丹參愈傷組織快速生長(zhǎng)培養(yǎng)方法

劉慧敏+劉艷軍+黃俊軒+楊靜慧+李建科+嚴(yán)小峰+武春霞

摘 要：為了建立丹參愈傷組織快速生長(zhǎng)培養(yǎng)體系，采用丹參綠色、松散愈傷組織為外植體，通過(guò)不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)溫度和不同繼代時(shí)愈傷組織塊的大小等條件的改變，找到生長(zhǎng)最快、結(jié)構(gòu)、質(zhì)地良好的丹參愈傷組織培養(yǎng)條件。結(jié)果顯示，在MS+0.5 mg·L-1BA+1 mg·L-12，4-D+100 mg·L-1Vc的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為22 ℃，接種外植體直徑大小為0.5 cm時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)速度最快，愈傷組織質(zhì)量最好。本試驗(yàn)結(jié)果為丹參生物制藥研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：丹參；愈傷組織；繼代培養(yǎng)；生物制藥

中圖分類號(hào)：S576.5+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.07.004

Study on Rapid Growth Method of Salvia miltiorrhiza Callus

LIU Huimin， LIU Yanjun， HUANG Junxuan， YANG Jinghui， LI Jianke， YAN Xiaofeng， WU Chunxia

（College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract： In order to establish the rapid growth system of Salvia miltiorrhiza callus， the green and loose callus of Salvia miltiorrhiza were used as explants. The culture conditions in which rapid growth and loose callus of Salvia miltiorrhiza could be induced were found through different media， different culture temperature and the size of callus tubers. The results showed that on MS+0.5 mg·L-1BA+1 mg·L-12，4-D+100 mg·L-1Vc medium， when the culture temperature was 22 ℃， the callus growth was the fastest， and the callus quality was best. The results laid the foundation for the study of Salvia miltiorrhiza biological pharmaceutical.

Key words： Salvia miltiorrhiza； callus； subculture； biological pharmaceutical

通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行藥物成分的生產(chǎn)是一種重要的生物制藥途徑[1-2]。其中利用愈傷組織進(jìn)行藥物有效成分的生產(chǎn)是一種最為普遍的技術(shù)手段，目前，已經(jīng)在多種植物上獲得了成功。由于丹參藥用價(jià)值高、市場(chǎng)需求量大但栽培技術(shù)落后，所以丹參的組織培養(yǎng)技術(shù)受到很大重視。利用丹參愈傷組織擴(kuò)繁、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及毛狀根培養(yǎng)等技術(shù)進(jìn)行有效成分的生產(chǎn)已經(jīng)取得顯著的研究成果[3-7]。

采用愈傷組織為培養(yǎng)材料進(jìn)行藥物有效成分生產(chǎn)技術(shù)關(guān)鍵，一是愈傷組織中有效成分的含量，二是愈傷組織的生長(zhǎng)速度。前者主要取決于愈傷組織遺傳特性，而后者主要取決于培養(yǎng)條件。好的培養(yǎng)條件是利用組培技術(shù)進(jìn)行生物制藥成功的關(guān)鍵。本研究以丹參愈傷組織為試材，采用不同的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)方式，尋找其愈傷組織快速生長(zhǎng)的最佳條件，以為丹參等中藥植物的生物制藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)中所用的松散型丹參愈傷組織由天津農(nóng)學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 丹參愈傷組織的準(zhǔn)備 取丹參愈傷組織在超凈臺(tái)中用解剖刀切成直徑0.5 cm大小的小塊，將其接種到事先配制好的MS+0.5 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)大約30 d的培養(yǎng)，愈傷組織長(zhǎng)到原來(lái)接種外植體大小的3倍左右。將愈傷組織繼續(xù)切成小塊備用。

