異基因造血干細胞移植中GVHD與GVL分離策略

黃 河，劉麗珍

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心，浙江杭州310003)

異基因造血干細胞移植(allo-hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是目前治愈血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有效手段之一，近年來隨著allo-HSCT技術(shù)的的發(fā)展，移植成功率與長期生存率都有了很大的提高，但移植物抗宿主病(GVHD)和移植后腫瘤復(fù)發(fā)是影響患者存活率的主要障礙。移植物抗白血病效應(yīng)(GVL)是allo-HSCT治愈血液系統(tǒng)惡性腫瘤的主要機制。GVHD與GVL效應(yīng)的機制目前尚未完全明確，但兩者均為由供者T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。如供者T細胞廣泛性地作用于受者組織細胞，則發(fā)生GVHD;如供者T細胞只針對異常細胞(白血病細胞或其他腫瘤細胞)則發(fā)揮GVL效應(yīng)。臨床上GVHD與GVL常相伴發(fā)生，但兩者并不完全平行。如何有效控制GVHD的同時充分發(fā)揮 GVL效應(yīng)，提高allo-HSCT患者的生存率，是造血干細胞移植領(lǐng)域的熱點與難點問題。

1 供者淋巴細胞輸注

供者淋巴細胞輸注(donor lymphocyte infusion，DLI)可以消除供者體內(nèi)殘留的白血病細胞，預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)allo-HSCT后復(fù)發(fā)，是移植后增強GVL效應(yīng)的重要治療方法。而GVHD是DLI主要的并發(fā)癥，適宜的輸注時機、輸注量與輸注成分的調(diào)控是避免或減輕GVHD的關(guān)鍵。臨床上采取分次逐級增量DLI方法，與單次大劑量輸注相比，其發(fā)揮GVL作用所需時間延長。一般輸入細胞數(shù)從10/kg數(shù)量級開始，逐級增量至發(fā)揮GVL作用，多在DLI后3～7周起效，6個月以上達分子水平緩解。逐級增量DLI并不影響GVL的效應(yīng)強度，但可明顯減少GVHD的發(fā)生概率。改變輸注成分，如調(diào)節(jié)淋巴細胞中Thl與Th2細胞亞群比例有利于GVHD與GVL的分離。有研究發(fā)現(xiàn)，移植后輸注Th2細胞能誘導(dǎo)劑量依賴GVL效應(yīng)，而不增加嚴(yán)重急性GVHD的發(fā)生。增加移植物中Th2細胞比例，減弱Thl細胞分泌IFN-γ等細胞因子，可以減少GVHD的發(fā)生，同時保留Th2細胞抗原呈遞功能及調(diào)節(jié)細胞毒性T細胞(CTL)的能力，發(fā)揮 GVL 作用。

輸入淋巴細胞的調(diào)控可以通過轉(zhuǎn)入“自殺基因”來實現(xiàn)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)給輸注的供者T細胞預(yù)先轉(zhuǎn)入一段“自殺基因”片段，如單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)，轉(zhuǎn)染的T細胞可被更昔洛韋特異性殺傷，當(dāng)發(fā)生GVHD時應(yīng)用更昔洛韋清除帶HSV-TK基因的T細胞，可緩解疾病的臨床癥狀。一項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，在28例接受HLA半相合移植的患者中，不使用GVHD預(yù)防藥物，于移植后第28天開始輸注供者帶HSV-TK基因的T細胞，結(jié)果僅10例患者發(fā)生急性GVHD，這些患者經(jīng)使用更昔洛韋治療后均獲得緩解。研究者認為，帶HSVTK基因的T細胞輸注在半相合移植中可促進免疫重建，控制 GVHD的發(fā)生。

