生物的界間RNA干擾

傳 植/編譯

生物的界間RNA干擾

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●植物和菌類能利用保守的RNA干擾機(jī)制來互相調(diào)節(jié)基因表達(dá)，科學(xué)家認(rèn)為可以利用這一現(xiàn)象創(chuàng)造出新一代的殺蟲劑。

我們聽不到植物的任何聲音，但植物卻保持著與周圍環(huán)境的持續(xù)交流。在科學(xué)家研發(fā)出越來越靈敏的工具后，我們得以一窺這一現(xiàn)象的分子機(jī)制?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)一株植物不僅僅在細(xì)胞間、在植株與周圍環(huán)境間存在著交流，還能在不同的植株間，甚至有時(shí)能在不同的種與界間相互交流。實(shí)現(xiàn)交流的“語言”就是 A、C、G 和 U。

我們知道，非編碼RNA在細(xì)胞中被用于控制基因表達(dá)。科學(xué)家反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明了蛋白質(zhì)產(chǎn)物不僅僅會被同種個(gè)體產(chǎn)生的RNA影響，還會被其他不同組織中的RNA影響。近幾年，研究者利用這一現(xiàn)象，通過遠(yuǎn)緣相關(guān)分類群間RNA的傳遞，選擇性地抑制了菌類生長的必要基因的表達(dá)。據(jù)稱，這一方法有助于抗病作物的發(fā)展?？茖W(xué)家在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這一跨界RNA轉(zhuǎn)移是雙向的：菌類也在向它們的植物宿主發(fā)送RNA“指令”，而這一“秘密行動”有助于菌類的入侵。

植物與菌類間交流的機(jī)制，依靠的是古老而歷經(jīng)進(jìn)化考驗(yàn)的基因表達(dá)調(diào)控方法：RNA干擾（RNAi）?！榜雎牎敝参锱c它的病原體間的RNA“對話”可以揭示未知的植物生物學(xué)知識，并制定出抵御作物病原體的新策略?？茖W(xué)家認(rèn)為他們對RNAi的應(yīng)用會先于詳盡了解跨界RNAi的機(jī)制與發(fā)生頻率。

植物保護(hù)

RNAi是在常規(guī)細(xì)胞進(jìn)程或?qū)ν鈦砬秩胝撸ㄌ貏e是病毒）產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞生長中一個(gè)相對保守的機(jī)制。細(xì)胞生產(chǎn)出小RNA分子，接著這些小RNA分子融合進(jìn)被稱作RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的蛋白質(zhì)中，這一蛋白質(zhì)的靶點(diǎn)是包含了小RNA分子互補(bǔ)序列的信使RNA分子（mRNAs）。接著，RISC對綁定好的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行切割，由此降低了基因表達(dá)。

過去10年中，科學(xué)家用實(shí)驗(yàn)證明了RNAi能幫助許多植物抵抗非病毒病原體。例如2007年，孟山都公司給作物加上一種RNA的基因，它以昆蟲一個(gè)必需基因的轉(zhuǎn)錄本為靶點(diǎn)，由此賦予了作物抵御西部玉米根蟲的能力。這種轉(zhuǎn)基因作物受到的蟲害更少，想必是昆蟲因?yàn)閿z入了干擾RNA而死亡。同時(shí)，研究小組發(fā)現(xiàn)這一被稱作宿主誘導(dǎo)的基因沉默（HIGS）的方法也能抵御寄生蟲。至今，有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)驗(yàn)仍在不斷發(fā)現(xiàn)對加工改造過的RNAi易感的寄生動物。

近幾年來，遺傳工程師成功地利用了HIGS同致病菌株的抗?fàn)帯?010年，德國萊布尼茨植物遺傳與作物研究所發(fā)現(xiàn)白粉病菌在用基因工程向宿主植物導(dǎo)入小RNA分子后，就易受到小RNA分子所致的RNA干擾影響。幾年后，德國吉森尤斯圖斯-李比希大學(xué)的卡爾-海因茨·科戈?duì)枺↘arl-Heinz Kogel）小組實(shí)驗(yàn)證實(shí)了用HIGS抵抗菌類對植物植株是可行的。他的團(tuán)隊(duì)用基因技術(shù)改造了擬南芥和大麥植株，產(chǎn)生小RNA分子來抑制致枯萎的真菌禾谷鐮刀菌中特定基因的表達(dá)（常規(guī)殺真菌劑就是以這些真菌基因表達(dá)所產(chǎn)生的蛋白為目標(biāo)的）。“我們沒有用化學(xué)物質(zhì)去直接對付這種蛋白，我們用的是小RNA分子，而目標(biāo)是基因，”科戈?duì)栒f，“結(jié)果證明這種做法是相當(dāng)高效的?！?/p>