1.2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)丹參愈傷組織生長(zhǎng)速度的影響 將步驟1.2.1中獲得的丹參愈傷組織在超凈臺(tái)中用解剖刀切成直徑0.5 cm的小塊，將其接種到事先配制好的培養(yǎng)基中。這些培養(yǎng)基分別含有不同種類和濃度的植物激素，同時(shí)通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基中蔗糖的用量來(lái)改變其滲透壓。在培養(yǎng)基中加入7 g·L-1瓊脂粉作為凝固劑，在121 ℃下滅菌20 min，所有容器均為100 mL三角瓶，每個(gè)三角瓶中加入30 mL培養(yǎng)基。為了防止丹參愈傷組織出現(xiàn)褐變，在其中加入100 mg·L-1的Vc作為還原劑。每個(gè)處理做5個(gè)三角瓶重復(fù)，每瓶加入外植體10塊。接種后將三角瓶放到培養(yǎng)室中進(jìn)行愈傷組織的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25 ℃，24 h連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為2 000 lx。經(jīng)過(guò)大約30 d的培養(yǎng)，對(duì)三角瓶中丹參愈傷組織的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，尋找最佳的培養(yǎng)基組合。

1.2.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)丹參愈傷組織生長(zhǎng)速度的影響 將步驟1.2.1中獲得的丹參愈傷組織切成步驟1.2.2中的大小，采用上一步驟中篩選出的生長(zhǎng)效果最好的培養(yǎng)基進(jìn)行接種。采用相同的操作，培養(yǎng)條件都相同，只是設(shè)置不同的培養(yǎng)溫度。設(shè)置20，22，24，26，28 ℃共5種不同培養(yǎng)溫度。將接種好的三角瓶放置到上述培養(yǎng)溫度下。經(jīng)過(guò)大約30 d的培養(yǎng)，對(duì)三角瓶中丹參愈傷組織的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，從中找到最佳的培養(yǎng)溫度。

1.2.4 不同繼代時(shí)愈傷組織塊的大小對(duì)丹參愈傷組織生長(zhǎng)速度的影響 再次重復(fù)以上試驗(yàn)步驟，將愈傷組織切成直徑不等的小塊，大致分為0.2，0.5，1.0 cm左右3種大小的小塊，將其接種到事先配制好的培養(yǎng)基上，在步驟1.2.3中篩選出的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)大約30 d的培養(yǎng)后，對(duì)三角瓶中丹參愈傷組織的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，并從中找到最佳的外植體大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)丹參愈傷組織生長(zhǎng)速度的影響

經(jīng)過(guò)30 d培養(yǎng)后，在不同培養(yǎng)基上愈傷組織出現(xiàn)差異顯著的變化，具體情況見(jiàn)表1。

從表1可以看出，在不同培養(yǎng)基上，丹參愈傷組織的生長(zhǎng)情況各不相同。首先，從增長(zhǎng)速度上看，在較高的2，4-D作用下愈傷組織生長(zhǎng)速度明顯增大，表中數(shù)據(jù)為平均估算值，因?yàn)闇y(cè)量存在較大的誤差，但總的來(lái)看還是差異較大。比較BA使用濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響可以看出，使用0.5 mg·L-1的效果要好于1.0 mg·L-1，這說(shuō)明，BA不利于愈傷組織快速增長(zhǎng)。其次，從愈傷組織結(jié)構(gòu)與顏色變化來(lái)看，2，4-D濃度較大時(shí)，愈傷組織容易變得松軟，顏色也變淺，這說(shuō)明是愈傷組織細(xì)胞增大造成的結(jié)果；相反，高濃度BA會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的分裂，細(xì)胞密度增大，愈傷組織質(zhì)地相應(yīng)變得緊密，顏色也變得較深。此外，本試驗(yàn)還考慮改變滲透壓，但其對(duì)生長(zhǎng)素影響不大，只是會(huì)使得愈傷組織質(zhì)地變軟。在較高的BA/2，4-D的處理中出現(xiàn)少數(shù)愈傷組織死亡或停止生長(zhǎng)的現(xiàn)象，這說(shuō)明BA對(duì)愈傷組織有一定的毒害作用，應(yīng)適當(dāng)降低其使用濃度。綜上所述，理想的丹參愈傷組織快速生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方是：MS+0.5 mg·L-1BA+1 mg·L-12，4-D+100 mg·L-1Vc+30 g·L-1蔗糖。

