新型抗生素是中國今后發(fā)展生物醫(yī)藥的重點之一。抗菌肽是生物體天然免疫的重要組成部分，是應(yīng)對病原物質(zhì)侵染而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答產(chǎn)物[1]，在生物體的整個防御體系中有著顯著的作用?？咕囊彩且环N新型的多肽藥物——一類膜活性多肽，同時具備抗霉菌、廣譜殺菌、抑病毒、抑殺腫瘤細胞等多重功效。作為一種最具潛力的新型抗生素，降低成本、提高產(chǎn)量是對抗菌肽研究及廣泛應(yīng)用的基本要求。目前廣大科研工作者致力于研究運用基因工程技術(shù)構(gòu)建新型抗菌肽基因，再經(jīng)微生物培養(yǎng)得到相應(yīng)抗菌肽，希望最終能得到新型基因工程抗菌肽型抗生素。另外，對抗菌肽基因工程改良動物或植物的研究早已展開，目前已獲得具有轉(zhuǎn)抗菌肽基因動植物，均具有較高抗病性。近期研究中，由于大腸桿菌表達系統(tǒng)表達效率高、成本低，也成為抗菌肽基因工程表達的良好方式。

1 抗菌肽基因表達

對于基因表達，較常用的方法包括原核表達和真核表達。目前原核表達多采用大腸桿菌工程菌（E.coli）；真核表達包括酵母表達、桿狀病毒表達等。針對抗菌肽基因表達研究，目前在原核表達和真核表達方面均有

開展。

1.1 原核表達

抗菌肽，因其對宿主菌E.coli有很強的殺傷力而不能直接表達[2]。目前為止，對抗菌肽的原核表達多采用先融合表達再裂解純化的方法。早在1994年，在E.coli中將鏈霉素枯草桿菌蛋白酶抑制物（SSI）與蜜蜂抗菌肽apidaecin 1b（AP1）融合表達，得出了SSI-AP1融合蛋白[3]。之后，以硫氧還蛋白作為載體，融合人源抗菌肽LL-37[4]、抗菌肽ranalexin[5]在E.coli中表達，均得到高表達量蛋白。除此之外，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST和泛素相關(guān)小蛋白修飾SUMO，均可作為載體，促進抗菌肽在E.coli中進行可溶性表達[6]。另外，類固醇異構(gòu)酶、PaP3.30、TAF12組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域和Purf片段等可促進抗菌肽在E.coli中進行包涵體

表達[7]。

1.2 在酵母中真核表達

采用酵母系統(tǒng)表達抗菌肽基因是當前應(yīng)用最廣泛的方法，1999年就有在釀酒酵母中表達出sarcotoxin 1A的報道，并成功檢測到與成熟sarcotoxin 1A分子量相近的肽[8]。2003年，劉忠淵等利用酵母表達系統(tǒng)成功表達了對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制性的新疆家蠶抗菌肽cecropin基因，抑菌圈達1.5cm[9]。2004年，張素芳等[10]成功構(gòu)建了分泌型重組酵母表達載體p PICZA-A-mag和p PICZA-A-CM，獲得了類似天然抗菌肽大小的magainin及cec A-mil蛋白。兩者對金黃色葡萄球菌及E.coli均有較好的抑殺性。2016年，陳騫等通過Infusion技術(shù)成功構(gòu)建了pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs重組質(zhì)粒。通過電轉(zhuǎn)化將線性化pPIC9K-CAMPs轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115基因組中，篩選高拷貝菌株GS-PK-CAMPs。再將線性化pPICZαA-CAMPs轉(zhuǎn)入重組酵母GS-PK-CAMPs中，篩選出高拷貝菌株GS-PKZ-CAMPs。最終成功獲得了GS-PKZ-CAMPs可誘導(dǎo)表達菌株[11]。

1.3 在桿狀病毒中表達

利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達抗菌肽也是當前抗菌肽基因工程表達研究中應(yīng)用較廣泛的方法。2001年，趙東紅利用Bac to Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)在甜菜夜蛾蟲體中成功表達出了中國家蠶抗菌肽人工合成類CMIV基因[12]。2008年，趙昆等在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中成功表達了?？咕腂ac7-Bac5-β defense串聯(lián)基因，構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)座載體，轉(zhuǎn)化DH10 Bac大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得重組桿狀病毒穿梭載體，最終獲得了具有抑菌活性的重組蛋白[13]。2013年，劉暉等也采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，成功構(gòu)建了含家蠅抗菌肽attacin重組桿狀病毒表達載體[14]。

