奶粉中分離志賀氏菌和沙門氏菌能力驗證結(jié)果分析

王珍++陸雯++王攀峰++吳岳琴++章舒祺

摘 要：為提高實驗室對食品中志賀氏菌和沙門氏菌的檢測能力，減少漏檢或誤檢的機(jī)率，本實驗室參加省級能力驗證活動。按照GB4789《食品微生物學(xué)檢驗》和SN/T1869-2007《食品中多種致病菌快速檢測方法 PCR法》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。結(jié)果H-37、S-37奶粉樣品中分別檢出志賀氏菌、沙門氏菌，H-38及S-38奶粉樣品中未檢出致病菌，與公布的答案一致。通過能力驗證，對關(guān)鍵步驟進(jìn)行分析，積累沙門氏菌和志賀氏菌的檢測經(jīng)驗。

關(guān)鍵詞：能力驗證；志賀氏菌；沙門氏菌；奶粉；PCR

中圖分類號：Q93-3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）12-0241-02

食品是人類賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)，隨著人們生活水平的提高，食品安全問題備受關(guān)注。導(dǎo)致大部分食物中毒事件發(fā)生的主要因素是微生物。志賀氏菌和沙門氏菌是常見病原菌。沙門氏菌作為腸桿菌科中最主要的食源性致病菌，我國每年約有3億人因其患病，占病原菌食源性疾病總致病的70%～80%[1]。人體感染沙門氏菌會導(dǎo)致胃腸炎、傷寒、副傷寒和敗血癥等嚴(yán)重疾病[2]，嚴(yán)重危害人民身體健康。因志賀氏菌是一個古老的菌屬，僅有4個血清群和32個血清型，有些腸道菌株分解糖類僅產(chǎn)微量氣體，加上抗原交叉凝集現(xiàn)象，很容易誤報為志賀氏菌[3，4]。而實驗室人員本身的檢測能力和經(jīng)驗不足是導(dǎo)致在食品微生物常規(guī)檢測中出現(xiàn)漏檢或誤判的可能[4]。為了降低這兩種食源性疾病對民眾健康帶來的隱患，加強(qiáng)實驗室的能力建設(shè)，提高實驗室檢測員的檢測水平，本實驗室參加了2016年省級食品安全檢驗機(jī)構(gòu)能力比對活動，本文就結(jié)合傳統(tǒng)方法與PCR方法，以此次從奶粉中分離志賀氏菌和沙門氏菌的實驗步驟、相關(guān)經(jīng)驗和讀者共同分享，以期為大家以后的以奶粉為基質(zhì)的能力驗證實驗提供參考。

1 檢測項目和要求

樣品4份，檢測參數(shù)為志賀氏菌、沙門氏菌，按國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法進(jìn)行，鑒定方法結(jié)合PCR方法。

2 材料和方法

2.1 待測樣品

盲樣4瓶，以脫脂奶粉為基質(zhì)，添加目標(biāo)菌制作而成的固體粉末。每瓶35g，樣品編號分別為奶粉樣品H-37、H-38和S-37、S-38，其中樣品H-37、H-38檢測參數(shù)為志賀氏菌，樣品S-37、S-38檢測參數(shù)為沙門氏菌。

2.2 材料與試劑

培養(yǎng)基及試劑：志賀氏菌增菌肉湯、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（XLD）、麥康凱（MAC）瓊脂、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、沙門顯色培養(yǎng)基、三糖鐵（TSI）瓊脂、志賀氏菌和沙門氏菌鑒定生化試劑等，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，沙門氏菌A-F多價O血清、四價志賀氏菌血清，購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司，廣譜DNA提取試劑盒（TAKARA）、PCR反應(yīng)試劑（TAKARA），購自寶生物工程有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)菌株：福氏志賀氏菌（編號CMCC（B）51572）、鼠傷寒沙門氏菌（編號CMCC（B）50115），購自南京便診生物技術(shù)有限公司。

儀器設(shè)備：生物安全柜HFSafe-1500LC、生化培養(yǎng)箱LRH-250F、核酸蛋白定量分析儀Nano-100、PCR儀T100、凝膠成像儀JS-680D。

2.3 操作步驟

2.3.1 樣品前處理

分別從4瓶盲樣中稱取25g至無菌均質(zhì)袋內(nèi)并標(biāo)記H-37、H-38和S-37、S-38。

2.3.2 增菌

增菌操作分別按照GB 4789.5-2012《志賀氏菌檢驗》[5]及GB 4789.4-2012《沙門氏菌檢驗》[6]進(jìn)行。

2.3.3 分離劃線

用接種環(huán)取H-37、H-38增菌液各1環(huán)，劃線接種于XLD、MAC瓊脂、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板，36℃培養(yǎng)24-48h。取S-37、S-38增菌液各1環(huán)，劃線接種于BS、XLD和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板，36℃培養(yǎng)24-48h。

2.3.4 生化鑒定

分別挑取可疑志賀氏菌菌落和可疑沙門氏菌菌落轉(zhuǎn)接TSI和營養(yǎng)瓊脂斜面進(jìn)行純化培養(yǎng)，挑取單菌落分別接種于一系列志賀氏菌生化試劑管及沙門氏菌生化試劑管內(nèi)，依照生化試劑說明培養(yǎng)。