在調(diào)整這一技術(shù)的過程中，許多研究小組都發(fā)現(xiàn)HIGS可以保護(hù)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的植物，使它們免受包括馬鈴薯晚疫病、霜霉?。梢愿腥救n苣）、谷物銹病和小麥葉銹病在內(nèi)的一些真菌疾病的侵害。所有這些實(shí)驗(yàn)依據(jù)在植物與害蟲中都能自然發(fā)生的RNAi機(jī)制，并使用了RISC和一些能將前體加工為小RNA分子的蛋白。加州大學(xué)河濱分校研究植物免疫的金海玲表示，HIGS在實(shí)驗(yàn)室中獲得的成功展現(xiàn)了這一技術(shù)作為高效殺真菌劑的光明前景：“這些RNA可以被

特別地設(shè)計(jì)成以某一病原體為靶點(diǎn)。而且這一設(shè)計(jì)相對簡單，我們有能力一次以多個(gè)病原體為目標(biāo)。”

研究者已經(jīng)完成了野外實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了經(jīng)基因工程改造的植物能有效地傳遞干擾RNA來擊退真菌病原體。2015年，中國的一個(gè)團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種轉(zhuǎn)基因小麥，它可以產(chǎn)生以鐮孢屬枯萎?。‵HB）和鐮刀菌枯萎病兩種真菌病原體中必需基因?yàn)槟繕?biāo)的RNA。在武漢種植的這一轉(zhuǎn)基因植物能有效抗病。（作者在研究報(bào)告中提及：這一地區(qū)是中國鐮孢屬枯萎病疫情最為嚴(yán)重的地區(qū)之一。）

“這一領(lǐng)域是我們必須要關(guān)注的，”孟山都全球病害治理主管約翰·皮特金（John Pitkin）表示，“在轉(zhuǎn)基因植物的基因表達(dá)中，我們發(fā)現(xiàn)了植物與菌類間的RNA轉(zhuǎn)移。但這一現(xiàn)象能否具有商業(yè)功效尚無定論?！?/p>

利用RNAi來保護(hù)作物

基因工程實(shí)現(xiàn)的RNA干擾對抗真核病原體應(yīng)用正進(jìn)行野外實(shí)驗(yàn)，這一方法又被稱作宿主誘導(dǎo)的基因沉默（HIGS），它剛剛在其商業(yè)化的道路上啟程。即使HIGS被證明在抵御致病昆蟲或真菌病原體上有效，如今它的成本相對于其運(yùn)用價(jià)值而言仍過于高昂，這無疑是一個(gè)難以逾越的障礙。約翰·皮特金表示，一種轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化會花費(fèi)大約1.3億到1.4億美元。他還補(bǔ)充道：“僅僅找到一個(gè)適用HIGS的病害就是一個(gè)艱巨的任務(wù)?！睋Q言之，我們并不清楚一種病害帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)與用RNAi抵抗這一病害的轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化所使用的巨額消耗孰多孰少。

在德國吉森尤斯圖斯-李比希大學(xué)研究HIGS的植物生物學(xué)家科戈?duì)栠€提到了公眾（尤其在歐洲）對轉(zhuǎn)基因作物的不安。為了實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因的操控，他和他的同事測試了RNA噴霧是否可行。RNA噴霧將RNA干擾分子直接噴灑給作物，而非將小RNA分子通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入作物內(nèi)部，這一方法被稱作噴霧誘導(dǎo)的基因沉默（SIGS）。幾個(gè)月前，科戈?duì)柕膱F(tuán)隊(duì)報(bào)告稱他們在實(shí)驗(yàn)中向大麥噴灑了一種長鏈的非編碼雙鏈RNA（它是RNAi中使用的小RNA分子的前體），靶定了他曾在2013年使用HIGS靶定并攻擊的相同基因（該基因?qū)坦如牭毒碌拇婊盥手陵P(guān)重要）。實(shí)驗(yàn)證明SIGS起了作用，這些大麥被感染的機(jī)率大大減少。