2 調(diào)節(jié)性T細胞

CD4CD25調(diào)節(jié)性 T細胞(regulatory Tcells，Treg)是CD4T細胞的一個亞群，在維持機體自身免疫耐受，誘導(dǎo)移植耐受等方面發(fā)揮重要作用。Treg細胞分為天然性和誘導(dǎo)性兩大類:前者在胸腺中經(jīng)歷陰性選擇發(fā)育成熟，在外周通過細胞間接觸或分泌細胞因子的方式控制自身免疫反應(yīng)的發(fā)生;后者由外周CD4T細胞受抗原刺激活化產(chǎn)生，主要通過分泌抑制性細胞因子控制免疫應(yīng)答。Treg細胞可能通過以下機制抑制T細胞的活化增殖，進行免疫負調(diào)控:①抑制抗原遞呈細胞(APC)的抗原呈遞功能;②與靶細胞直接接觸抑制;③分泌抑制性細胞因子，如TGF-β、IL-10等;④競爭性抑制靶細胞增殖。Treg免疫標(biāo)志包括表型為CD4CD25Foxp3，同時表達 CTLA-4與 CD45R等。

動物實驗與臨床試驗顯示:Treg細胞可降低GVHD的發(fā)生，而不影響 GVL的效應(yīng)，在allo-HSCT中有一定的應(yīng)用前景。Edinger等在MHC完全不相合的小鼠移植模型研究中發(fā)現(xiàn)，按1∶1回輸供者Treg細胞和供者同種T細胞，Treg可抑制供者效應(yīng)性T細胞的早期擴增和遷移至靶器官的數(shù)量，有效地降低GVHD的發(fā)生率和嚴(yán)重度，但不影響T細胞的活化，而且對T細胞體內(nèi)外GVL效應(yīng)都無顯著影響。Trenado等也發(fā)現(xiàn)，Treg細胞主要抑制 GVHD相關(guān)的效應(yīng)T細胞增殖，但并不影響造血和免疫重建，并可部分保留 GVL效應(yīng)。最近，Dilanni等報道了28例高危血液惡性腫瘤患者行半相合HSCT后，過繼性輸注Treg，未給予任何免疫抑制劑即可有效地預(yù)防GVHD的發(fā)生，促進免疫重建，而且未削弱GVL的效應(yīng)。

天然性Treg細胞只占外周總T細胞的5%～10%，如何獲得足夠數(shù)量的Treg成為過繼性輸注的一大障礙。最近，Hippen等報道了采用雷帕霉素/TGF-β體外大量誘導(dǎo)并擴增Treg細胞的方法，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)擴增的Treg細胞在異基因移植小鼠中發(fā)揮抑制GVHD的作用。此研究為臨床大規(guī)模Treg細胞的應(yīng)用提供了方法。另外，近年研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物如地西他濱、阿扎胞苷、雷帕霉素等可以誘導(dǎo)Fox P3的表達，提高了受者體內(nèi)Treg細胞的比例，從而預(yù)防 GVHD的發(fā)生，實現(xiàn)與 GVL效應(yīng)的分離。

3 NK細胞

自然殺傷細胞(natural killer cells，NK細胞)是淋巴細胞譜系中不同于T、B淋巴細胞的一類大顆粒淋巴細胞，其代表性表型為CD3CD56CD16。NK細胞具有直接殺傷靶細胞的效應(yīng)，無需預(yù)先致敏。NK細胞功能的發(fā)揮主要依賴于其識別靶細胞的受體。NK細胞可同時表達活化型受體(KAR)和抑制受體(KIR)，其殺傷功能取決于表面抑制性受體與活化受體所傳遞信號的綜合。正常情況下，NK細胞KIR識別自身組織表達的MHC-I類分子，產(chǎn)生殺傷抑制信號，阻斷殺傷信號的傳遞，表現(xiàn)為自身組織細胞不被破壞。當(dāng)靶細胞表面MHC-I類分子表達降低、丟失或發(fā)生變異(如細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化、病毒感染等)時，NK細胞活化并啟動殺傷作用，此即NK細胞的丟失自我(missing self)識別模式。

NK細胞是參與GVL效應(yīng)的重要成員。一系列臨床研究顯示:在去T的allo-HSCT中，尤其對于CML及AML、HLA-C/KIR不合的患者復(fù)發(fā)率較低。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)在無關(guān)供者移植患者中，KIR不相合與低復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān)。在髓系患者，KIR不合除了與復(fù)發(fā)的風(fēng)險減少相關(guān)外，還能改善5年生存率。NK細胞在GVL中的作用在動物實驗中已得到證實。目前認為，NK細胞發(fā)揮GVL效應(yīng)的機制是通過“丟失自我”模式實現(xiàn)的。移植后供者的NK細胞KIR受體找不到相應(yīng)的MHC配體，NK細胞活化占優(yōu)勢，對殘存的白血病細胞發(fā)揮殺傷作用。KIR表位不合是引發(fā)GVL的分子基礎(chǔ)，可以作為供者選擇的考慮因素。