2 轉(zhuǎn)抗菌肽基因動物

2.1 昆蟲

現(xiàn)階段下，在我國國內(nèi)關(guān)于轉(zhuǎn)基因動物的研究已經(jīng)如火如荼，如何將具有抗病性的抗菌肽基因轉(zhuǎn)化到動物體內(nèi)，用以提高動物體的抗病力成為國內(nèi)外研究人員關(guān)注的焦點，經(jīng)多年研究，業(yè)已取得了一些進展。早在1998年，Possani LD 等成功構(gòu)建了一種轉(zhuǎn)抗菌肽基因蚊子，利用蚊子腸道合成并分泌shiva 3抗菌肽基因，用來控制瘧疾的傳播，取得了一定的成效[15]。

2001年，趙東紅等構(gòu)建了轉(zhuǎn)抗菌肽基因甜菜夜蛾幼蟲，在蟲體內(nèi)檢測到有類CMIV mRNA的存在，并在蟲體血淋巴中檢測到抗菌活性[12]。

2.2 鼠

在國內(nèi)外，鼠類是研究轉(zhuǎn)基因動物最常實驗的動物模型。為了提高整合效率，在外源基因的兩端加上具有隔離作用的MAR序列和微衛(wèi)星序列，與染色體上的微衛(wèi)星序列同源重組，已達到預(yù)期效果?？梢园丫幋a抗菌肽的基因轉(zhuǎn)入到指定的細胞內(nèi)表達。

董銳選用豬源抗菌肽PR39構(gòu)建了表達載體pCMS-EGFP-PR39，經(jīng)原核顯微注射法，制備了8只F0代轉(zhuǎn)PR39基因小鼠，通過人工感染豬胸膜肺炎放線桿菌，比較了轉(zhuǎn)PR39基因小鼠與其同窩的野生型小鼠之間的抑菌能力差異。證明了轉(zhuǎn)基因表達PR39可顯著增強轉(zhuǎn)基因小鼠對細菌的抵抗力[16]。

3 轉(zhuǎn)抗菌肽基因植物

植物轉(zhuǎn)基因的研究方法日趨成熟。抗菌肽被應(yīng)用于培育抗病新品種，如抗菌煙草、水稻抗白葉枯病等。另外，抗菌肽轉(zhuǎn)入植物具有明顯的殺蟲作用。韋鵬飛以轉(zhuǎn)抗菌肽D基因的中華獼猴桃抗性芽為材料，通過誘導(dǎo)生根和移栽獲得獼猴桃盆栽苗。對盆栽苗進行PCR和RT-PCR鑒定表明，抗菌肽D基因已經(jīng)整合到獼猴桃基因組中，并進行了轉(zhuǎn)錄。對盆栽苗葉片中的過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性分析結(jié)果表明，在噴施獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌的條件下，轉(zhuǎn)基因植株的CAT和POD活性比未轉(zhuǎn)基因植株明顯降低，PAL活性比未轉(zhuǎn)基因植株明顯升高[17]。

4 抗菌肽基因改造前景

抗菌肽基因分子量小，其表達產(chǎn)物容易降解，檢測和純化都有一定困難，即使融合蛋白的表達量較高，目的蛋白的表達策略也很準確，但要獲取表達量較高的目的蛋白仍然非常困難。當高拷貝基因串聯(lián)時，基因之間必須首尾同向相連，否則會引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定，同時導(dǎo)致反向基因表達的蛋白錯誤，這將會很大程度上提高串聯(lián)構(gòu)建的難度性。目前，國內(nèi)外學者逐步致力于從分子角度改造抗菌肽并優(yōu)化抗菌肽的表達[18]。諸如氨基酸殘基設(shè)計[19]、肽片段拼接設(shè)計[20]、肽鏈環(huán)合設(shè)計[21]、靶向設(shè)計[22]、多基因共表達[23]等。均獲得了一定的科研成果，為抗菌肽基因工程化改造注入了新鮮活力。隨著科學研究手段和方法的日趨完善，抗菌肽基因改造也勢必迎來廣闊的發(fā)展空間，為提高動植物的抗病力提供強大的科技支撐。

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