有趣的是，研究員發(fā)現(xiàn)RNA被植株吸收，同時(shí)還進(jìn)入了真菌內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了RNA同樣可以直接進(jìn)入病原體?？聘?duì)栒f：“真菌在吸收了RNA后被殺滅，同時(shí)，植株也吸收了RNA，接著從植株內(nèi)部轉(zhuǎn)移再次進(jìn)入了真菌體內(nèi)?！彼€補(bǔ)充說，直接由真菌吸收的RNA殺滅真菌的效率其實(shí)并不高，因此，應(yīng)該是由植株吸收RNA并轉(zhuǎn)入真菌的機(jī)制保證了RNA噴霧的滅真菌效果。

實(shí)驗(yàn)室有關(guān)植物及其真菌類病原體的研究表明兩者都可以使RNA進(jìn)出對方的細(xì)胞。植物似乎是使用這些RNA分子來抵抗感染，而真菌類微生物依靠RNA分子來增強(qiáng)它們的傳播能力。兩者有相同的分子機(jī)制，用RNAi破壞對方的信使RNA，干擾基因表達(dá)，以達(dá)成它們的目標(biāo)

跨界RNAi

盡管生物技術(shù)前沿發(fā)展迅速，科學(xué)家們?nèi)匀徊荒艽_定在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中可以實(shí)現(xiàn)的現(xiàn)象能否在自然界中被重復(fù)。雖然植物細(xì)胞用RNAi對抗病毒病原體這一現(xiàn)象已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)多年，但人們?nèi)匀徊磺宄巴庵参锸欠衲芾肦NA“雇傭軍”來抵抗真菌和其他入侵的真核病原體。

幾個(gè)月前，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了也許是與此有關(guān)的第一個(gè)證據(jù)，植物與真菌間的小RNA分子轉(zhuǎn)移確實(shí)可以在沒有基因工程的干預(yù)下發(fā)生。中國科學(xué)院植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室郭惠珊發(fā)現(xiàn)，當(dāng)棉花感染了黃萎病菌這一真菌病原體后，植株體內(nèi)特定的小RNA分子數(shù)量會陡然上升。這些產(chǎn)生的RNA抑制了病原體的兩個(gè)必需基因的表達(dá)，但卻促進(jìn)了真菌基因的變異，使它對RNAi的抵抗力更強(qiáng)，毒性也因而更強(qiáng)。“我們在研究中得到了第一個(gè)直接證據(jù)，證明了RNA分子能從植物‘流動’到真菌細(xì)胞，使真菌細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)基因沉默。”郭惠珊在寄給《科學(xué)家》雜志的郵件中寫到。

盡管作為唯一證據(jù)的郭惠珊的研究表明植物用RNAi來抵御田間的病害，植物生物學(xué)家依舊懷疑這是否是一種廣泛存在的防御機(jī)制。“假設(shè)存在這樣一種機(jī)制，宿主可以向寄生的病原體轉(zhuǎn)移RNA，那么大自然必然會利用它去殺死病原體?！甭槭〈髮W(xué)醫(yī)學(xué)院研究RNAi的菲利普·塞默（Phillip Zamore）說，“自然總是擇優(yōu)做出它的選擇。”

“就算在實(shí)驗(yàn)室之外，菌類與植物間也存在小RNA分子轉(zhuǎn)移，我也不會驚訝?！逼ぬ亟鹫f，“它們在這場戰(zhàn)爭中都不擇手段?！?/p>

害蟲的策略

在加州大學(xué)河濱分校，研究小RNA分子與植物防御機(jī)制十多年的金海玲在得知RNAi機(jī)制存在于真核生物間后，決定換一個(gè)角度看這一問題：作為攻擊植物一環(huán)的植物病蟲害，是否也造出了小RNA分子來靶定宿主的基因呢？

對于許多農(nóng)民而言，灰霉菌無疑是他們的克星。染上了它，植株就會被一層絨毛覆蓋，接著植株的葉、莖、花和果實(shí)就會腐爛。金海玲小組讓擬南芥和番茄植株感染上灰霉菌后，檢測了植株葉片細(xì)胞中得到表達(dá)的RNA?！拔覀儼l(fā)現(xiàn)：在感染后，灰霉菌的很多小RNA分子數(shù)量大大增加，”金海玲說，“一個(gè)振奮人心的假說是，這些小RNA分子有潛能靶定宿主的基因?！?/p>