2.3.5 血清凝集

挑取生化鑒定典型的菌落，分別進(jìn)行志賀氏菌和沙門氏菌血清凝集試驗。步驟同GB4789《食品微生物學(xué)檢驗》[5，6]。

2.3.6 PCR試驗

（1）DNA的提取。取增菌液1mL，用廣譜DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，操作步驟參考試劑盒內(nèi)說明書。（2）PCR引物的設(shè)計。分別根據(jù)沙門氏菌靶基因invA、志賀氏菌靶基因ipaH設(shè)計特異性引物[7]，由上海生工合成，沙門氏菌引物序列：5-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3，5-TCATCGCACCGTCAAA GGAACC-3，擴(kuò)增片段長度284 bp，質(zhì)賀氏菌引物序列：5-GTTCCTTGACCGCCTCGATACCGTC-3，5-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3，擴(kuò)增片段長度629 bp。（3）PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系為20μL，10xBuffer：2μL，dNTPs：1.6μL，正向引物：0.6μL，反向引物：0.6μL，Taq-酶：1μL，ddH2O 12.2μL，模板DNA：2μL。沙門氏菌、志賀氏菌退火溫度分別為64℃、65℃，35個循環(huán)。

3 結(jié)果與分析

3.1 增菌分離結(jié)果

結(jié)果分別見表1、表2和表3。

3.2 生化鑒定

生化試驗結(jié)果分別見表4和表5，根據(jù)生化試驗初步判定S-37為沙門氏菌屬，H-37為可疑的志賀氏菌屬。

3.3 血清試驗

血清凝集反應(yīng)，H-37被志賀4價血清凝集，S-37被沙門A-F多價O血清凝集且生理鹽水對照均未出現(xiàn)自凝現(xiàn)象，進(jìn)一步判定S-37為沙門氏菌，H-37為志賀氏菌。

3.4 PCR結(jié)果

PCR結(jié)果見圖1，其中S-37與H-37可見陽性條帶，S-38與H-38未見條帶，說明S-37與H-37分別為沙門氏菌可疑陽性，志賀氏菌可疑陽性，而S-38與H-38均未檢出。

M：DL1000Marker；1-2：沙門氏菌S-37；3-4：沙門氏菌S-38；5-6：沙門氏菌陽性對照；7，14：沙門氏菌陰性對照和志賀氏菌陽性對照；8-9：志賀氏菌H-37、10-11：志賀氏菌H-38；12-13：志賀氏菌陽性對照。

4 結(jié)論

經(jīng)生化、血清及PCR試驗，判定樣品H-37、S-37分別檢出志賀氏菌、沙門氏菌；樣品H-38、S-38未檢出。與所公布的答案相符。

5 討論

（1）樣品收到后應(yīng)檢查密封狀況，檢驗須及時，若不能立即檢測，按說明書放置在2-8℃冷藏。非定量型的樣品，建議留樣。（2）嚴(yán)格控制增菌時間，并注意現(xiàn)象觀察。若增菌時間過短，目標(biāo)菌生長繁殖較少，一旦干擾菌占優(yōu)勢，在選擇性平板上的目標(biāo)菌將被覆蓋導(dǎo)致漏檢，同時應(yīng)避免增菌時間過長雜菌增多造成干擾。（3）在MAC平板上，志賀氏菌菌落直徑是辨別的關(guān)鍵，可借助量尺輔助確認(rèn)。培養(yǎng)基同時用不同廠家的有助于典型菌落的識別[8]。（4）因志賀氏菌屬與埃希氏菌屬的O抗原關(guān)系非常密切，可能存在血清交叉凝集現(xiàn)象，因此，必須根據(jù)生化反應(yīng)并結(jié)合血清結(jié)果作出判定[9]。（5）PCR試驗應(yīng)分區(qū)或分室進(jìn)行，避免交叉污染和氣溶膠污染。

參考文獻(xiàn)

[1]Organization W H. Overcoming antimicrobial resistance.[J]. American Heart Journal，2000， 26（12）：283.

[2]王毳，閆磊，曾慶祝.沙門氏菌的檢測技術(shù)與方法[J].現(xiàn)代食品科技，2007，23（5）：82-85.

[3]唐建民，何曉硯，趙重生.如何正確鑒定志賀氏菌屬[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，1993（6）：372-373.

[4]潘躍順，趙克義，李景學(xué).志賀氏菌實驗室檢測的漏檢和誤診因素分析[J].中國公共衛(wèi)生，2001，17（6）：569-571.

[5]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.5-2012食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 志賀氏菌檢驗[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[6]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.4-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[7]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 1869-2007食品中多種致病菌快速檢測方法PCR法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[8]劉繼倩，宋馳萍，駱玲飛，等.兩種培養(yǎng)基在健康人群中沙門菌檢測的比較[J].中國實用醫(yī)藥，2011，06（31）：275-276.

[9]劉蔚，趙樹紅，楊淑其，等.正確鑒定志賀氏菌屬[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，1999（1）.