抗原遞呈細胞(APC)活化后表達共刺激分子并向T細胞呈遞抗原，進而活化T細胞是GVHD發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，異源反應(yīng)性NK細胞可以攻擊和去除宿主APC，從而阻止GVHD的發(fā)生。雖然殺傷受者APC對GVL效應(yīng)有影響，但異源反應(yīng)活性NK細胞對腫瘤細胞有強大的殺傷功能，故 GVL效應(yīng)被保留。NK細胞在分離GVHD與GVL效應(yīng)中有一定的前景。本研究組發(fā)現(xiàn)，經(jīng)體外培養(yǎng)的人NK細胞能殺傷不成熟的DC細胞。NK細胞對成熟的DC殺傷活性較低，但以抗體封閉KIR抑制性受體KIR2DL1和(或)KIR2DL2/KIR2DL3后，NK細胞對成熟DC的殺傷活性明顯提高。此研究還發(fā)現(xiàn)，封閉人NK細胞抑制性受體后，NK細胞殺傷腫瘤細胞的作用增強。本研究組對小鼠NK細胞抑制性受體的封閉實驗也得出了相似的結(jié)論。NK細胞表面KIR修飾為GVL與GVHD效應(yīng)的分離提供了新思路。

4 樹突狀細胞

樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是功能最強的抗原遞呈細胞，在移植免疫中，DC啟動免疫排斥還是維持免疫耐受取決于它們的起源以及成熟狀態(tài)，成熟DC啟動免疫排斥及GVHD反應(yīng)，未成熟(iDC)及淋巴樣DC誘導(dǎo)免疫耐受。HSCT后供者DC細胞和受體殘存的DC都可直接激活供體T細胞，特別是CD8T細胞的增殖和分化，引起GVHD。因此，通過清除或滅活受體DC，調(diào)控供體DC的分化以及活化狀態(tài)可以預(yù)防GVHD，誘導(dǎo)免疫耐受。近年來研究者發(fā)現(xiàn)，iDC在TGF-β1等誘導(dǎo)下可產(chǎn)生調(diào)節(jié)性DC或稱為耐受型DC，這群DC細胞高表達TGF-β1和 IL-10;同時，其可以減少前炎癥細胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 IL-12p70等的分泌，有利于抑制GVHD的發(fā)生。

供者DC通過交叉啟動同種異基因反應(yīng)性CD8T細胞介導(dǎo)GVL，骨髓移植后用腫瘤細胞裂解物免疫的供者DC作為疫苗，可以促進T細胞的GVL效應(yīng)。盛麗霞等將多藥耐藥基因MDR1轉(zhuǎn)染DC前體細胞K562，并采用細胞因子誘導(dǎo)法將K562/MDR1誘導(dǎo)為攜帶有MDR1基因的 DC細胞。由于MDR1編碼的Pgp蛋白具有免疫原性，MDR-DC可誘導(dǎo)參與針對Pgp的特異性CTL應(yīng)答。此研究為白血病多藥耐藥的免疫治療與allo-HSCT后過繼性輸注增強GVL效應(yīng)提供了新靶點。

5 間充質(zhì)干細胞

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中除造血干細胞以外的一類干細胞，是骨髓基質(zhì)細胞的前體細胞，具有自我更新和多向分化的生物學(xué)特性。MSCs具有獨特的免疫學(xué)特性，它高表達MHC I類分子、CD44和CD90，低表達MHCⅡ類分子及Fas配體，不表達 B7-1、B7-2、CD40、CD40L 和 Fas凋亡受體。研究表明，MSCs具有低免疫源性并發(fā)揮免疫調(diào)控作用。MSCs可通過細胞與細胞直接接觸來抑制T淋巴細胞的增殖。動物實驗已證實，MSCs對GVHD具有預(yù)防和治療作用。多個臨床研究中心已開展 MSCs用于預(yù)防和治療GVHD的Ⅱ期臨床研究。Fang等對6例激素耐藥的GVHD患者輸注半相合供者或無關(guān)供體脂肪來源的MSCs，5例患者GVHD完全緩解，其中4例存活超過40個月。Baron等對20例接受HLA不相合無關(guān)供者減劑量移植的患者，將第三方來源的MSCs與供者外周血造血干細胞共輸注，結(jié)果表明MSCs共輸注能降低GVHD相關(guān)死亡率，且并不減弱GVL效應(yīng)。