為了找出真相，她與一位生物信息學(xué)家合作，希望可以預(yù)測出灰霉菌RNA靶定的宿主基因。她設(shè)置了很高的門檻，那些小RNA分子既要符合擬南芥基因，又要符合番茄基因。金海玲表示：“即使這樣，我們?nèi)匀话l(fā)現(xiàn)了約70種可能的灰霉菌小RNA分子，它們都可以靶定擬南芥和番茄基因?！?/p>

為了弄清這些小RNA分子是否有功能意義，金海玲和她的同事們從大量的真菌RNA中選取了3種，并在擬南芥植株中進(jìn)行表達(dá)。隨后他們發(fā)現(xiàn)不僅僅植株的目標(biāo)基因表達(dá)被抑制了，植株也變得更易感了。這證明了真菌通過轉(zhuǎn)移小RNA分子來降低宿主的免疫能力。金海玲說：“這第一次用事實(shí)展現(xiàn)了跨界RNAi在真菌病原體中被用作致病手段?！?/p>

科戈?duì)柋硎荆骸敖鸷Ａ岬陌l(fā)現(xiàn)是出乎人意料的……這些在真菌中的小RNA分子與植物中mRNA的基因結(jié)構(gòu)非常相似，它們通過降解破壞植株的RNA來阻止植株基因的表達(dá)?！笨聘?duì)栠€提到：“只是真菌如何將它的RNA送入植株對我們來說還是個(gè)謎，它如同是一只‘黑盒’，我們難以理解它的內(nèi)部機(jī)制。”

最近，金海玲還扭轉(zhuǎn)了整個(gè)跨界RNAi理論，她利用基因抑制機(jī)制來“以其人之道還治其人之身”。她的團(tuán)隊(duì)將擬南芥和番茄植株進(jìn)行了基因編輯，讓它們產(chǎn)生一種RNA，能使 DCL1蛋白（Dicer-like protein 1）這一關(guān)鍵RNA加工酶沉默，由此來消除灰霉菌的RNAi機(jī)制。由于真菌在向植物傳送RNA之前必須用DCL1蛋白來修剪它的RNA，這一過程就如同是宿主植株向真菌的“炸彈工廠”中扔了一枚點(diǎn)燃的“炸彈”。實(shí)驗(yàn)證明這一做法行得通，真菌在轉(zhuǎn)基因的宿主植株上生長得并不好。

“販運(yùn)貨物”機(jī)制

跨類RNAi并不僅限于寄生物相關(guān)聯(lián)的植物和組織，這一現(xiàn)象還發(fā)生在各種各樣的生物組織間，甚至包括人類。例如在2012年，科研人員報(bào)道稱人類血細(xì)胞產(chǎn)生的小分子RNA會被傳送進(jìn)入惡性瘧原蟲，并靶定一個(gè)目標(biāo)片段，以此抑制基因表達(dá)。

同樣地，線蟲類寄生蟲也能將RNA傳送入它們的哺乳類宿主。幾年前，愛丁堡大學(xué)研究RNA的艾米·巴克（Amy Buck）及她的同事們發(fā)現(xiàn)多形螺旋線蟲（一種寄生在小鼠腸道中的蠕蟲）的分泌物中包含能抑制小鼠的特定基因表達(dá)的小分子RNA，還包含Argonaute蛋白（切割mRNA的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的一種），充分表現(xiàn)了這一分泌物的作用正是干擾接受者的基因表達(dá)。

巴克的研究結(jié)果顯示了胞外囊泡可以實(shí)現(xiàn)組織間的RNAi轉(zhuǎn)移?！斑@些囊泡功能性很高，能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞，”巴克說，“我認(rèn)為囊泡在細(xì)胞間，甚至組織間運(yùn)送貨物的現(xiàn)象無所不在，而且自遠(yuǎn)古以來就存在，只是我們一直沒有注意到它。”金海玲認(rèn)為植物和真菌間發(fā)生的現(xiàn)象也是如此。