2.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)丹參愈傷組織生長(zhǎng)速度的影響

丹參愈傷組織在不同溫度下生長(zhǎng)情況不同，接種初期變化不大，但在培養(yǎng)30 d后出現(xiàn)明顯的不同，有的停止生長(zhǎng)，有的增長(zhǎng)顯著，具體情況見(jiàn)表2。

從表2可以看出，不同溫度對(duì)丹參愈傷組織生長(zhǎng)影響較大。首先，在較低溫度下，丹參愈傷組織生長(zhǎng)速度較快，這與一般植物不同，一般植物在25 ℃以下生長(zhǎng)緩慢，最適溫度為28 ℃左右。而丹參在22 ℃生長(zhǎng)速度最快，這說(shuō)明其適合低溫培養(yǎng)。另外，從愈傷組織的特性變化來(lái)看，在低溫條件下基本不變，而且也沒(méi)有出現(xiàn)死亡的愈傷組織，這對(duì)于快速培養(yǎng)愈傷組織十分有利。其次，隨著溫度的提高，丹參愈傷組織生長(zhǎng)速度降低，從愈傷組織的顏色和質(zhì)地變化可以分析出其中的原因。在較高的培養(yǎng)條件下，愈傷組織出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，因此，愈傷組織生長(zhǎng)速度下降，顏色變成深綠色，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。這些都說(shuō)明丹參愈傷組織不適應(yīng)高溫生長(zhǎng)。綜上所述，丹參愈傷組織快速培養(yǎng)的最佳溫度條件為22 ℃。

2.3 不同繼代時(shí)愈傷組織塊的大小對(duì)丹參愈傷組織生長(zhǎng)速度的影響

經(jīng)過(guò)30 d的培養(yǎng)，每種處理的結(jié)果都不相同，具體情況見(jiàn)表3。

從表3可以看出，接種時(shí)外植體的大小對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)速度與質(zhì)量都產(chǎn)生較大的影響。首先，在外植體大小為0.2 cm時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)速度較慢，而且愈傷組織質(zhì)地變硬，并且出現(xiàn)較高的死亡率，這些說(shuō)明較小的外植體在初步接種到培養(yǎng)基上短時(shí)間內(nèi)不適應(yīng)新的環(huán)境而生長(zhǎng)受到抑制。因此，過(guò)于小的外植體并不能獲得理想的生長(zhǎng)速度。其次，在采用較大外植體時(shí)，由于外植體生長(zhǎng)空間的限制，在外植體的邊緣愈傷組織較為活躍，但從整體的愈傷組織生長(zhǎng)速度來(lái)看卻明顯下降，與0.5 cm的相比，生長(zhǎng)速度下降近一倍。因此，適宜的外植體大小對(duì)于愈傷組織生長(zhǎng)影響較大。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，理想的丹參愈傷組織接種大小應(yīng)為0.5 cm，這時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)速度最快，愈傷組織質(zhì)量不變。

3 結(jié) 論

本研究以丹參愈傷組織為外植體，討論了培養(yǎng)溫度、激素種類和外植體大小對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)速度的影響，總結(jié)出了以下一套培養(yǎng)方法：取提前誘導(dǎo)好的松散型丹參愈傷組織在超凈臺(tái)中用解剖刀切成直徑0.5 cm大小的小塊，將其接種到事先配制好的MS+0.5 mg·L-1BA+1.0 mg·L-12，4-D+100 mg·L-1Vc +30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為22 ℃，24 h連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為2 000 lx。本試驗(yàn)結(jié)果可以為丹參等中藥植物的生物制藥提供參考。

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