6 次要組織相容性抗原

次要組織相容性抗原(minor histocompatibility antigens，mHags)是相對于主要組織相容性抗原而命名的，mHags由非MHC基因編碼，在移植排斥反應(yīng)中的作用較弱。在異基因造血干細胞移植中，供受體之間存在等位基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)。某些SNP致使編碼同源蛋白的氨基酸不同，蛋白經(jīng)加工處理成多肽，與MHC結(jié)合表達于受者抗原遞呈細胞表面，被供者T細胞作為外源物質(zhì)所識別，這些多肽即mHags。mHags具有較強的免疫原性，局限表達于造血細胞起源細胞(如HA-1、HA-2)，或單一造血細胞系的mHags分子(如HB-1)，在體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細胞毒性T細胞，對白血病或淋巴瘤細胞發(fā)揮細胞毒作用，對非造血細胞無細胞毒作用，從而增強GVL效應(yīng)，不增加GVHD風(fēng)險，實現(xiàn) GVL效應(yīng)與 GVHD的分離。利用mHags的特性，臨床應(yīng)用包括:輸注mHags特異性T細胞進行過繼性免疫治療，mHags特異性T細胞受體(TCR)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)以及mHags疫苗的開發(fā)。

7 腫瘤疫苗

腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原可以作為腫瘤疫苗，刺激供者T細胞產(chǎn)生特異性的細胞毒性T淋巴細胞，通過特異性的免疫應(yīng)答殺傷白血病細胞，發(fā)揮GVL作用，而不引起GVHD。目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性抗原有 P21、ras、bcr/abl、PML/RARα;腫瘤相關(guān)性抗原有蛋白酶3和WT-1(wilms瘤基因)。研究表明，白血病細胞高表達WT-1等非多態(tài)性腫瘤相關(guān)抗原。正常供者WT-1特異性CD8細胞毒性T細胞(CTL)比例很低，體外擴增的CTL可溶解人白血病細胞，抑制白血病克隆形成，抑制人白血病細胞植入NOD/SCID小鼠，對正常造血干細胞未見細胞毒作用。Bornhauser等給14例患者預(yù)防性地輸注由CML相關(guān)抗原肽段PR1、WT-1和ABL免疫產(chǎn)生的CTL，隨訪1年沒有發(fā)現(xiàn)GVHD或疾病的復(fù)發(fā)。

另外，細胞因子如白細胞介素、干擾素和腫瘤壞死因子等在GVHD發(fā)病及GVL的作用中也起到很重要的作用。國內(nèi)外其他研究和我們的研究都表明，細胞因子及細胞因子受體基因多態(tài)性同GVHD和/或移植預(yù)后顯著相關(guān)。細胞因子基因多態(tài)性直接影響個體體內(nèi)細胞因子的水平，而移植受者個體間的不同細胞因子水平將影響GVHD的發(fā)生與移植效果。動物研究表明，IL-11、IL-12、IL-18及角質(zhì)細胞生長因子(KGF)能選擇性地抑制T細胞介導(dǎo)的GVHD，同時保留GVL作用。細胞因子如IL-12、KGF等也可能作為GVHD與GVL的分離靶點。

總之，隨著近年來對移植免疫機制研究的深入，GVHD與GVL的分離策略不斷取得了新的進展，目前采取一系列臨床手段進行干預(yù)且取得了一定效果，但更多的手段仍處在體外實驗及在動物模型階段。采取何種方法用于臨床治療能最大程度地減少GVHD的發(fā)生，同時加強GVL效應(yīng)，仍需進一步的研究。

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