巴克表示，外來物RNA轉(zhuǎn)移中RNA分子的濃度是否足夠高，能夠引發(fā)對宿主的影響依然是個(gè)問題。一個(gè)組織可以產(chǎn)生小分子RNA，并將它們運(yùn)送去另外一個(gè)組織來產(chǎn)生干擾現(xiàn)象，但是這并不代表就能對接受RNA的組織產(chǎn)生足夠的影響?！胺肿訑?shù)目必須要足夠大才能產(chǎn)生作用，”塞默說，“至少每一個(gè)目標(biāo)mRNA都要有相對應(yīng)的干擾它的RNA。在這一點(diǎn)上，熱力學(xué)定律是不可動搖的?！?/p>

其他吸收RNA的機(jī)制也各自起著作用。幾個(gè)月前，金海玲小組發(fā)表證據(jù)，證明了灰霉菌能從環(huán)境中吸收小分子RNA和較長的雙鏈RNA（這些正是灰霉菌生長的起點(diǎn)）。同樣地，科戈?duì)栆舶l(fā)現(xiàn)了人工培養(yǎng)的真菌能夠吸收外部RNA。不過，與植物和真菌間的RNA轉(zhuǎn)移一樣，它的機(jī)制仍然不明。

盡管跨界RNAi的機(jī)制不明，但實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)把它視為了重要的實(shí)驗(yàn)工具。僅僅用轉(zhuǎn)基因植物來控制病害組織的基因表達(dá)就為科學(xué)家找到了研究的新方向。哥本哈根大學(xué)研究免疫的漢斯·托德-克里斯坦森（Hans Thordal-Christensen）表示：他研究的真菌并不能直接進(jìn)行基因編輯，但是通過HIGS，他能夠順利操縱基因表達(dá)，特別是那些在病原體感染時(shí)會分泌的效應(yīng)基因?！斑@一方法使那些原來我們無能為力的研究成為可能?！?/p>

[資料來源：The Scientist][責(zé)任編輯：彥 隱]

寄生植物

菟絲子分布在全球許多地方，它從別的植物那里吸取營養(yǎng)：它用它無葉的、橘黃色的莖纏繞住宿主植物，深深嵌入，形成與宿主植物維管系統(tǒng)的直接接觸?！八瓷先ゾ拖褚粓F(tuán)纏繞著的線圈和組織網(wǎng)。”弗吉尼亞理工學(xué)院暨州立大學(xué)研究菟絲子的吉姆·韋斯特伍德（Jim Westwood）說。

韋斯特伍德發(fā)現(xiàn)菟絲子和宿主植物間的物質(zhì)傳遞就包括RNA的傳遞。十幾年前，韋斯特伍德捕獲了從番茄和南瓜植株傳遞到五角菟絲子的信使RNA并對它進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)包含了宿主植株基因組中的約20個(gè)基因。很快，加州大學(xué)戴維斯分校尼莉瑪·辛哈（Neelima Sinha）的小組也發(fā)現(xiàn)了一些從番茄植株傳遞到菟絲子的RNA片段，但完全理解這一機(jī)理仍然遙不可及。

隨著測序價(jià)格逐漸低廉，韋斯特伍德的團(tuán)隊(duì)在番茄和擬南芥植株上種植菟絲子進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。韋斯特伍德原先預(yù)料還有許多植株間轉(zhuǎn)移的mRNA沒有被早期工作所發(fā)現(xiàn)，也許這一次實(shí)驗(yàn)他就能發(fā)現(xiàn)幾百個(gè)。結(jié)果出來后，他說：“這不單單是幾百個(gè)的問題，這會是上千個(gè)。”

更令人驚訝的是，韋斯特伍德說，mRNA是雙向轉(zhuǎn)移的，它們也會從菟絲子轉(zhuǎn)移到宿主植株。他說：“這一現(xiàn)象表明了RNA的轉(zhuǎn)移比我們想象的要普遍得多?！钡沁@些轉(zhuǎn)移進(jìn)入的RNA序列信息對宿主植物、對寄生物與宿主的關(guān)系有什么影響仍是一個(gè)巨大的謎團(tuán)。他還補(bǔ)充道：“我們至今沒有任何證據(jù)能夠證明這些RNA對宿主與寄生物之間的交互有何影響?！?/p>

本文作者凱瑞·格林斯（Kerry Grens）是《科學(xué)家》雜志特約撰稿人，關(guān)注生命科學(xué)領(lǐng)域，斯坦福大學(xué)生物學(xué)碩士。